El documento describe el pez cebra como un modelo para el estudio del desarrollo embrionario. Explica que el pez cebra tiene un desarrollo embrionario rápido y transparente, lo que lo hace adecuado para estudiar los mecanismos del desarrollo a nivel estructural, fisiológico, genético y molecular. También describe los requisitos para mantener peces adultos y realizar cruces y obtención de huevos fecundados para su estudio.
1. DESARROLLO TEMPRANO DEL PEZ CEBRA
El Pez cebra como modelo para el estudio del desarrollo. El embrión del pez cebra
combina una cantidad importante de rasgos biológicos que lo han convertido en un
modelo muy adecuado para el estudio de los mecanismos que regulan el desarrollo a
través de enfoques estructurales, fisiológicos, genéticos y moleculares. George
Streisinger, de la Universidad de Oregon, fue el primer investigador en utilizar el
embrión del pez cebra como modelo para el estudio del desarrollo utilizando un
enfoque genético. Su primer trabajo sobre la materia (1981) fue pionero en lograr el
establecimiento de líneas homozigotas y la descripción del primer mutante. El
embrión del pez cebra es transparente y su desarrollo embrionario muy rápido. Es
fácil de mantener y reproducir y los adultos pueden ser exitosamente mutagenizados
con N-etil-N-nitrosourea . La fecundación es externa y cada postura incluye embriones
cuyo desarrollo es razonablemente sincrónico. Cada hembra puede poner alrededor
de 100 huevos relativamente grandes (0,7 µm). Estos y los embriones pueden ser
objeto de variadas manipulaciones experimentales tales como microinyección y
transplantes. A las 24 horas post fecundación (pf) ya es posible distinguir los
principales rasgos corporales característicos de los vertebrados como el tubo neural,
los ojos y somitos. La larva empieza a alimentarse alrededor de los 6-7 días pf y a los 3
meses pf el pez ha alcanzado la madurez sexual y comienza su reproducción.
Mantención de adultos. Los investigadores que utilizan el pez cebra cuentan con
bioterios donde se pueden mantener decenas, cientos o miles de estanques con agua
purificada y aireada en circulación permanente, Cada acuario debe contener alrededor
de 2 peces por litro de agua. Para mantener agua en la condiciones señaladas se debe
contar con series de filtros para remover sedimentos, sales, bacterias, y en especial
hipoclorito, que es muy nocivo para los peces. Además hay que remover del agua
circulante fecas, amoníaco, restos de alimento y microorganismos nocivos mediante
limpieza diaria y exposición del agua a radiación ultravioleta. El pH debe mantenerse
alrededor de 7 y la conductividad en aproximadamente 500 µS. Los peces que
mueren por la edad u otras razones deben removerse en forma inmediata. El agua
debe mantenerse a una temperatura de alrededor de 28° C (rango 24-32° C. Schirone
and Gross, 1968). Por último, se debe mantener un ritmo diario de 14 h de luz/10 h
de oscuridad. Los animales son alimentados con una doble dieta: por la mañana
alimento seco, como las hojuelas del popular TetraAmin, y por la tarde alimento vivo,
como es el caso de quistes del crustaceo Artemia salina cultivados por 24 h en
solución salina para Artemia. Este último alimento vivo mejora la efectividad de las
posturas. Hay que evitar que los peces engorden en demasía porque esto perjudica su
reproducción. El pez cebra es una mascota que puede también mantenerse en forma
artesanal con los sistemas suministrados por el comercio especializado de acuarios y
accesorios. Los mismos cuidados aplicados en los bioterios deben implementarse en
los sistemas artesanales, que usualmente no tienen agua en circulación. Por tanto, es
este caso es recomendable cuidar de la densidad de peces por volumen de agua y
reemplazar ésta al menos semanalmente. Los peces pueden sobrevivir hasta 10 días
2. sin alimentación y cambio de agua. Por supuesto que bajo estas condiciones su
reproducción es fuertemente afectada. Utilizar tanques de 20-50 litros y cuando el pH
está bajo subirlo con bicarbonato de sodio. Para la iluminación se puede utilizar una
lámpara de bajo wataje y un timer casero y para mantener la temperatura más o
menos constante un calentador con termostato. Si el acuario está en un lugar que se
usa también para otros propósitos, este puede cubrirse con una caja de cartón o paño
negro. Esto permitirá mantener el ritmo luz/oscuridad.
