Este documento compara dos análisis proteómicos de aislamientos clínicos de Pseudomonas aeruginosa no mucoide y mucoide de un paciente con fibrosis quística. El análisis identificó 297 proteínas diferencialmente expresadas entre las cepas, incluyendo proteínas asociadas con la producción de alginato y el sistema de secreción tipo VI, que estaban más expresadas en la cepa mucoide. El análisis adicional por electroforesis en gel confirmó diferencias en el peso y carga de proteínas específicas entre las cep
La extracción del ADN constituye el primer y fundamental paso para cualquier tipo de estudio o propósito científico en el campo de la Biología Molecular, por lo que es de vital importancia tener una muestra de ADN de buena calidad. Para obtener un ADN de buena calidad, frecuentemente se requiere tener conocimiento de un buen método de aislamiento. En este estudio se realizó el método fenol cloroformo
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol(25:24:1) de SIGMA Labs., basado en el método de fenol-cloroformo, que se fundamenta en el uso de solventes orgánicos que por diferencia de densidades y por su capacidad para degradar proteínas permite la purificación de aislamiento de ADN
Las características de un organismo están especificadas en su información genética, la cual se establece como una secuencia de ácidos nucleicos, donde la suma total de esta secuencia es lo que conforma su genoma
Expresión in vitro de las interleucinas 2 y 10 de linfocitos de alpacas en pr...Raquel Watanabe
El objetivo del presente estudio fue determinar, mediante la técnica de RT-PCR Tiempo
Real y cuantificación relativa según el método 2-Ct, los niveles relativos de expresión
in vitro de ARN mensajero de IL-2 e IL-10 en leucocitos circulantes de alpacas en
presencia de antígenos clostridiales, empleándose como control endógeno a GAPDH. Se
colectó sangre entera de 10 alpacas adultas. Las muestras fueron centrifugadas para
obtener la fracción leucocitaria en gradiente de Ficoll, colectándose la capa flogística. Se
hizo un pool de leucocitos que fueron purificados con cloruro de amonio. Se centrifugó
y la concentración se ajustó a 500 000 células vivas/ml de medio mínimo esencial (MEM).
Fueron cultivados en placas para cultivo celular de 24 pocillos y enfrentados a suspensiones
de extracto clostridial a las concentraciones de 400, 16, 0.8 y 0.2 μg/ml por 1, 12 y
24 h. Posteriormente, se realizó la RT-qPCR. La cinética de la expresión de IL-2 mostró una
tendencia no significativa inversamente proporcional a la dosis de antígeno clostridial en
los tres tiempos de incubación, a diferencia de IL-10 cuya expresión fue variable, alcanzando
el máximo a las 12 h de incubación (p<0.05) y mostrando un patrón similar al de IL-
2 en la dosis de 16 μg/ml de antígeno clostridial. La expresión de IL-10 superó hasta en 40
veces lo expresado por el calibrador respecto a IL-2, evidenciándose una marcada respuesta
hacia la polarización del subtipo Th2.
Expresión in vitro de las interleucinas 2 y 10 de linfocitos de alpacas antíg...Raquel Watanabe
El objetivo del presente estudio fue determinar, mediante la técnica de RT-PCR Tiempo
Real y cuantificación relativa según el método 2-Ct, los niveles relativos de expresión
in vitro de ARN mensajero de IL-2 e IL-10 en leucocitos circulantes de alpacas en
presencia de antígenos clostridiales, empleándose como control endógeno a GAPDH. Se
colectó sangre entera de 10 alpacas adultas. Las muestras fueron centrifugadas para
obtener la fracción leucocitaria en gradiente de Ficoll, colectándose la capa flogística. Se
hizo un pool de leucocitos que fueron purificados con cloruro de amonio. Se centrifugó
y la concentración se ajustó a 500 000 células vivas/ml de medio mínimo esencial (MEM).
