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841 tcttttataa taaactaatg ataactaatg acatccagtg tctccaaaat tgtttccttg
901 tactgatata aacacttcca aataaaaata tgtaaatgag tggttaatct ttaaaaaaaa
961 aaaaa
//
Con la secuencia del gen, ya sea en forma de secuencia completa con intrones o en la forma de
rna mensajero, se iniciará una búsqueda de secuencias relacionadas en otros genomas, con la
finalidad de explorar el grado de divergencia de ambas secuencias o de comparar la presencia
de inserciones o deleciones de nucleótidos a lo largo de la evolución de ambas secuencias a
partir de un ancestro común. Para esto el Ncbi cuenta con un programa de comparación de
secuencias denominado blast (Basic Local Alignment Search Tool o Herramienta Básica de Bús-
queda por Alineamiento Local). Este algoritmo está basado en la comparación de similitudes
de nucleótidos o aminoácidos entre secciones cortas (locales) de la secuencia de búsqueda
(query) y cada una de las secuencias de la base de datos; para proteínas, la longitud de las se-
cuencias comparadas es de tres aminoácidos y para nucleótidos la longitud mínima es de 11.
Cuando el algoritmo encuentra regiones idénticas o similares, amplía la búsqueda en regiones
contiguas, extendiendo el alineamiento hasta que ya no encuentre identidades o similitudes y
evaluando el grado de sustituciones o de inserciones y deleciones de nucleótidos o aminoáci-
dos entre las secuencias. Al seleccionar en la página de entrada la opción blast, aparecerá una
ventana con la siguiente información:
En esta página se selecciona nucleotide blast para realizar la búsqueda con una secuencia de
nucleótidos.
Aparecerá una ventana en la que se inserta la secuencia del mRna obtenida anterior-
mente. Más abajo, en selección de programa, conviene seleccionar blastn (somewhat similar
sequences [blast n]) para permitir una búsqueda amplia.
Entre los parámetros opcionales más importantes del algoritmo figuran:
Expect threshold: Número de secuencias que pueden ser encontradas al azar (Valor de
Expect con elevada significación estadística: 0.000001 = (1 x 10-6
)).
Word Size: La longitud de la secuencia que comienza el alineamiento entre secuencias
relacionadas.](https://image.slidesharecdn.com/biotecnologiav14-141116232701-conversion-gate01/85/Biotecnologia-v14-37-320.jpg)
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4. Se vacían ~ 10 ml de medio con petróleo en cada caja Petri (45 mm de diámetro) y lo
mismo del medio sin petróleo.
5. Los micelios de los dos tipos de hongos se siembran tomando un fragmento de 4×4
mm de la caja original, inoculando por triplicado en las cajas V8 con y sin petróleo
bajo condiciones de esterilidad.
6. Los hongos se dejan crecer 30 días a temperatura ambiente y se observa el resultado.
Nota: Para llevar a cabo la segunda parte se utilizarán los hongos tolerantes y no tolerantes
cultivados en medio V8 de esta primera parte de la práctica.
Resultados
La cepa del hongo tolerante a petróleo deberá crecer de manera similar a la condición control,
mientras que el crecimiento de la cepa no tolerante se notará afectado.
Anotar las observaciones, teniendo en cuenta los siguientes puntos:
1. ¿Qué mecanismos son los responsables de comportamientos diferentes en los hon-
gos bajo estas condiciones?
2. ¿Qué efectos tendrá el petróleo en los organismos vivos?
Parte II. Actividad enzimática
Los hongos cuentan con diversas enzimas extracelulares que les permiten degradar ciertos
compuestos, entre estas enzimas se encuentran las lacasas, que están involucradas en la
transformación de una amplia variedad de compuestos fenólicos.
Con base en esto se pretende probar la capacidad ligninolítica de estos hongos a través de
un ensayo colorimétrico, en donde un sustrato es oxidado (cambiará el color del sustrato como
indicador) en presencia de la enzima lacasa.
Material y equipo
1. Preparación del medio mineral 20X + ABTS [1mM] modificado de Olsson, 2001.
Composición del medio mineral 20X (stock 1 L):
Reactivo Por litro de volumen final
K2
HPO4
2 g
MgSO4
·7H2
O 2 g
KCl 2 g
En un vaso de precipitados, preparar:
Reactivo Por litro de volumen final
Stock medio
mineral 20X
50 ml
ABTS [1mM] 0.5487 g
Agar 20 g](https://image.slidesharecdn.com/biotecnologiav14-141116232701-conversion-gate01/85/Biotecnologia-v14-63-320.jpg)
![Manualdebiotecnología|práctica10
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Nota: Este medio es sólo para la determinación de actividad, la abundancia del hongo no es
relevante.
2. Aforar a 1 litro con agua destilada. Transferir a un matraz Erlenmeyer y esterilizar
durante 15–20 min. a una temperatura de 120 o
C y 1 atm de presión. Vaciar 10 ml de
medio en cada caja Petri (45 mm de diámetro). Colocar a 4 o
C en oscuridad (envolver
con papel aluminio).
3. Se toman micelios de los hongos ya crecidos en las cajas con medio V8 y se cortan
en cuadros de 1 cm2
; se inoculan en el medio mineral 20X + ABTS [1mM]. Se incuban
durante una semana a 28 o
C. en ausencia de luz, cubriendo las cajas con papel alu-
minio. El ensayo se lleva a cabo por triplicado.
Resultados
El ABTS oxidado por la lacasa se vuelve visible cuando el medio cambia la coloración a verde o
azul oscuro, por lo que la cepa del hongo tolerante a petróleo deberá hidrolizar al ABTS, mien-
tras que la cepa no tolerante no tendrá reacción alguna.
De acuerdo con lo observado, responder:
1. ¿Qué relación tiene el ABTS con el petróleo?
2. ¿Por qué cambia de color el ABTS en presencia de la lacasa?
Bibliografía
Baldrian P. (2006), “Fungal laccases - occurrence and properties”, FEMS Microbiol 30: 215-242.
Field, J.A., E. De Jong, G. Feijoo-Costa, y J.A.M. De Bont (1993), “Screening for ligninolytic fungi
applicable to the biodegradation of xenobiotics”. Trends Biotechnol 11: 44-49.
Rojas-Avelizapa, N., E. Olvera-Barrera y L. Fernández-Linares (2005), “Feasibility study of biore-
mediation of a drilling-waste-polluted soil: Stimulation of microbial activities and hydro-
carbon removal”. Journal of environmental science and health, Part A, Toxic/hazardous
substances & environmental engineering 40: 2189-2201.