Cruce y postura. El día antes de colectar los huevos, los peces machos y hembras
deben mantenerse en contenedores separados. Los machos se reconocen por ser más
delgados y amarillentos, mientras las hembras grávidas tienen el vientre abultado y
son plateadas. Luego de que se haya encendido la luz la mañana siguiente, colocar dos
hembras y un macho en una cámara de apareamiento diseñada para evitar que los
progenitores se coman los huevos. Simultáneamente se pueden preparar otros cruces
para obtener más huevos. La cámara de apareamiento (cámara nupcial) se puede
preparar colocando una capa de bolitas de vidrio en el fondo de una caja de plástico
transparente que contiene los peces o sobreponiendo dos cajas de plástico
transparente de distinto tamaño, la más pequeña de las cuales contiene los peces y
tiene como base una malla metálica con orificios de aproximadamente 2mm. En el
primer caso los huevos fecundados se extraen de entre las bolitas con un sifón,
mientras que en el segundo caso los huevos atravesarán la malla metálica y se
recogerán separando los dos compartimientos de la caja de apareamiento. Los huevos,
colectados con un colador de te, se lavan con una pizeta que contiene agua
acondicionada filtrada del sistema (agua de los acuarios) y se transfieren a placas de
Petri de vidrio o plástico conteniendo agua acondicionada filtrada con miliporo o
medio E3. Se puede realizar fecundación in vitro colectando espermatozoides y
ovocitos de ejemplares anestesiados. Para esto se masajea suavemente con un dedo el
vientre de machos o hembras en la dirección anterior-posterior, con el pez “boca
abajo”. Colectar separadamente los gametos y después reunirlos en agua
acondicionada o medio E3. La fecundación in vitro asegura el desarrollo más
sincrónico de los embriones.
Anestesia. Para obtener gametos, extraer las gonadas o ejecutar operaciones como la
amputación de la aleta caudal (que regenera), los adultos son anestesiados por unos
minutos en Tricaína (etil 3 -aminobenzoato metanosulfonato), hasta que cesen sus
movimientos.
Preparación y observación del material embrionario. Se requiere de un
microscopio de disección o lupa que permita aumentos de hasta al menos 40X , con
una platina que combine el color blanco de una de sus superficies con el negro de la
otra. Las observaciones pueden ser in vivo o postfijación. Para esto último los
embriones se fijan en Formaldehído/ácido acético por un tiempo corto. El material
fijado puede lavarse con agua destilada o PBS 1X , descorionarse y teñirse con un
colorante básico. Los embriones se descorionan con pinzas de relojero o en pronasa
(0.5 mg/ml de agua acondicionada). Para orientar la posición de los embriones
descorionados estos se pueden montar en un medio viscoso como la metil celulosa.
3. .
Ovogénesis. Es el proceso mediante el cual se generan células competentes para ser
fecundadas. En el pez cebra corresponden a ovocitos V que completan la meiosis como
resultado de la penetración del espermatozoide. En ese momento se genera el zigoto.
Durante la ovogénesis ocurren tres procesos fundamentales: (1) reducción
cromosómica, (2) recombinación genética entre cromosomas homólogos y (3) intensa
transcripción. A estos procesos se agrega el ensamblaje de glóbulos de vitelo y
gránulos corticales, la proliferación de organelos y la elaboración del corion y la
micropila, estructura a lo largo de la cual penetran los espermatozoides. La actividad
transcriptiva es de la mayor importancia para el desarrollo porque los transcriptos
maternos acumulados en el ovocito regulan no solo el desarrollo del propio ovocito
sino también la activación del huevo y la embriogénesis temprana (Pelegri, 2003;
Lindeman and Pelegri, 2010; Dosch, 2014). La hembra tiene un par de ovarios
suspendidos de la cavidad del cuerpo por un vascularizado mesovario y se comunican
al exterior por cortos gonoductos. El ovario de animales maduros ocupa un volumen
importante de la cavidad pleuroperitoneal, 10-20% del peso de la hembra cuando
está grávida. Selman et al. (1993) reconocen 5 estadios en el desarrollo del ovocito.
