Este estudio examinó los cambios en la composición proteica de los microdominios de las membranas sinápticas (balsas lipídicas) en cerebros de ratas jóvenes y viejas utilizando electroforesis en gel de fluorescencia diferencial. Se encontró que las proteínas relacionadas con la fosforilación oxidativa y el metabolismo mitocondrial disminuyen con la edad, mientras que la proteína GFAP aumenta. Esto sugiere que los cambios en las balsas lipídicas sinápticas con la edad están relacion

1. MOLECULAR BIOLOGY "Age-associated changes in synaptic lipid raft proteins revealed bytwo-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis"Natalia V. Gogichaeva Cristina Alvarado Velásquez Catalina Baena Gómez Medicine students Universidad Pontificia Bolivariana-2011

2. INTRODUCTION Gel electrophoresisistheprocess in wichmolecules (such as proteins, DNA , or RNA fragments) can beseparatedacordingtosize and electricalchargebyapplynganelectriccorrenttothem. The gel can bemade so thatsizes and shapes. Smallerfragmentsusuallytravelfortherthanlargeones. Specializedmicrodomainsenriched in cholesterol, sphingolipids, and signalingproteins. Thesemicrodomainsappeartoserve as local organizingsitesforthecoordination of numeroussignalingeventsbybringingreceptors, efectors and downstreamsignalingproteinsintocloseproximity and promotinginteractions.

3. Reactive oxygen species (ROS) or free radicals are chemical species that have a single unpaired electron in an outer orbit. They are highly reactive chemical radicals that are generated as products of oxygen degradation. Parkinson's disease is one of a larger group of neurological conditions called motor system disorders. In the normal brain, some nerve cells produce the chemical dopamine, which transmits signals within the brain to produce smooth movement of muscles. In Parkinson's patients, 80 percent or more of these dopamine-producing cells are damaged, dead, or otherwise degenerated. This causes the nerve cells to fire wildly, leaving patients unable to control their movements. Alzheimer's disease is named after a German physician, Dr. Alois Alzheimer. This doctor discovered changes in a deceased mental patient's brain tissue-- abnormal "clumps", today called amyloid plaques, and tangled "bundles of fibers", or neurofibrillary tangles. More recent brain change discoveries with Alzheimer's disease include the death of nerve cells that control memory and areas of thinking. Also, chemicals that carry messages back and forth appear to be at lower levels in the brains of people with Alzheimer's.

4. Thesynapticlocalization of proteinsthataffect neuronal plasticity and cognition “theglutamatereceptors” isdeterminedbythepositioning of lipidraftdomains at synapses. Agedbrains and patientswithparkinson´s and alzheimerdissease show changes in theproteincomposition of thesemicrodomains and theexpression of ROS. A proteomicanalysisusingtwo dimensional fluorencediference gel electrophoresiscould show age-relatedchanges in thesynapticlipidraftcomposition.

5. Thisstudywasundertakento determine if a proteomicanalysisrevealedanyconsistentdifferences in expression of proteins in lipidraftsisolatedfromsynaptic plasma membrans (SPMs) of youngvs.agedratbrains. GOAL OF THE STUDY

6. MATERIALES Y METODOS

7. ANIIMALES 8 pares de ratas de 5 y 38 meses de edad. Fisher 344/Brown (híbridos de noruega).

8. AISLAMIENTO DE SPMs, MITOCONDRIA Y BALSAS LIPIDICAS DE CEREBROS DE RATA S JOVENES Y VIEJAS. Remoción de los cerebros de ratas decapitadas, seguido de homogenización y procesamiento de los mismos, para la extracción de sinaptosomas y mitocondrias a través de centrifugación. Los sinaptosomas se lisaron y se centrifugaron para extraer las SPMs, de donde se extrajeron 8 pares de balsas lipídicas usando gradiente de centrifugación. Sinaptosoma: Terminal nervioso pre- sináptico que se ha extraído del resto de la neurona.

9. ANÁLISIS DE COLESTEROL El colesterol fue medido usando el kit “Amplex red cholesterol”. Este kit proporciona un método sencillo para cuantificar el colesterol mediante un lector de microplacas e fluorescencia. El colesterol se detecta a 200 nm usando 10-acetil-3,7-dihidroxifenoxamina.