Margesin, R., A. Zimmerbauer y F. Schinner (2000), “Monitoring of bioremediation by soil biolo-
gical activities”, Chemosphere 40: 339-346.](https://image.slidesharecdn.com/biotecnologiav14-141116232701-conversion-gate01/85/Biotecnologia-v14-64-320.jpg)
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Biotecnologia v14
Este documento presenta el protocolo de una práctica de laboratorio sobre la fermentación alcohólica mediada por Saccharomyces cerevisiae. La práctica consta de cuatro partes: 1) preparación del medio de cultivo a partir de uvas, 2) inoculación e incubación para permitir la fermentación, 3) obtención del producto final mediante filtración y centrifugación, y 4) análisis bioquímico para determinar la concentración de azúcares y alcohol producido. El objetivo es familiarizar a los estudiantes con
![Ppt biokimia i_(biomembran)[1]](https://cdn.slidesharecdn.com/ss_thumbnails/pptbiokimiaibiomembran1-160417123031-thumbnail.jpg?width=640&height=640&fit=bounds)
Biotecnologia v14
- 1. Departamento de BiologíaCelular Facultad de Ciencias, UNAM Manual de biotecnología Coordinadoras: Claudia Segal Kischinevzky y Beatriz Rodarte Murguía
- 3. Autores en ordenalfabético: Luisa Alba Lois, Roberto Coria Ortega, Édgar Dantán González, María Isabel de la Cruz Laina, Juan Luis Chávez Pacheco, María Eugenia Muñiz Díaz de León, Ángela Victoria Forero Forero, Angélica González Oliver, Alejandra Abigaíl González Valdez, Laura Kawasaki Watanabe, Suri Martínez Yee, Beatriz Rodarte Murguía, Bibiana Rodríguez Ponce, María Isabel Saad Villegas, Claudia Andrea Segal Kischinevzky, Alfonso José Vilchis Peluyera, Beatriz Zúñiga Ruiz. Apoyado por PAPIME PE202707 “Hacia una enseñanza actual de la Biotecnología”2011
- 4. Manual de biotecnología 1a edición,2011 Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Ciencias ISBN Impreso y hecho en México
- 5. 5 Práctica 1. Fermentación alcohólicapor Saccharomyces cerevisiae 9 Introducción Objetivo general Objetivos específicos Material y equipo Metodología Resultados Bibliografía Práctica 2. Inteligencia tecnológica competitiva 17 Introducción Objetivo general Objetivos específicos Material y equipo Metodología Resultados Bibliografía Práctica 3. Transformación de levadura y ensayo de doble híbrido 21 Introducción Objetivo general Objetivos específicos Material y equipo Metodología Resultados Cuestionario Bibliografía Mapas de los plásmidos empleados en la práctica Contenido
- 6. 6 Práctica 4. Extracción dedna e identificación del sexo en humanos: su importancia en las ciencias antropológicas y forenses 27 Introducción Objetivo general Material y equipo Metodología Resultados Agradecimientos Bibliografía Práctica 5. Sesión de bioinformática 33 Objetivos Metodología Discusión de resultados Bibliografía Práctica 6. Análisis de la actividad de catalasas 43 Introducción Objetivo general Objetivo específico Material y equipo Metodología Resultados Agradecimientos Bibliografía Práctica 7. Síntesis de celulosa bacteriana para aplicaciones biotecnológicas, utilizando Gluconacetobacter xylinum 47 Introducción Objetivo general Objetivos específicos Material y equipo Metodología Resultados Agradecimientos Bibliografía
- 7. 7 Práctica 8. Emulsificación dediesel, gasolina y aceite de maíz por Pseudomonas aeruginosa y Serratia marcenses 51 Introducción Objetivo Material y equipo Metodología Resultados Bibliografía Práctica 9. Metabolismo secundario 55 Introducción Objetivos Material y equipo Metodología Resultados Discusión Bibliografía Práctica 10. Degradación de compuestos xenobióticos a través de actividades enzimáticas 61 Introducción Objetivo general Objetivos específicos Primera parte. Monitoreo de la actividad de lacasas en hongos tolerantes al petróleo Material y equipo Resultados Segunda parte. Actividad enzimática Material y equipo Resultados Bibliografía Cultivo de tejidos vegetales. Introducción 65 Práctica 11. Fitorremediación con helechos 67 Introducción Objetivo general Objetivos específicos Material y equipo Metodología Resultados Discusión Bibliografía
- 8. 8 Práctica 12. Inducción ydesarrollo de embriones somáticos de zanahoria 73 Introducción Objetivo general Objetivos específicos Material y equipo Metodología Parte i. Germinación de semillas in vitro Parte ii. Inducción de callo embriogénico Parte iii. Embriogénesis Resultados Análisis Bibliografía Práctica 13. Organogénesis somática de Nicotiana glauca 79 Introducción Objetivo general Objetivos específicos Material y equipo Metodología Parte i. Germinación de semillas in vitro Parte ii. Cultivo in vitro Parte iii. Inducción de brotes Parte iv. Rizogénesis Resultados Análisis Bibliografía Práctica 14. Identificación de organismos genéticamente modificados 85 Introducción Objetivo Material y equipo Metodología Módulo i. Extracción de dna Módulo ii. Amplificación de dna Módulo iii. Electroforesis en geles de agarosa Resultados Bibliografía Anexo 93
- 9. 9 Práctica 1 Fermentación alcohólica porSaccharomyces cerevisiae Introducción El vino El vino es un producto de la fermentación alcohólica que llevan a cabo las levaduras a partir del zumo de frutas y otros materiales ricos en azúcar. Los factores que determinan la calidad de un vino son el clima, el suelo, la variedad de uva empleada y el proceso de fermentación. Las levaduras implicadas en la fermentación del vino suelen ser de dos tipos: las llamadas levaduras silvestres, que se encuentran presentes en las uvas, y las levaduras de vino cultiva- das, como Saccharomyces cerevisiae, que se añaden al mosto para iniciar la fermentación. Los azúcares que contiene el mosto de la uva se convierten en alcohol (etanol), con des- prendimiento de CO2 como subproducto. El grado de etanol presente en el vino se encuentra entre 6 y 13° Gay Lussac (gl) y hasta 20 °gl en licores. Además contiene sustancias orgánicas como los ácidos tartárico, málico, succínico, etc., en concentraciones de 4-7 g/L de vino, así como sustancias albuminoides, gomas, sales minerales y agua. Microflora natural de la uva Las uvas están compuestas por el hollejo (cáscara), semillas y pulpa. Sobre la superficie de las uvas habitan levaduras y bacterias aerobias estrictas. Las levaduras que predominan en la su- perficie de las uvas maduras son Saccharomyces cerevisiae y Hanseniaspora spp. En las uvas maduras se encuentran como microflora bacterias lácticas como Leuconostoc oenus, Lactobacillus spp, Pediococus parvulus, entre otras. Otros microorganismos presentes son las bacterias acéticas, como Acetobacter aceti y Gluconobacter spp. Cinética de la fermentación alcohólica Durante la fermentación alcohólica del mosto de la uva, las levaduras que participan en el proceso atraviesan tres fases: 1. Multiplicación. En dos días las cuentas totales (medida directa de la división celu- lar) y las viables alcanzan 107 células por mililitro. 2. Fermentación. Las cuentas totales se incrementan todavía más y después per- manecen constantes. Las cuentas viables alcanzan casi la misma concentración máxima de las totales, pero muestran una fase estacionaria muy corta debido principalmente a la falta de nutrientes, así como a que el etanol ejerce un efecto tóxico y a una alteración de la permeabilidad de la membrana celular.