(a) Ovocitos del estado I (estado de crecimiento primario) son transparentes,
tienen un voluminoso núcleo central (vesícula germinal) y miden de 7-140 micrones
de diámetro. Los ovocitos más pequeños o prefoliculares (estado IA) están en el
leptotene de la primera división meiótica mientras los más voluminosos, o foliculares
(estado 1B), han entrado al diplotene de la primera división meiótica y están
claramente rodeados por una capa epitelial plana de células foliculares. Algunos o
numerosos nucleólos están presentes en los ovocitos , muchos cercanos a la envoltura
nuclear.
(b) Ovocitos del estado II (estado alveolar cortical) son transparentes y miden
de 140-340 micrones de diámetro. Su núcleo es central y está detenido en la profase
de la meiosis I. El citoplasma de aspecto espumoso se debe al comienzo de las
formación de los gránulos corticales.
(c) Ovocitos del estado III (estado de vitelogénesis) empiezan a opacarse
como resultado del depósito de glóbulos de vitelo que desplazan los nacientes
gránulos corticales hacia la periferia celular. Miden de 340- 690 micrones y su núcleo
empieza a moverse hacia la periferia manteniéndose en la primera división meiótica.
(d) Ovocitos del estado IV (estado de maduración) son muy opacos como
resultado de la acumulación de gran cantidad de vitelo. La ruptura de la vesícula
germinal marca la conclusión de la primera división meiótica y el inicio de las
segunda, El ovocito se detiene en la metafase II.
4. (e) Ovocitos del estado V (estado de huevo) son transparentes y miden 0,73-
0,75 micrones de diámetro y la meiosis continua detenida en la metafase II. Son
aplanados y flotan en la cavidad del ovario. El ovocito V ya ha iniciado el proceso de
segregación ovoplásmica mediante el cual lagunas de citoplasma ricas en organelos,
citoesqueleto y determinantes maternos que han empezado a acumularse en el
casquete animal del ovocito para formar el naciente blastodisco o preblastodisco
(Fernández et al., 2006). Este dará finalmente origen al embrión.
Características generales del desarrollo. En verdad el desarrollo se inicia en el
ovario y continúa en una serie de procesos que se han ordenado en estados. La tabla I,
elaborada por Kimmel et al. (1995), resume las características de tales estados
basado en rasgos morfológicos de embriones vivos obtenidos de la misma madre que
se han fecundado in vitro, situación que mejora la sincronía de su desarrollo
(consultar también el “Zebrafish Book” en la dirección http:/zfish.uoregon.edu o el
libro Zebrafish editado por Nüsslein Volhard and Dahm, 2002). La descripción del
desarrollo basada en estados es más significativa que la basada en edad. La velocidad
de desarrollo aumenta o disminuye según la temperatura. Sin embargo, el desarrollo
normal ocurre dentro de un rango de temperatura ya indicado. Con frecuencia se
habla de desarrollo temprano y tardío. El primero se extiende hasta el comienzo de la
gastrulación mientras el segundo hasta que se haya completado la organogénesis y la
especificación de los ejes corporales. En el pez cebra y otros organismos se agrega un
largo período larvario que culmina con la formación de un juvenil cuya maduración
sexual se alcanza a los 3 meses pf. Una completa descripción de la anatomía de la larva
en desarrollo se encuentra en Salgado y al. (2012).
Fecundación y activación. La fecundación puede ocurrir en forma natural o
ejecutarse in vitro. Comienza cuando un espermatozoide penetra por la micropila y su
membrana se fusiona con la del ovocito, fenómeno que ocurre 20-60 segundos
después que los gametos son descargados o combinados. En contacto con el agua
ambos gametos son activados. Por eso, al obtener los gametos por masaje abdominal
hay que prevenir que tomen contacto con el agua. Esto se logra removiendo los
espermatozoides con una micropipeta. Los ovocitos que fueron activados por el agua
no podrán fecundarse después porque han formado la envoltura vitelina, o corion, que
previene la penetración de espermatozoides. Los espermatozoides permanecen
activos por aproximadamente 1 minuto. La activación del ovocito tiene varias
manifestaciones como cambios en el potencial de membrana, explosivo aumento de
calcio libre dentro del huevo, terminación de la meiosis con expulsión del polocito II,
exocitosis de los gránulos corticales y levantamiento de la envoltura vitelina que
forma la “membrana de fecundación” o corión. Cambios en el pH del zigoto, aumento
del consumo de oxígeno, síntesis de proteínas y DNA y movimientos citoplasmáticos,
también toman lugar (ver Gilbert, 2013). Muchos de estos fenómenos también
ocurren en el ovocito no fecundado activado en contacto con el agua.
