Este documento describe un proyecto de investigación para reinocular caña de azúcar con bacterias fijadoras de nitrógeno endofíticas después de tratar la caña con calor para eliminar patógenos. El objetivo es restaurar los beneficios de las bacterias fijadoras de nitrógeno Azospirillum brasilense y Gluconacetobacter diazotrophicus mediante la reinoculación de las raíces de caña tratada con calor con cepas de estas bacterias. El proyecto evaluará si esta técnica acelera la recoloniz

1. Proyecto para optar el titulo de Lic. en Biotecnología
RECOLONIZACIÓN CON BACTERIAS
ENDOFíTICAS FIJADORAS DE
NITRÓGENO EN CAÑA DE AZÚCAR
Autora: Bravo Mariana Noelia
Directora: Dra. Silvia Carrizo De Bellone
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMÁN
FACULTAD DE BIOQUÍMICA, QUÍMICA Y
FARMACIA

2. La caña de azúcar
La caña de azúcar
(Sacharum sp.)
(Sacharum sp.)
Planta de gran interés, agrícola la mayor
Planta de gran interés, agrícola la mayor
parte de su cultivo se destina a la producción
parte de su cultivo se destina a la producción
azucarera.
azucarera.
Tucumán es un referente nacional en la
Tucumán es un referente nacional en la
producción de caña de azúcar, la
producción de caña de azúcar, la
superficie cultivada es de 217.000 hectarias.
superficie cultivada es de 217.000 hectarias.
El cultivo en Tucumán abarca 3 zonas: La
El cultivo en Tucumán abarca 3 zonas: La
Llanuar Chacopampeana , ,el Pedemonte y
Llanuar Chacopampeana el Pedemonte y
la Llanura Deprimida.
la Llanura Deprimida.

3. Las enfermedades de la caña,
Las enfermedades de la caña,
es uno de los principales
es uno de los principales
problemas para su producción.
problemas para su producción.
“El Raquitismo de la caña socas”,
“El Raquitismo de la caña socas”,
también llamado
también llamado
Achaparramiento o RSD.
Achaparramiento o RSD.
Causado por una bacteria Síntomas: plantas de
Síntomas: plantas de
Enfermedadque provoca Causado por una bacteria
Enfermedad que provoca
llamada
llamada apariencia enana, poco
apariencia enana, poco
mayores perdidas a nivel
mayores perdidas a nivel Leifsonia xyli subsp. xyli
Leifsonia xyli subsp. xyli vigorosa y de muy baja
vigorosa y de muy baja
mundial.
mundial. conocida también como
conocida también como producción.
producción.
Clavibacter xyli
Clavibacter xyli
Coloniza los haces
Coloniza los haces
vasculares de la planta
vasculares de la planta
impidiendo el normal
impidiendo el normal
funcionamiento.
funcionamiento.

4. Control del “Raquitismo de la
Control del “Raquitismo de la
caña soca”.
caña soca”.
Utilizar cultivares resistentes
Utilizar cultivares resistentes En cultivares susceptibles
En cultivares susceptibles
Como CP 65-350
Como CP 65-350 como CP 65-357, se utiliza
como CP 65-357, se utiliza
lamentablemente, estos
lamentablemente, estos tratamiento térmico de la
tratamiento térmico de la
son escasos.
son escasos. caña semilla
caña semilla

5. El interior de la caña de azúcar
El interior de la caña de azúcar
se encuentra colonizada
se encuentra colonizada
microorganismos benéficos
microorganismos benéficos
denominados endófitos.
denominados endófitos.
Azospirillum brasilense
Azospirillum brasilense Gluconacetobacter diazotrophicus
Gluconacetobacter diazotrophicus

6. A. brasilense y G. diazotrophicus
A. brasilense y G. diazotrophicus
También denominadas Bacterias
También denominadas Bacterias
Son llamados diazotrofos
Son llamados diazotrofos promotoras del desarrollo vegetal
promotoras del desarrollo vegetal
(diazo=nitrógeno trofo=nutrición)
(diazo=nitrógeno trofo=nutrición) (PGPR)
(PGPR)
Permiten la Fijación Biológica
Permiten la Fijación Biológica Producen fitohormonas como
Producen fitohormonas como
de Nitrógeno en la caña.
de Nitrógeno en la caña. auxinas, citocininas y giberilinas
auxinas, citocininas y giberilinas
Incrementa el numero, longitud y
Incrementa el numero, longitud y
Por tener una enzima llamada
Por tener una enzima llamada superficie total de las raíces,
superficie total de las raíces,
Nitrogenasa que reduce el
Nitrogenasa que reduce el mejorando la captación de nutrientes
mejorando la captación de nutrientes
nitrógeno molecular a amoniaco
nitrógeno molecular a amoniaco y el estado hídrico de la planta.
y el estado hídrico de la planta.