- 10. Manualdebiotecnología|práctica1 10 3. Fase dedeclinación. La concentración de las levaduras totales no varía mucho, pero las cuentas viables disminuyen rápidamente a 105 células/ml, ya que al morir las levaduras se presenta un fenómeno de hidrólisis de la pared celular (autólisis) por su propia lisozima. Gracias a este proceso, el mosto es enriquecido con vitami- nas, aminoácidos y lípidos que estimulan el desarrollo de las bacterias lácticas. La cinética de consumo de los azúcares va a depender de la cepa de levadura utilizada, de la temperatura del proceso, de que no exista sustrato limitante y de la concentración de etanol que se genera. Bioquímica de la fermentación alcohólica La primera parte del metabolismo de los azúcares ocurre en presencia o en ausencia de oxí- geno, siguiendo las rutas de Embden-Meyerhof-Parnas (glucólisis) o la de Warburg-Dickens (pentosas-fosfato). Ambas vías funcionan simultáneamente, pero satisfacen diferentes exi- gencias: la glucosa difosfato se encarga de la síntesis de energía y la fructosa monofosfato de la creación de precursores para la síntesis celular y del Nadph necesario. Objetivo general Introducir al estudiante en el conocimiento de la biotecnología de las fermentaciones tradi- cionales. Objetivos específicos • Familiarizar al estudiante con el manejo de algunas técnicas microbiológicas. • Identificar las rutas metabólicas principales asociadas al proceso de fermentación alcohólica. • Determinar el grado alcohólico de las muestras y la concentración de azúcares re- ductores presentes al inicio y al final de la fermentación alcohólica. • Reconocer en la elaboración del vino un proceso biotecnológico de gran impacto en la industria y en constante transformación Material y equipo Parte I Material Equipo * 2 kg de uvas (verdes o rojas) Licuadora * 1 garrafón de plástico c/tapa de 5 litros Autoclave * 1 botella de vidrio c/tapa de 500 ml Incubadora con agitación * 1 botella de vidrio c/tapa de 1,000 ml Refrigerador 1 asa de siembra metálica Campana de flujo laminar 1 mechero 1 mechero * 6 gasas grandes * 100 gr de algodón, hilo y tijeras * 1 L cloro comercial *Material que deberán traer los alumnos
- 11. FermentaciónalcohólicaporSaccharomycescerevisiae|práctica1 11 Parte II Material Equipo Botellacon el inóculo Refrigerador Botella con el macerado de uvas * 1 frasco Gerber *Material que deberán traer los alumnos Parte III Material Equipo 2 botellas para centrífuga de 500 ml Centrífuga de banco 1 alcoholímetro Balanza de 2 platos 1 matraz Erlenmeyer de 1,000 ml Refrigerador 1 jarra para jugo 1 baño de hielo 1 vaso de precipitados de 500 ml 1 colador de cocina * 1 frasco Gerber * 1 metro de manta de cielo * Garrafón con el fermentado de uvas *Material que deberán traer los alumnos Parte IV Material Equipo 10 tubos de ensayo de 5 ml Vórtex 1 gradilla Espectrofotómetro 1 micropipeta de 1,000 µl Baño maría Puntas para micropipeta Potenciómetro 1 vaso de precipitados de 50 ml 1 vaso de precipitados de 100 ml 2 celdas para espectrofotómetro 1 piceta 1 cronómetro Reactivos Muestra inicial (tomada en la parte II) Vino centrifugado Glucosa DNS
- 12. Manualdebiotecnología|práctica1 12 Metodología Parte I. Maceracióne inóculo del medio de cultivo (preparación del mosto) 1. Lavar y moler 2 kg de uvas en la licuadora hasta obtener una pasta. 2. Colocar 250 ml de las uvas maceradas en una botella de 500 ml (inóculo). 3. Colocar el resto de la pasta en una botella de 1,000 ml, procurando no exceder ¾ del nivel de la botella, reservar los matraces obtenidos. 4. Esterilizar ambas botellas en autoclave —de 115 a 120 o C— por 10 minutos. 5. Dejar enfriar a temperatura ambiente. 6. En el matraz de inóculo, aplicar tres veces con un asa de siembra Saccharomyces cerevisiae en condiciones de esterilidad. 7. Incubar a 37 o C por tres días u ocho días a temperatura ambiente. 8. Almacenar la botella de 1,000 ml a 4 °C hasta su utilización. 9. Esterilizar el garrafón, lavándolo con abundante agua y cloro concentrado, dejarlo secar y almacenarlo hasta su utilización. Parte II. Inoculación e incubación 1. Se depositan en el garrafón de plástico los 250 ml de inóculo cultivado y la pasta de uva restante (botella de 1,000 ml), agitando manualmente hasta su homogeneiza- ción. Tomar una muestra de 5 ml que se utilizará en la parte IV como muestra inicial (mantener a 4 °C, en el frasco Gerber hasta su utilización). 2. Incubar a 29 °C (los estudiantes se llevan el garrafón a casa, manteniéndolo en un sitio fresco en el que que no reciba luz directa) para no desviar la fermentación de los azúcares hacia la producción de ácido acético. 3. Agitar dos o tres veces al día (oxigenación) y liberar el CO2 formado girando levemen- te la tapa del recipiente para permitir la salida del gas. Se estima que la primera y segunda parte pueden llevarse a cabo al principio del se- mestre, mientras las partes III y IV se hacen al final para permitir una buena fermen- tación. Parte III. Obtención del producto por centrifugación 1. Filtrar el producto en una jarra, —con manta de cielo y colador—, hasta separar los componentes de la uva del líquido. 2. Mantener en frío (—baño de hielo—) el producto hasta el momento de la centrifuga- ción. 3. Colocar el producto en botellas para centrífuga y balancearlas. Centrifugar a 8 Krpm durante una hora. 4. Verter el sobrenadante en un matraz de 1,000 ml, limpio y previamente desinfectado con cloro concentrado. 5. Eliminar las células del microorganismo que se depositaron en el fondo de la botella (pastilla). 6. Volver a centrifugar todo el sobrenadante una vez más. Tomar una muestra de 5 mL que se utilizará en la parte IV como muestra final (mantener a 4 °C en un frasco Ger- ber). 7. Determinar la concentración de alcohol en grados Gl con ayuda de un alcoholímetro. a. Calibrar el alcoholímetro sumergiéndolo suavemente en agua; esta medida se toma como 0 °Gl. b. Sumergir suavemente el alcoholímetro en el vino, tomar la medida que indique la escala.