10. INMUNOBLOT Cy- Dye DIGE Separación de proteínas mediante electroforesis. Las proteinas fueron separadas por SPS-PAGE y transferidas a membranas PVDF (polivinildenedifloride). Los inmunoblot fueron desarrollados usando el sustrato 5 Bromo- 4 cloro- 3 indoil P y fueron examinados por análisis densitométrico. Es un método basado en cianinas, que son tintes fluorescentes que cubren todo el espectro de infrarojos hasta los UV. Aumentan el rango de longitudes de onda. Se utilizó para etiquetar las proteínas extraídas de las membranas plasmáticas. SPS-PAGE: (electroforésis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico, que permite separar las prot. de acuerdo a su movilidad electroforética: DIFERENCIA DE PESO, LONGITUD DE CADENA Y FORMA, PUNTO ISOELECTRICO)

11. ESPECTROFOTOMETRIA DE MASAS Se utilizó para identificar los puntos en que difieren significativamente las proteínas de membrana sináptica de cerebros viejos y jóvenes en los geles analíticos. La espectrofotometría de masas es una técnica que permite la medición de iones derivados de moléculas. Se utiliza para identificar los diferentes elementos químicos que forman un compuesto, o para determinar el contenido isotópico de diferentes elementos en un mismo compuesto. Isotopos: átomos de un mismo elemento cuyos núcleos poseen una cantidad diferente de neutrones y por ende difieren en su masa.

12. RESULTADOS La comparación entre la distribución de proteínas totales y las balsas lipídicas no mostró diferencias significativas entre las preparaciones aisladas de cerebros viejos y jóvenes. Esto indica que el contenido de proteína total de las balsas lipídicas no se modificó con aumento de la edad.

13. RESULTADOS Blot de un cerebro joven Marcador de balsa lipídica Marcadores de proteínas de balsa Proteína que se distribuye en las regiones no balsa La densidad de lasfracciones de marcadorespresentes en lasmuestrasestánevidenciadas en el gradiente. Las muestras 2, 3 y 4 son de bajadensidad y evidencian la presencia de Thy-1 y FLT-1, por lo que se consideranlasmasricas en balsas lipidicas (siendo la 3 la masrepresentativa). Las muestras 5, 6, 7 y 8 son de altadensidad, en ella se encuentró la proteína ATP-asa. Las muestras 3 y 4 evidencian el mayor contenido de colesterolpor mg de proteina (marcador GM1)

14. RESULTADOS La identificación e las proteínas se llevó a cabo mediante la técnica MALDI-TOF (es un acoplamiento entre la técnica MALDI (técnica de ionización por matriz) y la espectrometría de masa) La mezcla de cianina 3 y 5 con regiones de balsa de cerebros jóvenes y viejos respectivamente, se separó mediante electroforesis. Con esto se demostró que la proteína IMMT decrece con la edad, y que la proteína GFAP aumenta con la edad . Las diferencias en las proteínas de las balsas de la membrana sináptica de cerebros jóvenes y viejos se investigó usando 2D-DIGE y análisis de geles.

15. RESULTADOS Imagen ampliada que muestra como la proteína interna de la membrana mitocondrial (IMMT) decrece con la edad, mientras que la proteína acida fibrilosa glial (GFAP) incrementa con la edad.

16. Casi la mitad de las proteínas identificadas en las balsas de membrana plasmática sináptica que reducen con la edad están asociadas conla bioenergética y la homeostasis metabólica. De ellas, 15 pertenecen a la fosforilación oxidativa y complejos asociados a las mitocondrias, así: 7 son componentes del complejo I (NADH deshidrogenasa), 2 hacen parte del complejo II (succinato deshidrogenasa), 3 son del complejo III(citocromo c oxidorreductasa), y 3 pertenecen al complejo V (ATP sintasa).

17. RESULTADOS Muchas de las proteínas que se cree que están localizadas en las mitocondrias se encontraron en las balsas lipídicas. Se buscaron fragmentos de membrana mitocondrial en las balsas a través de marcadores mitocondriales . Los niveles hallados fueron bajos, y no hubo diferencias entre lo encontrado en cerebros viejos y jóvenes.

18. RESULTADOS

19. RESULTADOS El nivel de proteína del marcador FLT-1indicó que no hay cambios relacionados con la edad en los niveles de esta proteína. Los análisisdensitométricosmostraroncambiossignificativos en los niveles de lasproteínasrelacionadas con los marcadores: NDUFS3 (asociado a la Ubiquinona), ATPB (asociado a la ATPasa), VDAC1 (asocado a proteina de canal), IMMT and GFAP .

20. RESULTADOS INMUNOBLOT ANÁLISIS DENSITOMÉTRICO Disminuyen con la edad Aumenta con la edad No varía

21. RESULTADOS Las proteínas asociadas a las balsas que parecen cambiar con el aumento de edad están implicadas directamente en la homeostasis de oxido reducción y el y el metabolismo energético. Se observan cambios pequeños en las proteínas responsables de la estructura celular que puedan participar en la sinapsis y la neurotransmisión.

22. DISCUSSION

23. CONCLUSION

24. Catalina Baena

25. Cristina Alvarado

26. THANKS