7. El tratamiento, utilizado
El tratamiento, utilizado
para eliminar al patógeno Leifsonia xyli
para eliminar al patógeno Leifsonia xyli
También podría eliminar, a A. brasilense
También podría eliminar, a A. brasilense
y G. diazotrophicus que interaccionan
y G. diazotrophicus que interaccionan
con la caña de forma benéfica
con la caña de forma benéfica
permitiendo la FBN
permitiendo la FBN

8. Objetivo General:
Objetivo General:
Restituir fijadores de nitrógenos que colonizan endofíticamente
Restituir fijadores de nitrógenos que colonizan endofíticamente
la caña de azúcar, que fueron eliminados por tratamiento a 50°C
la caña de azúcar, que fueron eliminados por tratamiento a 50°C
durante 10 minutos..
durante 10 minutos
Objetivos Específicos:
Objetivos Específicos:
Inocular las raíces de cañas tratadas con calor, con cepas de A.
Inocular las raíces de cañas tratadas con calor, con cepas de A.
brasilense y G. diazotrophicus desarrollados en medios
brasilense y G. diazotrophicus desarrollados en medios
específicos.
específicos.
Verificar la recolonización de diazotrofos, la que garantizaría el
Verificar la recolonización de diazotrofos, la que garantizaría el
mejor desarrollo y nutrición de la caña.
mejor desarrollo y nutrición de la caña.
Disminuir con esta tecnología el tiempo normal de
Disminuir con esta tecnología el tiempo normal de
recolonización con microorganismo benéficos para el cultivo.
recolonización con microorganismo benéficos para el cultivo.

9. MATERIALES Y MÉTODOS

10. PROCEDIMIENTO REALIZADO
• 6 caña semillas se trataron
en agua a 50°C 10 minutos.
• Un testigo para verificar la
Se tomaron muestra de caña de Se cortaron de eficacia del tratamiento con
dos cultivares CP 65-357 y cada cultivar 16 calor.
CP 65-350 caña semilla
• Un testigo de las bacterias
que colonizaban la caña en
el momento del corte, que
no fue sometido a
calentamiento.
Cámara con una
temperatura de Ensayo por duplicado
30°C, humedad de los dos cultivares,
60% y 3000 lux cada ensayo tiene 8
durante 15 días. Macetas con cañas semillas
arena estéril

11. Se reinocularon con
Después de 15 días Las raíces de cada plantín distintas
de desarrollo Tratada a 50ºC combinaciones
de microorganismo
 CEPAS UTILIZADAS PARA LA REINOCULACIÓN
Cepas patrones de : Cultivados en medio líquidos:
• A. brasilense • NFb
• G. diazotrophicus • LGI-P Incubaron 72 horas a 30°C
• L. xyli • Caldo nutritivo

12. •Recuento de microorganismos: diluciones- suspensiones
10-1
10 -2 10-10
10 ml 1 ml
100 ml 9 ml
de cultivo 90 ml Sol. fisiológica
Sol. fisiológica
100
µl
Medios líquidos
específicos
Incubaron 30°C durante 24 horas
hasta una DO de 0.370

13.  REINOCULACIÓN CON BACTERIAS ENDOFITICAS.
Inyectando 5
raíces al azar de
Reinocularon cada plantín
Jeringa hipodérmica
Plantines de 15 días de de 1 ml
desarrollo
De los 8 plantines de cada ensayo se reinocularon 6 :
1. 0.2 ml de cultivo de A. brasilense.
2. 0.2 ml de cultivo de G. diazotrophicus.
3. 0.2 ml de cultivo de L. xyli. Se incubaron a 30°C,
60% de humedad y 3000
4. 0.1 ml de A. brasilense + 0.1 ml de G. diazotrophicus. lux durante 20 días para
la recolonización de las
5. 0.1 ml de A. brasilense + 0.1 ml L. xyli. bacterias.
6. 0.1 ml de G. diazotrophicus + 0.1 ml L. xyli.
7 y 8 son testigos no fueron reinoculados.

14.  VERIFICACIÓN DE RECOLONIZACIÓN
•Aislamiento endofítico:
Selección de 3 veces en agua Los extremos
6 raíces al azar destilada estéril de las raíces
de cada plantín lavaron parafinaron
5 veces en
Esterilizaron lavaron 1 ml de agua
destilada estéril
Alcohol 70° Hg2Cl2
30 segundos 2 minutos

15. Las raíces
esterilizadas
Se cortaron los
extremos parafinados
sembraron
Medio semi-sólido Caldo nutritivo
NFb Medio semi-sólido (L. xyli)
(A. brasilense) LGI-P
(G. diazotrophicus)
Incubaron en estufa 72 horas a 30°C

16.  IDENTIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS QUE RECOLONIZARON LAS
RAÍCES DE LOS PLANTINES DE CAÑA DE AZÚCAR
• Característica fenotípica:
Morfología de colonias
Incubo 72 h.
a 30ºC
Sembró
Cultivos bacterianos en Medio sólido específicos para
medio semi-sólido cada tipo bacteria
Colonias rojo escarlata de Colonias amarillas de Colonias blancas de
A. brasilense G. diazotrophicus L. xyli en medio de
en medio de cultivo rojo congo. en medio LGI-P sólido. agar nutritivo.