- 13. FermentaciónalcohólicaporSaccharomycescerevisiae|práctica1 13 Parte IV. Determinaciónde la concentración de azúcares reductores. 1. Determinar el pH de las muestras inicial y final (por duplicado). 2. Preparar, para todo el grupo, 30 ml de una solución de dns al 0.5% y 30 ml de solución de glucosa estándar (1.5 mg/ml). 3. Marcar los tubos de ensaye y agregarles las soluciones como se muestra en la si- guiente tabla: Tubo Sol. de glucosa (ml) Agua (ml) Muestra inicial (ml) Muestra final (ml) DNS (ml) 1 - 1.0 - - 0.5 2 0.2 0.8 - - 0.5 3 0.4 0.6 - - 0.5 4 0.6 0.4 - - 0.5 5 0.8 0.2 - - 0.5 6 1.0 - - - 0.5 7 - - 0.5 - 0.5 8 - - 0.5 - 0.5 9 - - - 0.5 0.5 10 - - - 0.5 0.5 Tubo Concentración de glucosa (mg/ml) 1 0.0 2 0.3 3 0.6 4 0.9 5 1.2 6 1.5 Tabla de concentraciones de glucosa para la curva estándar. 4. Agitar todos los tubos en vórtex -de 30 a 60 segundos aproximadamente. 5. Incubar los tubos tapados durante cinco minutos a baño María. 6. Sacar los tubos del baño y agregar 5 ml de agua destilada. 7. Agitar nuevamente en Vórtex. 8. Leer la absorbancia en el espectrofotómetro a 540 nm. Resultados 1. pH de las muestras inicial y final: Muestra pH TI1 TI2 TF1 TF2
- 14. Manualdebiotecnología|práctica1 14 2. Construcción deuna curva patrón de glucosa: Tubo Absorbancia (nm) Concentración de glucosa 1 0.0 2 0.3 3 0.6 4 0.9 5 1.2 6 1.5 Curva patrón de glucosa Concentración de glucosa (mg/ml) Absorbancia(nm) 3. Linealizar la curva anterior por regresión lineal y obtener la pendiente (m) y la orde- nada al origen (b), de acuerdo a la ecuación de la recta: y = mx + b Donde: x es la concentración de glucosa y es la absorbancia 4. Obtener las lecturas de la absorbancia de las muestras (por duplicado). Muestra Absorbancia (nm) TI1 TI2 TF1 TF2 5. Sustituir en la ecuación de la recta resultante de la regresión lineal, los datos de ab- sorbancia de las muestras. x = y- b m
- 15. FermentaciónalcohólicaporSaccharomycescerevisiae|práctica1 15 Donde: x es laconcentración de glucosa y la absorbancia m pendiente (obtenida en el paso 3) b ordenada al origen (obtenida en el paso 3) Tiempo Absorbancia (nm) Concentración de glucosa (mg/ml) TI1 TI2 TF1 TF2 6. Registrar la concentración de alcohol en el producto (resultado de la determinación con el alcoholímetro). Bibliografía Madigan, M.T. J.M. Martinko, y J. Parker (2003) Brock. Biología de los microorganismos. 10a ed. Prentice Hall, Madrid. Reyes, D.A. H.L. Escalilla, y C.J.R. Verde, (1992) Elaboración de los vinos de mesa, vol. I, uam Izta- palapa, México.
- 16.
- 17. 17 Práctica 2 Inteligencia tecnológica competitiva Introducción Elprimer paso en cualquier proyecto de investigación, básica o aplicada es buscar información publicada acerca del tema. Contar con información suficiente del área tecnológica en la que se pretende incursionar, que incluya tanto fuentes bibliográficas como patentes publicadas y datos económicos y comerciales, resulta indispensable para desarrollar proyectos exitosos, técnicamente factibles y con un alto impacto social y económico. Esto es importante para los grupos de investigación de universidades e institutos, públicos y privados, pero resulta de es- pecial relevancia para las empresas. Las nuevas disposiciones legales en materia de propiedad intelectual en México y en el entorno mundial que cada vez resulta más competitivo, obligan a las empresas mexicanas a observar atentamente el entorno tecnológico en el cual se insertan. La información tecnológi- ca es actualmente condición indispensable del éxito en cualquier proceso relacionado con los sistemas productivos: investigación, planificación industrial, desarrollo, fabricación, comercia- lización y gestión. Se sabe que, incluso, existe una fuerte correlación entre el nivel de desarrollo tecnológico de los países y la capacidad de sus estructuras productivas para acceder a la información y utilizarla libremente. La inteligencia tecnológica competitiva establece una excelente base para administrar y desarrollar proyectos tecnológicos, porque permite identificar oportunidades y ventajas com- petitivas, elegir las tecnologías adecuadas y responder de forma oportuna y acertada a los cambios del entorno. Para acceder a información estratégica de un área tecnológica es indispensable utilizar fuentes de información electrónica, porque cada año aparecen publicados cientos de miles de artículos científicos en miles de revistas especializadas. La mayor parte de los artículos publicados son del área médica, en segundo lugar están las publicaciones químicas, en tercero las de biología, en cuarto las del área física y después los artículos relacionados con las ciencias sociales. Para tener una idea certera de lo que ocurre en el mundo alrededor de un objetivo par- ticular, es importante hacer una búsqueda sistemática y rigurosa que considere tanto la in- formación científica, como las patentes y la información comercial del sector tecnológico de interés. En los últimos años el proceso de diseño de las nuevas tecnologías ha visto incrementada su complejidad y su dificultad. Se hace así más necesario en cada momento disponer de un buen sistema de seguimiento de las tendencias del progreso tecnológico, tanto en la investi- gación aplicada como en el resto de las actividades del proceso de innovación. La información de patentes puede ser una herramienta muy eficaz, no sólo para el seguimiento, sino para la
- 18. Manualdebiotecnología|práctica2 18 previsión y laplanificación del proceso de desarrollo tecnológico, así como en la realización de investigaciones económicas, científicas y tecnológicas con diferentes propósitos. El monitoreo y el análisis sistemático de la información permite construir el mapa com- pleto del área tecnológica de interés. Se identifica cuál es la oferta tecnológica global y den- tro de ella, cuáles son las tecnologías emergentes, las maduras y las que están por entrar al mercado; a quién pertenecen esas tecnologías, cuál es su tendencia de desarrollo y el posible impacto a nivel nacional e internacional de cada una de ellas. Con esta información es po- sible determinar cuáles son las tecnologías estratégicas para el grupo con el fin de diseñar programas de investigación y desarrollo, así como localizar socios potenciales para establecer alianzas tecnológicas en el nivel nacional e internacional; o bien, se puede identificar posibles licenciatarios de tecnología o tecnologías de libre acceso. Objetivo general Hacer una búsqueda sistemática de artículos científicos y de patentes, en torno a un tema de investigación biotecnológico, en bases de datos especializadas Objetivos específicos • Detectar a los mejores proveedores de bases de datos relacionados con el tema. • Identificar las bases de datos más adecuadas para la búsqueda. • Encontrar las palabras clave idóneas. • Aprender a recuperar las listas bibliográficas y los artículos específicos. • Aprender a recuperar patentes de las bases públicas de Internet. Material y equipo Equipo Material (individual) Computadora con acceso a Internet conectada a la red unam * Unidad de memoria usb * Un tema de investigación biotecnológico lo suficientemente preciso *Material que deberán traer los alumnos Metodología La práctica se llevará a cabo en un aula de cómputo en dos sesiones de tres horas. En la primera sesión se realizará una búsqueda de fuentes bibliográficas, en la segunda, se efectuará una búsqueda de patentes. Los alumnos podrán hacer búsquedas individuales o formar equipos de dos integrantes. La información obtenida será utilizada para determinar el estado del arte de un tema biotec- nológico particular elegido libremente o sugerido por los profesores.