Desarrollo del zigoto y movimientos citoplasmáticos (segregación
ovoplásmica). Una vez que el huevo completa la meiosis, aproximadamente a los 10
min pf, pasa a llamarse zigoto y consiste de un citoplasma rico en vitelo, o
5. viteloplasma, y un citoplasma rico en organelos, citoesqueleto y RNAm de origen
materno, llamado ovoplasma. El ovoplasma se distribuye en tres dominios
citoplasmáticos: blastodisco, endoplasma y ectoplasma. El endoplasma forma una red
de numerosas lagunas de bordes irregulares que se conectan con el blastodisco
mediante cortos canales (“short axial streamers”), mientras el ectoplasma rodea el
zigoto y también se conecta con el blastodisco. A medida que transcurre la primera
interfase el ovoplasma fluye lentamente desde las lagunas de endoplasma y del
ectoplasma hacia el polo animal, con lo cual el blastodisco crece discretamente en la
región animal del zigoto. Mientras tanto, los pronúcleos se acercan y forman el nucleo
del zigoto. Este inicia la mitosis aproximadamente a los 30 min pf, cuando se produce
la contracción de un anillo de actina ensamblado en el reborde del blastodisco. Este
fenómeno se acompaña de un flujo rápido de ovoplasma hacia el polo animal, proceso
que se manifiesta por la formación de numerosos y voluminosos canales llamados
“streamers”, que por su trayectoria y relaciones con el blastodisco pueden ser axiales
o meridionales. El blastodisco crece rápidamente y cuando el anillo de contracción
empieza a relajarse se inicia la formación del primer surco de citoquinesis que da
origen a los dos primeros blastómeros. Por lo tanto, parte de la primera mitosis ocurre
durante la etapa de flujo rápido de ovoplasma. La formación de canales axiales y
meridionales menos robustos se repite en las siguientes divisiones de clivaje, junto
con la formación de anillos de contracción más débiles. Ambos procesos son
generalmente indetectables a partir de los 8-16 blastómeros . A estas alturas la
mayoría de las lagunas de endoplasma han desaparecido y en su lugar los glóbulos de
vitelo se acercan entre si y forman la bola de vitelo, que en la larva constituirá el saco
vitelino. La segregación de citoplasma se puede seguir en embriones vivos observados
en la lupa o el microscopio, instrumentos que generalmente están conectados con
una cámara de video y un computador premunido de un programa capaz de invertir el
contraste entre ovoplasma y viteloplasma. Esto también se logra observando
embriones, colectados a distinto tiempo, que han sido sometidos a una fijación ácida
(Fernández et al, 2006; Fuentes and Fernández, 2010).
Divisiones de clivaje. Las 5 primeras divisiones de clivaje son meridionales, tienen
una orientación regular y ocurren desde el centro al borde del blastodisco. Cada
división es ortogonal a la precedente de manera que el blastodisco es sucesivamente
parcelado en hileras de células. Primero una hilera de dos células, segundo dos hileras
de dos células, tercero 2 hileras de 4 células, cuarto 4 hileras de 4 células y quinto 4
hileras de 8 células Al final del estado de 16 células hay 4 centrales y 12 marginales,
que permanecen conectadas con la bola de vitelo. La sexta división de clivaje es
ecuatorial y genera una capa superficial y otra profunda. De aquí hasta la transición de
la blástula intermedia la mayoría de las células no marginales clivan completamente,
persistiendo divisiones incompletas en las células marginales. A 28,5º C las divisiones
de clivaje ocurren cada 15-20 min de acuerdo a la siguiente secuencia temporal:
2 células: 45-50 min pf
4 células: 1:00-1:05 h pf
8 células: 1:15-1:20 h pf
16 células: 1:30-1:35 h pf
7. PROTOCOLO 1
DESARROLLO TEMPRANO DEL PEZ CEBRA
Para la ejecución de este y otros protocolos del pez cebra se le suministrará
tablas del desarrollo, diagramas y fotografías que facilitarán las observaciones
programadas .