17. Morfología celular
Examen microscopio
con objetivos de 40X y 100X
Sembró (usando aceite de inmersión)
Cultivos en una colonia Medio liquido
Medio sólido Incubo 72 h. a 30°C
•Característica bioquímica y fisiológicas
Prueba de la oxidasa
Papel de filtro
+
50
una gota de sol. Acuosa
µl
de TEMED (1%)
Cultivo liquido Oxidasa Oxidasa
negativa positiva

18. Prueba de la catalasa
Una gota de
H2O2 AL 3%
esparcida
6 cultivos de cada bacteria
crecido en caja de petri Cultivo de G.
diazotrophicus
Catalasa positiva
Prueba de la gelatinasa
Incubó 24 horas y se
llevo 2 horas a heladera
Bacterias crecidas
en 8 ml de medio
preparado con: Repitió 5 veces A. Gelatinasa negativa
Extracto de levadura (medio semi-sólido)
Peptona B. Y C. Gelatinasa positiva
(medio liquido)
Gelatina (B.D.H.)

19. Fuente carbonadas variadas: glucosa, sacarosa y manitol realizada
con 10 repeticiones.
Incubo Se observo en
24 h. a 30°C el microscopio óptico
Medios específicos
+
Fuente carbonada
Reducción de nitrato
Acido sulfanílico (reactivo A ) + Color rojo
NN dimetil-1-naftalenamina (reactivo B) Nitrato reductasa negativa
+ Iones NO-3

20. Comportamiento de A. brasilense, G. diazotrophicus y L. xyli frente a
diferentes pruebas bioquímicas y fisiológicas
características A. brasilense G. diazotrophicus L. xyli
Oxidasa - - -
Catalasa + + +
Hidrólisis de
gelatina - + -
Crecimiento en:
Glucosa - + +
Sacarosa - + +
Manitol + D* +
NO3 NO2 + - -
(+) Reacción positiva; (-) Reacción negativa
(D*) Reacción débil

21. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

22. Tabla 1: Bacterias endofíticas que colonizan la caña de azúcar
CP 65-357 que fueron utilizados como testigos.
Testigo sin Testigo con
Total de tratamiento a 50ºC tratamiento a 50ºC
Bacterias raíces positivo negativo positivo negativo
analizadas
A. brasilense 12 9 3 0 12
G. 12 6 6 0 12
diazotrophicus
L. xyli 12 5 7 0 12
*Positivo: presenta desarrollo bacteriano
*Negativo: ausencia de desarrollo bacteriano
*Total de raíces analizadas: total de los ensayos por duplicados

23. A. brasilense G. diazotrophicus L. xyli
75%
80%
70%
Porcentaje de
colonización
60% 50%
50% 41,67%
40%
30%
20%
10% 0% 0% 0%
0%
Sin tratamiento térmico Con tratamiento térmico
Testigos CP 65-357
Fig. 1: Porcentaje de colonización por bacterias endofíticas en:
CP 65-357

24. Tabla 2: Bacterias endofíticas que colonizan la caña de azúcar
CP 65-350 que fueron utilizados como testigos.
Testigo sin Testigo con
Total de tratamiento a 50ºC tratamiento A 50ºc
Bacterias raíces
positivo negativo positivo negativo
analizadas
A. brasilense 12 10 2 0 12
G. 12 8 4 0 12
diazotrophicus
L. xyli 12 0 12 0 12
*Positivo: presenta desarrollo bacteriano
*Negativo: ausencia de desarrollo bacteriano
*Total de raíces analizadas: total de los ensayos por duplicados

25. A. brasilense G. diazotrophicus L. xyli
90% 83%
80% 67%
70%
Porcentaje de
60%
colonización
50%
40%
30%
20%
10% 0% 0% 0% 0%
0%
Sin tratamiento térmico Con tratamiento térmico
Testigos CP 65-350
Fig. 1: Porcentaje de colonización por bacterias endofíticas en:
CP 65-350

26. Tabla 3: Recolonización de bacterias diazotróficas endofíticas en plantines
de caña de azúcar CP 65-357
Bacterias Total de raíces Recolonización
inoculadas analizadas
Positiva Negativa
A. brasilense 12 12 0
G. diazotrophicus 12 11 1
A. brasilense 6 4 2
y
6 6 0
G. diazotrophicus
*Total de raíces analizadas: total de los ensayos por duplicados