- 19. Inteligenciatecnológicacompetitiva|práctica2 19 Primera sesión: búsquedade fuentes bibliográficas 1. La búsqueda bibliográfica se realiza en la página de la Dirección General de Bibliote- cas de la UNAM: <http://www.dgbiblio.unam.mx/> 2. En donde dice colecciones, selecciona: Bases de datos. 3. Aparece un buscador que localiza las bases de datos disponibles por tema. La bús- queda en esta sección se hace en español. Dependiendo del tema particular, pueden utilizarse palabras clave como: biología, biotecnología o medicina. 4. Aparece una lista de bases de datos, con los temas particulares que cada base inclu- ye y las empresas proveedoras del servicio. 5. Se selecciona un proveedor. 6. Se seleccionan bases de datos individuales que pueden resultar útiles para la bús- queda 7. Se hace una búsqueda en la base seleccionada utilizando palabras clave en inglés. Se anota el número de publicaciones encontradas en la base de datos. 8. Se localizan otras bases de datos útiles, se realiza la búsqueda con las mismas pala- bras clave y se comparan resultados. 9. Se realiza una búsqueda simultánea en las bases de datos que tienen el mayor nú- mero de citas, utilizando palabras clave en inglés. 10. La búsqueda se acota si es necesario (a los últimos años, buscando las palabras clave sólo en el título o localizando sólo revisiones) hasta obtener un número manejable de citas (entre 150 y 200). 11. Las citas se revisan y se seleccionan las que resultan pertinentes. 12. Las citas seleccionadas se guardan en la unidad Usb. 13. Se pide al buscador que cree la lista de la bibliografía consultada y se guarda en la unidad Usb. 14. Se regresa a la página de las citas seleccionadas y se obtienen los artículos comple- tos que se encuentran disponibles en formato Pdf. 15. Los artículos completos se guardan en la unidad Usb. Segunda sesión: búsqueda de patentes 1. Ingresar a la oficina de patentes europea: (http://ep.espacenet.com/quickSearch?locale=en_EP) 2. Se realiza una búsqueda con palabras clave (en inglés) localizadas en título y abstract. 3. Se seleccionan de la lista las patentes de Internet. 4. Los datos generales de la patente se copian y se pegan en un archivo de Microsoft Word. Resultados El alumno debe entregar: 1. La historia de la búsqueda. a. Una lista de las bases de datos consultadas. b. Las palabras clave utilizadas y el número de referencias obtenidas. c. La estrategia para acotar la información. 2. Una lista de las bases de datos más adecuadas para la búsqueda. 3. Unarchivoelectrónicoconlalistadereferenciasbibliográficasylosartículosrecuperados. 4. Un documento impreso con la bibliografía de los artículos encontrados. 5. Un archivo electrónico con la información bibliográfica de las patentes recuperadas.
- 20. Manualdebiotecnología|práctica2 20 Bibliografía Cruz, E, P.Escorsa, R. Maspons, G. Izquierdo e I. Ortiz (2003), La detección de las tecnologías emergentes: El caso de los biomateriales, Seminario ALTEC 2003 Código ES.03.145. Zhu, D. y A. Porter. (2002) “Automated extraction and visualization of information for technolo- gical intelligence and forecasting”, Technological forecasting & social change 69: 495–506. Las patentes como fuente de información tecnológica, Oficina Española de Patentes y Marcas, <http://www.oepm.es/internet/inftecn/primera.htm.>
- 21. 21 Práctica 3 Transformación delevadura y ensayo de doble híbrido Introducción El sistema de doble híbrido en levadura se desarrolló con la idea de identificar genes que co- difican para proteínas que se asocian físicamente con una proteína dada in vivo. En contraste con los métodos bioquímicos que detectan interacciones proteína-proteína, el sistema de do- ble híbrido se basa en un ensayo genético en donde la interacción entre dos proteínas se mide por la reconstitución de un activador transcripcional funcional en la levadura. Aun descono- ciendo específicamente dónde y cómo actúa una proteína particular, es posible encontrar las proteínas con las que interactúa y potencialmente utilizar esta información para conocer más sobre la posible función de dicha proteína. Enestesistemaseconstruyeunafusiónconeldominiodeuniónadna proporcionadoporel represor LexA de Escherichia coli y se expresa en un plásmido que contiene el marcador selectivo His3 (plásmido “carnada”). Por otra parte, se construye una fusión con el dominio de activación de la transcripción B42 (“acid blob”) que se expresa en un plásmido que contiene el marcador Trp1. Cuando las proteínas fusionadas interactúan, se reconstituye el factor transcripcional y se activa la transcripción ya sea del reportero LexAoperador-lacZ (localizado en un tercer plásmido) o bien, de LexAoperador-Leu2 (localizado río arriba del gen cromosómico Leu2 en la cepa EGY48). La mayoría de las proteínas pueden utilizarse de manera exitosa en el sistema del doble híbrido; sin embargo, antes de intentar buscar posibles proteínas que interactúen con la pro- teína de interés (“carnada”), es recomendable establecer si ésta es adecuada para el proceso. El sistema del doble híbrido tiene restricciones que impiden que algunas proteínas funcionen adecuadamente, por ejemplo, aquellas que tienen dominios transmembranales podrían tener dificultades al momento de la translocación al núcleo, o bien, puede ser que no se genere el plegamiento adecuado de la proteína. Objetivo general El alumno aprenderá a utilizar el sistema de doble híbrido en la levadura Saccharomyces cerevisiae como una herramienta para el análisis de posibles interacciones entre proteínas.
- 22. Manualdebiotecnología|práctica3 22 Objetivos específicos • Elalumno aprenderá a transformar a la levadura S. cerevisiae. • El alumno podrá discriminar si dos proteínas interactúan o no mediante el ensayo genético del doble híbrido. Material y equipo Material Equipo 1 mechero Vórtex Puntas estériles blancas, azules y amarillas Incubadora a 30°C 3 tubos eppendorf estériles de 1.5 ml Incubadora a 42°C Agua destilada, estéril Microcentrífuga * 1 masking tape Micropipetas de 1,000 ml, 200 ml y 20 ml * 1 encendedor Espectrofotómetro * 1 marcador indeleble Centrífuga * 1 asa de vidrio o 3 pipetas pasteur de tallo largo Termomixer * Cajas petri estériles * Palillos de dientes estériles Hielo Tubos para centrífuga, estériles Reactivos elaborados previamente por el profesor Medio YPD Medio SD + Leu Medio SGal + Leu + XGal Medio SGal + rafinosa Solución PEG/acetato de litio/TE DMSO * Material que deberán traer los alumnos. Material biológico: 150 ml de células competentes de Saccharomyces cerevisiae EGY48 150 ml de DNA de esperma de salmón (10 mg/ml) Plásmidos: • 1 mg de pEG202+Gpa1 • 500 ng de pJG4-5+Ste4 • 500ng de pJG4-5+endoquitinasa • 1 mg de pSH18-34 Cepas, plásmidos, soluciones y medios. 1. Saccharomyces cerevisiae EGY48 (Matα,trp1, his3, ura3,6, LexAop-Leu2) 2. Los tres plásmidos empleados son multicopia, contienen orígenes de replicación de E. coli (pBR ori) y de levadura (2m) y tienen el marcador selectivo AmpR para bacterias.