Fueron cultivados en placas para cultivo celular de 24 pocillos y enfrentados a suspensiones
de extracto clostridial a las concentraciones de 400, 16, 0.8 y 0.2 μg/ml por 1, 12 y
24 h. Posteriormente, se realizó la RT-qPCR. La cinética de la expresión de IL-2 mostró una
tendencia no significativa inversamente proporcional a la dosis de antígeno clostridial en
los tres tiempos de incubación, a diferencia de IL-10 cuya expresión fue variable, alcanzando
el máximo a las 12 h de incubación (p<0.05) y mostrando un patrón similar al de IL-
2 en la dosis de 16 μg/ml de antígeno clostridial. La expresión de IL-10 superó hasta en 40
veces lo expresado por el calibrador respecto a IL-2, evidenciándose una marcada respuesta
hacia la polarización del subtipo Th2.
Comparisons of two proteomic analyses of non-mucoid and mucoid Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from a cystic fibrosis patient
1. Texto adicional Texto adicional Texto adicional texto adicional Texto adicional texto adicional Comparisons of two proteomic analyses of non-mucoid and mucoid Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from a cystic fibrosis patient Jayasim haRao, F.Heath Damron, Marek Basler, Antonio Di Giandomenico, Nicholas E.Sherman, Jay W. Fox, John J. Mekalanos and Joanna B.Goldberg Iliana Vanessa Medellín Alfonso Esteban Jiménez Gaviria. Universidad Pontificia Bolivariana Facultad de Medicina 3th Semester
2. Introduction In this study used Strains 2192 (mucoid) Strains 383 (non-mucoid) were isolated from sputum days apart from the patient with CF FIGURE 1 Phenotypesof P.aeruginosa CF isolates383and2192on L agarmedia. Streaks ofstrains383and2192wereculturedonLagarfor 24 hat37˚C.Thesetwostrainswereisolatedwithin2daysapartfroma CF patient.Previousdataindicatedthesestrainsareisogenic(Hanna etal., 2000). Thegenomeofstrain2192hasbeensequenced1 (Mathee etal., 2008).
3. Strains 2192 (mucoid) Strains 383 (non-mucoid) Alginate Unbranched linear polymer of parcially acetylated β -mannuronic acid and it´s C5 epimer α -guluronic Introduction Synthesis: Begins: cytoplasm Ends: extracellular algD: alginate biosynthesis operon algC: encode enzymes required for synthesis of alginate
4. Factor MucA Biosynthetic are controlated by Production of alginate Degradation ineffective elimination of P.A in the CF lung conversion to the alginate mucoid, over expressing phenotype provides these bacteria additional protection from antibiotics and phagocytic killing Introduction
5. Introduction Variants of P.aeruginosa Establish as dominant pathogens in chronic lung diseases of CF patients. Contribute to the lung infection of CF patients. Alginate over production
13. CFTR Gene CFTR Encode the synthesis of a protein transports chloride across cells transports Cl- across cells Cl- H2o Filling of water and production of viscous mucus.
22. MATERIALES Y MÉTODOS Espectrometría de masas en tándem La espectrometría de masas es una técnica de análisis basada sobre la separación de acuerdo a sus razones masa/carga de las especies cargadas formadas a partir de la ionización de una muestra, los puntos individuales de proteinas se cortaron de los geles y fueron analizados utilizando el algoritmo SEQUEST de busqueda para encontrar Pseudomonas midiendo su peso (masa).
23. MATERIALES Y MÉTODOS DETERMINAR EL PESO DE LA PROTEINAS POR MEDIO DE ELECTROFORESIS UTILIZANDO ANTICUERPOS. Técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en muestras determinadas Se trata de analizar Pseudomonas aeruginosa el las cepas 383 y 2192 que crecieron en L-agar a 37ºC
27. Resultados FENOTIPO MUCOIDE Metabolismo para producción de alginato Este análisis proteomico indicó que la motilidad de Alginato regulador Z (Amrz), algF, algD y algC, fueron sobre reguladas en la cepa 2192 Amrz: cinta de union al ADN de helice-helice de proteínas que actúa como represor transcripcional algC: enzima que cataliza fosfomanomutasa, segundo paso en la via del alginato, la cual estaba en la cepa 2192 algD: precursor del acido polimanuronico algF: proteína que funciona al acetilar residuos del acido manurónico. Acetilacion de prop fisicas e inmunes del alginato.