27. Tabla 4: Recolonización de bacterias diazotróficas endofíticas en plantines
de caña de azúcar CP 65-350
Bacterias Total de raíces Recolonización
inoculadas analizadas Negativa
A. brasilense 12 12 0
G. diazotrophicus 12 12 0
6 5 1
A. brasilense 6 6 0
*Total de raíces analizadas: total de los ensayos por duplicados
y
G. diazotrophicus

28. A. brasilense G. diazotrophicus A. brasilense - G. diazotrophicus
100% 100% 100% 100% 100%
100% 92%
83,33%
recolonización
Porcentaje de
80% 66,67%
60%
40%
20%
0%
CP 65-357 CP 65-350
Cultivares
Fig. 3: Porcentaje de recolonización de bacterias diazotróficas
en plantines de caña de azúcar cultivares
CP 65-357 y CP 65 350

29. Positivo Negativo
97,22%
91,67%
de recolonización 100%
Porcentaje total
80%
60%
40%
20% 8,33% 2,78%
0%
CP 65-357 CP 65-350
Cultivares
Fig. 4: Porcentaje total de recolonización de bacterias fijadoras de
nitrógeno en plantines de caña cultivares
CP 65-357 y CP 65-350

30. Tabla 4: Recolonización de bacterias patógenas y diazotróficas en plantines
de caña de azúcar CP 65-357
Bacterias Total de raíces Recolonización
inoculadas analizadas
Positiva Negativa
L. xyli 12 10 2
L. xyli 6 2 4
y 6 6 0
A. brasilense
L. xyli 6 0 6
y
6 6 0
G. diazotrophicus
*Total de raíces analizadas: total de los ensayos por duplicados

31. Tabla 5: Recolonización de bacterias patógenas y diazotróficas en
plantines de caña de azúcar CP 65-350
Bacterias Total de raíces Recolonización
inoculadas analizadas
Positiva Negativa
L. xyli 12 0 12
L. xyli 6 0 6
y
A. brasilense 6 4 2
L. xyli 6 0 6
y
G. diazotrophicus 6 6 0
*Total de raíces analizadas: total de los ensayos por duplicados

32. L. xyli L. xyli - A. brasilense L. xyli - G. diazotrophicus
100% 100% 100%
100%
83,33%
recolonización
Porcentaje de
80% 66,67%
60%
40% 33,33%
20%
0% 0%0% 0%
0%
CP 65-357 CP 65-350
Cultivares
Fig. 6: Porcentaje de recolonización especifica del patógeno y combinado
a diazotrofos en cultivares CP 65-350 y CP 65-357

33. CONCLUSIONES

34.  El tratamiento a 50°C durante 10 minutos aplicados a los dos
 El tratamiento a 50°C durante 10 minutos aplicados a los dos
cultivares de caña de azúcar CP 65-357 (susceptible) y CP 65-350
cultivares de caña de azúcar CP 65-357 (susceptible) y CP 65-350
(resistente), fue efectivo ya que eliminó a L. xyli.
(resistente), fue efectivo ya que eliminó a L. xyli.
El tratamiento a 50ºC en los dos cultivares, también eliminó las
El tratamiento a 50ºC en los dos cultivares, también eliminó las
bacterias benéficas A. brasilense y G. diazotrophicus.
bacterias benéficas A. brasilense y G. diazotrophicus.
La tecnología utilizada para la recolonización endofíticas de las
La tecnología utilizada para la recolonización endofíticas de las
bacterias fijadoras de nitrógeno es efectiva ya que hay un 91.67%
bacterias fijadoras de nitrógeno es efectiva ya que hay un 91.67%
de recolonización CP 65-357 y un 97.22% en CP 65-350.
de recolonización CP 65-357 y un 97.22% en CP 65-350.
La recolonización del patógeno Leifsonia xyli en CP 65-357, es
La recolonización del patógeno Leifsonia xyli en CP 65-357, es
de un 83.33% y en CP 65-350 es de 0%, lo que demuestra la
de un 83.33% y en CP 65-350 es de 0%, lo que demuestra la
susceptibilidad y resistencia respectivamente.
susceptibilidad y resistencia respectivamente.

35. La recolonización de las bacterias
La recolonización de las bacterias
fijadoras endofíticas, permite
fijadoras endofíticas, permite
desarrollar cultivos de Caña de azúcar
desarrollar cultivos de Caña de azúcar
con menor incidencia en la
con menor incidencia en la
colonización de Leifsonia xyli y
colonización de Leifsonia xyli y
garantizan la fijación de nitrógeno
garantizan la fijación de nitrógeno
desde el inicio del cultivo.
desde el inicio del cultivo.