- 23. Transformacióndelevadurayensayodedoblehíbrido|práctica3 23 a. El plásmidopEG202 contiene el promotor de la alcohol deshidrogenasa (Adh1) y se utiliza para la expresión de las proteínas fusionadas a LexA. El sitio múltiple de clona- ción se localiza río arriba del terminador Adh1 y el marcador selectivo para levadura es His3 (figura A). b. El plásmido pJG4-5 contiene el promotor inducible Gal1 y los sitios únicos EcoRI y XhoI para obtener una fusión con la secuencia de localización nuclear de SV40 (NLS), el dominio B42 (activador de la transcripción) y la etiqueta de hemaglutinina (HA). El marcador selectivo es Trp1 (figura B). c. El plásmido pSH18-34 contiene un sitio de unión a LexA seguido del gen reportero lacZ de E. coli. Ura3 es el marcador selectivo para levadura. Metodología Parte I. Protocolo para transformar levadura 1. Inocular 5 ml de YPD con la cepa EGY48 de Saccharomyces cerevisiae y dejarlo creciendo toda la noche a 30°C y 250 rpm (profesor). 2. Al día siguiente, inocular 30 ml de YPD nuevo con aproximadamente 1 ml del cultivo de la noche anterior. Medir la densidad óptica (do) inicial a 600 nm. Incubar a la misma tempe- ratura y rpm. 3. Medir la do y sacar el cultivo cuando llegue a una do (600 nm) de 0.5-0.6 (aproximada- mente 1 x 107 células/ml). 4. Centrifugar 5 min a 2 500 rpm, eliminar el sobrenadante y agregar un volumen igual de agua destilada estéril. Resuspender en el vórtex. 5. Volver a centrifugar igual que en 4. Eliminar el sobrenadante y resuspender el botón en 1 ml de agua. Resuspender en el vórtex y pasar las células a un tubo de 1.5 ml estéril. 6. Centrifugar en la microfuga 5 seg a máxima velocidad. 7. Eliminar el sobrenadante y resuspender el botón en 1 ml de TE/acetato de litio 1X (prepa- rado fresco a partir de TE 10X y acetato de litio 10X) 8. Centrifugar igual que en el paso 6, eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 300 ml de TE/acetato de litio. 9. En un tubo eppendorf limpio, colocar 50 ml de células y agregar 50 mg de dna de esperma de salmón sonicado y hervido. Repetir el proceso con otros dos tubos. Marcar los tubos con números (1, 2 y 3). 10. Preparar los tubos de la siguiente manera: Tubo 1: agregar 500 ng del plásmido pEG202+Gpa1, 500 ng de pJG4-5+Ste4 y 500 ng de pSH18-34. Tubo 2: agregar 500 ng de pEG202+Gpa1, 500 ng de pJG4-5 + endoquitinasa y 500 ng de pSH18. Tubo 3: no agregar plásmidos. 11. Agregar 300 ml de PEG40%/Litio/TE (preparado fresco con 1 vol de TE 10X, 1 vol de acetato de litio 10X y 8 vol de PEG4000 al 50%). 12. Mezclar en el vórtex e incubar 30 min a 30°C 13. Agregar 40 ml de DMSO, mezclar en el vórtex 14. Dar un choque de calor a 42°C por 15 min. Meter en hielo. 15. Centrifugar durante 5 segundos, eliminar el sobrenadante y resuspender el botón en 100 ml de agua con ayuda del vórtex.
- 24. Manualdebiotecnología|práctica3 24 16. Plaquear lascélulas de cada tubo en medio SD+leucina e incubar a 30°C por dos días. Transcurrido este tiempo, debe observarse el crecimiento de las colonias. Parte II. Ensayo de doble híbrido 1. Una vez que hayan crecido las colonias de levaduras transformadas, sembrar 5 o 6 colo- nias de las cajas 1 y 2 en medio SGal + leucina pH 7.0, en el cual previamente se plaquea- ron 50 ml de X-Gal. Para sembrar las transformantes se emplean palillos planos estériles, tomando una sola colonia cada vez. 2. Incubar la caja a 30°C por 2 días. Resultados 1. Transformación de levadura: anotar y explicar por qué hubo crecimiento o no en cada una de las tres cajas. 2. Doble híbrido: anotar si las transformantes obtenidas generaron un color azul o no en el medio SGal + X-Gal + leucina. ¿Cómo interpretas los resultados obtenidos? Plásmidos utilizados Crecimiento en medio SD + Leu Coloración en medio SGal + Leu (pH7) + XGal pEG202 + GpaI pJG4-5 + Ste4 pSH18-34 pEG202 + GpaI pJG4-5 + endoquitinasa pSH18-34 Sin plásmidos Cuestionario 1. ¿Por qué crees que es importante sembrar las transformantes en un medio que sólo con- tiene leucina? 2. ¿Cuáles son las diferencias entre un medio selectivo y un medio completo? ¿Qué crees que hubiera pasado si hubieras sembrado tus transformantes en un medio completo? 3. ¿En qué consiste el ensayo de doble híbrido y para qué sirve? Menciona un ejemplo. 4. ¿Cuál es la función del gen reportero lacZ? 5. ¿Para qué sirve el compuesto X-Gal? ¿Qué pasaría si olvidaras adicionar este compuesto a tus cajas de SGal + Leu?
- 25. Transformacióndelevadurayensayodedoblehíbrido|práctica3 25 Bibliografía Adams, A., D.E.Gottschling, C.A. Kaiser y T. Stearns, (1997), Methods in yeast genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. Fields, S. y O. Song (1989), “A novel genetic system to detect protein-protein interactions”, Na- ture 340: 245-246. Fields, S. y R. Sternglanz (1994), “The two-hybrid system: an assay for protein-protein interac- tions”, Trends in Genetics 10: 286-292. Guthrie, C. y G.R. Fink (1991), “Guide to yeast genetics and molecular biology”, Methods in En- zymology, vol. 194. Sambrook, J., E.F. Fritsch y T. Maniatis (1989), Molecular cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Mapas de los plásmidos empleados en la práctica Figura A. pEG202: plásmido para la fusión a LexA.
- 26. Manualdebiotecnología|práctica3 26 Figura B. pJG4-5:plásmido para la fusión al dominio de activación de la transcripción. NLS HA TagB42 domain Fusion cassette ATG GGT GCT CCT CCA AAA AAG AAG … CCC GAA TTC GGC CGA CTC GAG AAG CTT … M G A P P K K K … P E F G R L E K L … EcoRI XhoI Figura C. Plásmido pSH18-34: plásmido con el gen reportero lacZ.