28. Cuando P. aeruginosa produce en exceso el alginato No hay gran demanda en el metabolismo central para producir los intermediarios metabólicos y como combustible para la alta demanda de energía para la producción de Alginato Resultados
29. Resultados TssB1(PA0083) TssC1(PA0084) Hcp1 (PA0085) Tienen mayores niveles de expresion en no mucoide 383 que en la 2192 Canal por donde pasan macromoleculas Cepa 383 Tiene mayor expresión de la mayoría de los operón Se sobreregulan en no mucoide, derivados de las mucoides CF T6SS
30. Resultados Relación inversa entre el T6SS y el fenotipo mucoide de la P.Aeruginosa Usa para competir con otras bacterias y aumentar la amplitud de la P. Aeruginosa para la infección del pulmón de la CF. La adición de este fenotipo mucoide a este modelo presenta un cuadro por el que el no mucoide inicia la infección y el fenotipo mucoide surge, después de que la infección crónica puede ser establecida, negando de la necesidad de T6SS
31. Análisis 2 DE electroforesis Resultados Éste análisis da el tamaño y el pI de las proteínas aisladas 383 2192 Para visualizar diferencias entre las proteínas de cada cepa, éstas fueron separadas y se visualizaron manchas con expresión diferencial El tamaño previsto y el pl se compara con la de las secuencias de proteínas de larga duración
32. Resultados Indica las proteínas que son los mas abundantes en un lugar sin corazón No sugiere que una proteína se abundante, sino que identifica péptidos que pueden corresponder a proteínas de cualquier lugar en núcleo. PMM MS-MS
33. Resultados Reveló dos proteínas de la membrana externa OprH OprF Fuerón expresadas diferencialmente entre las cepas 383 y 2192 OprH Mas abundante en la cepa mucoide 2192
34. Resultados Un punto diferencial de proteínas teñidas entre las cepas 2192-383 es una proteína conservada (PA0460) PA0460 Es 5 veces sobreregulada cuando sensor elimina la cepa PAO1 PA0315 Proteína conservadora en la 2192 PA0315 en la cepa 2192
35. T A M A Ñ o Carga Pr- Bacterianas de Pseudomonas aeruginosa
36.
37.
38. Discussion AUTHOR WHAT HE /SHE SAID AGREE DESAGREE Winsor Bioinformatics analysis of the 297 proteins recognized from iTRAQ analysis allowed funtional classifications as defined by the Pseudomonas genome database X Guina Of the quantified 297,81 proteins showed significant p values in either one or both iTRAQ replicates. In comparison with earlier studies of other P.aeruginosa strains. X
Algoritmo: Secuencia de pasos ordenados para generar un resultado. Algoritmo de Busqueda SEQUEST: algoritmo encargado de buscar los pesos de las proteinas para identificarlas en tipo y cantidades dentro de una muestra especifica.
Técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en muestras determinadas, en este caso se trata de analizar Pseudomonas aeruginosa el las cepas 383 y 2192 que crecieron en L-agar a 37ºC, fueron suspendidas en L-broth. luego fue medida a una densidad óptica de 600, para después ser diluidas 1:1 con L-broth luego 5ml fueron centrifugados a 100rpm a 37ºC por 3 horas, se mantuvo un registro del crecimiento de cepas no mucoides y mucoides, las suspensiones celulares fueron comparadas y se diluyeron en 2 x laemmli buffer, luego las muestras fueron congeladas a una temperatura de -80ºC hasta separarse un 12% de poycrylamide (SDS PAGE), luego se transfiere 0.2µl de nitrocellulose. finalmente se realizo un bloqueo y una exploración de la membrana con un 5% de leche desnatada en fosfato salino (buffer), los anticuerpos policlonales, monoclonales y de plan regional de acción se diluyeron. Fue usado un anticuerpo RPO A Anticuerpos con peroxidasas se diluyeron y se utilizaron unos sustratos avanzados de quimioluminisencia