OVOGENESIS
1.- Elija hembras grávidas, anestésielas y colóquelas sobre un porta objetos.
Haga una escisión ventral y remueva los ovarios que aparecen repletos de ovocitos.
Transfiera los ovarios a una cápsula de Petri con solución salina o agua acondicionada.
Esta última no es una solución fisiológica adecuada pero mantiene razonablemente
bien la estructura de los ovocitos para su observación inmediata y fijación.
2.- Observando a bajo aumento descubrirá que cada ovario esta formado de
acúmulos o quistes de ovocitos cada uno de los cuales es posiblemente el clon de una
célula madre. Cada quiste tiene ovocitos de distinto tamaño que están en diferentes
estados de la ovogénesis. A mayor aumento podrá distinguir ovocitos de los estados
1-4 del desarrollo.
3.- Fije un trozo de ovario con formaldehído/ácido acético por al menos 30
min, lave por el mismo tiempo en varios cambios de PBS 1X o agua destilada y tiña por
unos minutos con azul de toluidina (colorante básico) en borato de sodio. Lave de
nuevo con PBS para remover el exceso de colorante. Monte el trozo de ovario con PBS
entre un porta y cubre objetos, este último con topes de plasticina en sus cuatro
ángulos. Visualize lo siguiente:
(a) Ovocito I. Su citoplasma aparece intensamente teñido de color azul
(basofilia debida a la acumulación de ribonucleoproteínas). El núcleo central de estos
ovocitos presenta uno o más acúmulos de material basófilo en la periferia del núcleo
que corresponden a núcleolos.
(b) Ovocito II. La basofilia del citoplasma es reemplazada por la
aparición de un citoplasma de aspecto esponjoso debido a la acumulación de alveólos
precursores de los gránulos corticales. La silueta del núcleo de posición central es
todavía detectable
8. (c) Ovocito III y IV. El citoplasma empieza a oscurecerse debido al
depósito gradual de glóbulos de vitelo. La diferencia entre uno y otro ovocito se puede
determinar por el tamaño de la célula.
(d) Ovocito V. Se puede obtener del liquido que se acumula en el centro
del ovario de una hembra grávida pronto después que la luz se ha encendido. Es una
célula aplanada y frágil que se hincha en presencia de agua y se activa. Se puede fijar
en formaldehído/ácido acético y así visualizar la distribución temprana del
ovoplasma.
FECUNDACION
Tan pronto detecte que el apareamiento de machos y hembras fue exitoso,
remueva y lave los huevos para luego transferirlos a una cápsula de Petri con agua
acondicionada. Observe la formación del corion y de la cámara perivitelina. Con
suerte podrá visualizar la micropila, que une la superficie del huevo con el corión, y
una pequeña célula adherida al zigoto o flotando en el líquido perivitelino y que
corresponde al polocito 2. Tanto huevos fecundados como no fecundados, en contacto
con el agua, forman el corion y habrá que esperar la división de su blastodisco para
determinar si fue o no fecundado La estructura de los gametos no activados podrá
estudiarse en montajes de ovocitos V extraídos directamente del abdomen de una
hembra grávida y de espermatozoides extraídos directamente del abdomen de
machos. La observación deberá hacerse a aumentos altos de la lupa o mejor en un
microscopio.
SEGREGACION OVOPLASMICA Y PRIMER CICLO CELULAR
Desde el momento de la fecundación hasta la terminación del primer ciclo celular
Ud. podrá combinar la observacion de zigotos vivos con aquellos fijados cada 5-10
min mediante formaldehido/ ácido acético. La posición del zigoto vivo puede ajustarse
montándolos en metil celulosa y orientando su posición con un mondadientes. La
observaciones deben dirigirse a la visualización de los siguientes procesos:
(1) Etapa de crecimiento gradual del blastodisco en la región animal del
zigoto durante la primera interfase. Asegúrese que la temperatura se mantiene
alrededor de los 28,5° C.
(2) Gradual desaparecimiento de las lagunas de endoplasma
(3) Contracción del anillo de actina en el reborde del blastodisco
(4) Formación de canales o “streamers” axiales y meridionales. Estos últimos
se visualizan mejor en huevos fijados y montados en forma oblicua.