- 27. 27 Extracción de dnae identificación del sexo en humanos: su importancia en las ciencias antropológicas y forenses Práctica 4 Introducción En el campo de las ciencias sociales, la antropología estudia el origen del hombre. Esta discipli- na integra los descubrimientos de otras ciencias, como la sociología, la economía, la historia, la psicología y la biología. La antropología ha sido subdividida en áreas especializadas entre las que está la antropología física o biológica, que estudia la evolución y biología de las poblacio- nes humanas. Tradicionalmente, antes del nacimiento de un bebé se tiene la expectativa de cuál será su sexo. La identificación del género es importante en muchos aspectos biológicos y sociales en la vida de una persona. Por otra parte, uno de los primeros registros que se realiza en ex- cavaciones arqueológicas es la identificación del sexo en restos humanos; este dato es fun- damental para reconstruir el contexto arqueológico con la finalidad de entender a) aspectos culturales en las poblaciones antiguas, por ejemplo, la participación del hombre y la mujer en las sociedades prehistóricas, la interpretación de artefactos y arte prehistóricos, la selección de víctimas en casos de infanticidio, etc., y b) la historia evolutiva humana relacionada con de- mografía, relaciones de parentesco entre individuos recuperados del mismo entierro, etcétera. Distintos métodos morfológicos permiten identificar el sexo en restos de esqueletos hu- manos de adultos. Para este análisis la pelvis es considerada el hueso ideal, ya que permite identificar el sexo con un índice de certeza de aproximadamente 95%. Sin embargo, la identi- ficación mediante análisis morfométrico resulta incierta o imprecisa en restos óseos de niños y preadolescentes debido a la ausencia de dimorfismo sexual, o en restos incompletos de ado- lescentes y adultos. En estos casos el método molecular, basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es la herramienta idónea para la identificación del sexo en los restos óseos incompletos. Esta identificación por análisis molecular también es utilizada con frecuencia en antropología forense. La amelogenina es una proteína del esmalte dental. En los humanos hay dos genes que la codifican, éstos se localizan en los cromosomas Y y X y fueron secuenciados en su totalidad en 1991. Existen varias técnicas de PCR que se basan en la amplificación de la amelogenina para identificar el sexo, las cuales funcionan adecuadamente en muestras forenses, individuos modernos y restos arqueológicos. Así, recientemente el grupo de investigación en antropolo- gía molecular del laboratorio de bioquímica de la Facultad de Ciencias de la unam, propuso un método que se basa en la amplificación del intrón 1 del gen de la amelogenina para identificar el sexo en restos óseos humanos. El método utiliza dos primers específicos para las secuencias de los alelos de la amelogenina en los cromosomas Y y X y un primer común a ambos alelos; el tamaño de los productos de amplificación es diferente en los dos alelos. El sexo masculino se identifica por la presencia del producto que proviene del cromosoma Y, mientras que el feme- nino se identifica por su ausencia. Las reacciones de amplificación por PCR fueron optimizadas
- 28. Manualdebiotecnología|práctica4 28 y establecidas condna humano moderno, por lo que este método funciona adecuadamente para analizar dna contemporáneo y antiguo. Los productos de PCR son detectados directa- mente en electroforesis en gel de agarosa y/o poliacrilamida. Objetivo general Identificar el sexo en los alumnos que cursan la materia de biotecnología con la finalidad de que aprendan tres metodologías básicas en el área de la biología molecular. Objetivos específicos 1. Con el método de extracción de dna el alumno conocerá las características reque- ridas para obtener y manipular la muestra biológica de mucosa bucal y adquirirá la capacidad para extraer dna de ésta. 2. Con el método de PCR el alumno amplificará las regiones específicas del gen de la amelogenina de los cromosomas X y Y para identificar el sexo en humanos, lo cual le permitirá entrenarse en una técnica ampliamente utilizada en la antropología mo- lecular y la biología. 3. Con la técnica de electroforesis en gel de agarosa el alumno aprenderá a visualizar el ex- tracto de dna y los productos de amplificación de PCR.También aprenderá a cuantificar dna por comparación con un marcador de tamaño molecular. La electroforesis en gel es una herramienta que se realiza de manera rutinaria en la investigación científica. Material y equipo Material Equipo Tubos de 1.5 ml y de PCR de 0.2 ml Baño a 56°C Hisopos estériles Vórtex Micropipetas de 0.2–1ml y de 0.05 - 0.1 ml Baño a ebullición Microfuga Cámara de electroforesis Soluciones 1. PBS 20X 2. 200ml de cloro al 30% 3. Solución de lisis 4. Primers (200 ng c/u) 5. dNTPs (200 mM) 6. Buffer c/MgCl2 (1X) 7. Agua inyectable 8. Taq DNA polimerasa (1U) 9. GelRed 10. Agarosa 11. TAE 50X 12. Marcador de peso molecular para DNA
- 29. Extraccióndeadneidentificacióndelsexoenhumanos:suimportanciaenlascienciasantropológicasyforenses|práctica4 29 Metodología La práctica selleva a cabo en tres módulos: I) Extracción de dna de las muestras II) Amplificación del dna III) Electroforesis en geles de agarosa MÓDULO I. Extracción de dna Obtención de células 1. Hacer un raspado de mucosa bucal con un hisopo de algodón estéril, raspar 30 veces la parte interna de cada mejilla para obtener las células. 2. Colocar el hisopo en un tubo de 1.5 ml, añadir 1 ml de buffer PBS, enjuagar el hisopo en el fondo y contra las paredes del tubo. 3. Colocar el hisopo en una solución de cloro (blanqueador para ropa) al 30% para des- cartarlo. Extracción de dna • Transferir las células/PBS a tubos de 1.5 ml y centrifugar a 14 000 rpm durante 1 min. • Descartar el sobrenadante y resuspender en 150 µL de solución de lisis. Resuspender con cuidado utilizando la micropipeta. • Incubar a 56°C x 15 minutos. • Enfriar a temperatura ambiente por 30 segundos. • Agitar durante 15 segundos. • Calentar en baño a ebullición por 10 minutos. • Enfriar a temperatura ambiente por 2 minutos. • Agitar vigorosamente por 2 minutos. • Centrifugar a 14 000 rpm durante 2 minutos • Obtener el sobrenadante y transferirlo a un tubo limpio de 1.5 ml. • Guardar en hielo o a –20 0 C. Visualizar y cuantificar de manera aproximada en un gel de agarosa 1%/TAE MÓDULO II. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 1. Marcar tubos de pared delgada de 0.2 o 0.5 ml de acuerdo con el termociclador que se utilizará. 2. Poner en cada tubo: Reactivo Mezcla de reacción Concentración final Agua cbp ajustar a 25 µl Amortiguador 10X 2.5 µl 1X MgCl2 25 mM 2.5 µl 2.5 mM dNTP´s 1.25 mM 2.0 µl 0.1 mM BSA 2.5 µg/l 0.5 µl 1.25 µg/µl Primer COM 5 µM 1.0 µl 0.2 µM Primer XSP 5 µM 0.5 µl 0.1 µM Primer YSP 5 µM 0.5 µl 0.1 µM
- 30. Manualdebiotecnología|práctica4 30 dna 10 -20ng 1 - 3 µl Taq dna polimerasa 1 U 3. Agregar una gota de aceite mineral en caso de que el tipo de termociclador lo requiera. 4. Colocar los tubos en el termociclador y programar: Desnaturalización inicial: 94°C por 5 minutos 94°C por 30 segundos 40 ciclos { 57 °C por 30 segundos 72 °C por 1 minuto Extensión final: 72 °C por 7 minutos Guardar a 4 °C MÓDULO III. Electroforesis en gel de agarosa Preparación del gel de agarosa 1. a) Para dna genómico (agarosa al 1%): Pesar 0.3 gr de agarosa y agregar 30 ml de buffer TAE 1X. 1. b) Para productos de PCR (agarosa al 2.5%): Pesar 0.75 gr de agarosa y agregar 30 ml de buffer TAE 1X. 2. Calentar la agarosa en un horno de microondas por aproximadamente 1 minuto hasta que se disuelva completamente. Evitar que hierva, para lo cual se detendrá el horno cada vez que sea necesario. 3. Enfriar la agarosa aproximadamente a 50 °C. 4. En una superficie plana nivelada colocar la base acrílica que soportará el gel y colocar el peine para hacer los pozos 5. Vaciar la solución de agarosa evitando la formación de burbujas. 6. Dejar el gel solidificando a temperatura ambiente por aproximadamente 30 minu- tos. El gel polimerizado tiene una apariencia opaca. Preparación de la cámara de electroforesis y las muestras (extracto de dna y los productos de PCR) 1. Colocar el gel dentro de la cámara de electroforesis. 2. Añadir TAE 1X hasta cubrir completamente el gel. 3. Preparar las muestras de la siguiente forma: a) Tomar 5 µl de la muestra y depositarla en un cuadrito de Parafilm, agregar 1µl de GelRed para monitorear la movilidad electroforética y para visualizar en UV. Siempre se debe usar una punta de micropipeta nueva para cada tubo, de esta manera se evita la contaminación. b) Colocar cuidadosamente ~6 µl de muestra en cada pozo utilizando la micropi- peta de 10 µl. Poner todas las muestras deseadas de igual manera. Incluir en el gel una muestra del marcador de tamaño molecular. c) Conectar la cámara de electroforesis, el cable y la fuente de poder. Unir los electrodos positivos (rojos) y por separado los negativos (negros) entre la cá- mara, el cable y la fuente de poder.