(5) Relajación del anillo de actina, desaparición de los canales, y aparición del
primer surco de división del blastodisco. Con esto se completa el primer ciclo celular a
los 30-40 min pf.
CLIVAJE
9. Este proceso será estudiado tanto en huevos vivos como fijados, estos últimos
procesados hacia el final de cada ciclo celular. Con un mondadientes podrá orientar la
posición de los embriones que mejor muestre el progreso del proceso de clivaje.
(1) Visualize la dirección en la cual avanza el surco de clivaje de cada
división del blastodisco.
(2) Corrobore la regularidad de las divisiones celulares 1-5 y los planos en
que ocurre este fenómeno.
(3) Verifique como la mayor parte del endoplasma ha sido trasladado al
blastodisco
(4) Identifique embriones de 64-1.000 células, que no podrá contar, pero si
comparar con la imágenes de la tabla de desarrollo que se le suministrará. En los
embriones más avanzados podrá identificar las células sincisiales del vitelo por fuera
del reborde del blastodermo
BLASTULACION
Este proceso en verdad se inicia más temprano en el desarrollo pero es a partir de
1kg de células cuando aparecen cambios sistemáticos en la forma del blastodermo
que dan origen a los distintos tipos de blástula. Reconozca:
(1) La blástula alta que presenta un promontorio de blastómeros que se
agudiza hacia el polo animal del embrión.
(2) La blástula oblonga que presenta un aplanamiento del blastodermo
sobre la bola de vitelo. La capa sincisial del vitelo aparece formada por varias capas
concéntricas. de núcleos celulares.
(3) La blástula esfera tiene, como dice su nombre, forma esférica y el límite
entre el blastodermo y la bola de vitelo es una horizontal. Los núcleos de la capa
envolvente del vitelo sufren las últimas divisiones.
(4) La blástula cúpula sufre un desplazamiento de la bola de vitelo hacia el
polo animal mientras el blastodermo se aplana como resultado del inicio de su
desplazamiento, o epibolía, hacia el polo vegetal. Los núcleos de la capa envolvente del
vitelo pueden ser fácilmente visualizados.
La epibolía del blastodermo a lo largo de la bola vitelo se hace a expensas de un
progresivo adelgazamiento del blastodermo que cuando alcanza el ecuador del
embrión (50% de epibolía) da inicio al proceso de gastrulación.
MUTANTES QUE AFECTAN EL DESARROLLO EMBRIONARIO TEMPRANO
La observación de mutantes de efecto materno brinda la oportunidad de visualizar
fenotipos en los que se han alterado procesos tempranos del desarrollo como la
gametogénesis, fecundación y activación, segregación ovoplásmica, clivaje y
blastulación. Muchos de los mutantes mueren en las primeras horas de desarrollo
mientras otros forman gástrulas y larvas anormales que no completan el desarrollo. El
mutante emulsion/cax1 tiene alterada la estructura de una proteína que funciona
como un intercambiador de Ca+2/H+. (Fuentes et al., 2014 ). Las alteraciones más
conspicuas de este mutante tienen que ver con el retardo de los movimientos
11. METODOS
Fijación ácida: Preparar formaldehído al 5% fresco a partir de la solución stock al
37%, que debe considerarse como si fuese al 100%. Pipetear en la solución fijadora
10-15 embriones y acto seguido agregar 5 gotas de acético acético glacial. Tapar la
cápsula y agitar rotatoriamente hasta que los embriones se tornan blanquizcos. Fijar
por 30-120 min.. El formaldehído y ácido acético son muy tóxicos y por tanto cuando
se utilizan para la fijación de material biológico debe contarse con una buena
ventilación.
Tinción con azul de Toluidina. Preparar una solución al 0,001% de Azul de
Toluidina en PBS 1X. Partir preparando una solución stock de azul de toluidina al 1%
en borato de sodio al 1%. Tomar 15 µl de la solución stock y diluir en 10 ml de PBS 1X.
Teñir los ovarios o embriones en una gota depositada sobre un portaobjetos. Después
de unos minutos de tinción remover el exceso del colorante mediante lavados con PBS
1X. Montar un trozo pequeño del ovario o algunos embriones entre porta y cubre
objetos con topes de plasticina.
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sobre otros aspectos del desarrollo de peces.
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