- 31. Extraccióndeadneidentificacióndelsexoenhumanos:suimportanciaenlascienciasantropológicasyforenses|práctica4 31 d) Encender lafuente de poder y seleccionar el voltaje en 100 voltios. Cuando el equipo funciona correctamente se producen burbujas que son visibles. Las muestras de DNA deben dirigirse hacia el electrodo positivo. e) Desplazar las muestras tres cuartos del tamaño del gel. f) Apagar la cámara de electroforesis para detener el desplazamiento de las muestras. Resultados Visualización del dna • El extracto de dna y los productos de PCR en el gel de agarosa se observarán con una lám- para de luz UV o sobre un transiluminador. El tamaño de los fragmentos amplificados es de 192 pb en el cromosoma X y de 158 pb para el cromosoma Y. • Tomar un registro fotográfico del gel con una cámara digital. Agradecimientos Se agradece al Dr. Alfonso Torre-Blanco del Laboratorio de Bioquímica de la Facultad de Cien- cias por su participación. Este método fue diseñado como parte de un proyecto apoyado por papiit, unam y por el CONACyT. Bibliografía De la Cruz, I., A. González-Oliver, B.M. Kemp, J.A. Román, D.G. Smith, y A. Torre-Blanco (2008), “Sex identification of children sacrificed to the ancient Aztec rain gods in Tlatelolco”, Cu- rrent Anthropology 49: 519-526. Brown, K.A. (2001), “Identifying the sex of human remains by ancient DNA analysis”, Ancient Biomolecules 3:215-225. Jurmain, R., L. Kilgore, W. Trevathan y H. Nelson (2003), Introduction to physical anthropology, 9 ed., Thomson, Wadsworth, Canada, 522 p.
- 33. 33 Sesión de Bioinformática Basesde datos y herramientas bioinformáticas Práctica 5 ¿Qué es la bioinformática? La bioinformática es el campo científico que integra a la biología, las ciencias computacionales y la tecnología de la información en una disciplina única. Al inicio de la “revolución genómica” la bioinformática se entendió como la creación y mantenimiento de bases de datos en las cua- les se guardara información biológica tales como secuencias de nucleótidos (genes, secuen- cias reguladoras, etc.) y de aminoácidos (proteínas). Conforme estas bases de datos fueron creciendo, fue necesario desarrollar nuevas inter- fases entre los remitentes de secuencias y los usuarios de tales bases. De esta manera, las bases de datos iniciales –Pir (Protein Information Resource) y GenBank– fueron ampliando sus recursos informáticos para incluir programas de búsqueda y comparación de secuencias de nucleótidos y aminoácidos, traducción de secuencias de nucleótidos a aminoácidos o búsque- da de señales estructurales o funcionales en las secuencias. Así, para el resguardo y análisis de las bases de datos de dna, a principios de 1980 se crea el Centro Nacional de Información Biotecnológica (Ncbi, por sus siglas en inglés), dependiente de los institutos nacionales de salud en Bethesda, Maryland, Estados Unidos, la Biblioteca de Datos del Laboratorio Europeo de Biología Molecular (Embl) y el Banco de Datos de dna en Japón (DDBJ). Por su parte, las se- cuencias de proteínas fueron depositadas en la base de datos Pir y, más recientemente, en la base de datos Protein DataBank (Pdb). Como se mencionó anteriormente, todas estas bases de datos cuentan con recursos bioinformáticos muy amplios con los cuales se pueden llevar a cabo múltiples análisis de las secuencias. Con el desarrollo de la Red Internacional –internet–, todas estas bases de datos han sido puestas a disposición de todo el público de manera gratuita a través de diferentes páginas Web. ¿Qué es el ncbi? Establecido en 1988 como un recurso computacional para el manejo de información en bio- logía molecular, el Centro Nacional de Información Biotecnológica (ncbi) crea bases de datos públicas de dna, conduce investigación en biología computacional, desarrolla herramientas de software para análisis de datos genómicos y disemina información biomédica para inves- tigación básica y clínica. Además de Ncbi y sus Bases de Datos asociadas (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), exis- ten otras Bases de Datos tales como embl/Ebi del Laboratorio Europeo de Biología Molecular (http://www.ebi.ac.uk/embl), el dna Databank de Japón (ddbj; http://www.ddbj.nig.ac.jp) y Ensembl, que es un proyecto conjunto del embl/ebi y el Instituto Sanger de Inglaterra (http:// www.ensembl.org). Todas estas bases de datos cuentan con múltiples recursos bioinformá- ticos para la recuperación, comparación y análisis de secuencias de nucleótidos y proteínas.
- 34. Manualdebiotecnología|práctica4 34 Objetivos • Presentar alalumno los conceptos básicos y las herramientas computacionales en el campo de la bioinformática. • Formalizar lo anterior mediante un ejemplo de búsqueda, recuperación y análisis de se- cuencias de genes y proteínas. Metodología 1. Recuperación de secuencias En esta sesión de bioinformática se accederá a la base de datos del ncbi, se hará una búsqueda de una secuencia determinada y se utilizarán algunas de las herramientas computacionales que el ncbi pone a disposición de la comunidad académica mundial. Nota: Las bases de datos no sólo incrementan constantemente sus contenidos, sino que también varía el diseño de las páginas, sin embargo, siempre será posible llevar a cabo el ejercicio propuesto, mediante una búsqueda cuidadosa en toda la página. Para recuperar una secuencia de un gen o una proteína, la nomenclatura aceptada en las ba- ses de datos señala lo siguiente: • Se puede buscar la secuencia del gen o de la proteína señalando las tres primeras letras del nombre o identificador en inglés; de esta manera, si se pretende recuperar la secuencia del gen de la insulina teclear Ins, mientras que para una deshidrogenasa teclear Deh. • Si el identificador de la proteína cuenta con dos o más palabras, teclear las iniciales de dichas palabras; así, para recuperar la secuencia de la Heat Shock Protein teclear Hsp. Nota: Se pueden utilizar indistintamente mayúsculas y minúsculas en la escritura del identificador. Para entrar en la base de datos del ncbi teclear la siguiente dirección: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov> y aparecerá la página de presentación del sitio:
- 35. SesióndeBioinformática.Basesdedatosyherramientasbioinformáticas|práctica5 35 Como se muestra,la página contiene el localizador Search (búsqueda) y una ventana en la que aparecen diversas bases de datos; al seleccionar Nucleotides (nucleótidos) se está escogiendo una base de datos específica y en la ventana del localizador escribir el nombre del gen que se desea recuperar; en este caso, el del gen codificante de la proteína de choque térmico Hsp10. El programa de búsqueda generará un reporte de todas las entradas que existen en la base de datos en las que aparece el registro Hsp10: This search in Gene shows 164 results, including: hsp10 (Arthroderma benhamiae CBS 112371): mitochondrial heat shock protein Hsp10 HSP10 (Bifidobacterium bifidum PRL2010): 10 kDa chaperonin GROES hsp10 Hsp10hsp10 (Salmo salar): heat shock protein 10 Por otra parte, si se quiere restringir la búsqueda al gen que codifica a la proteína Hsp10 hu- mana, habrá que escribir Hsp10 human. De esta manera el programa de búsqueda recuperará la secuencia deseada: This search in Gene shows 4 results, including: HSPE1 (Homo sapiens): heat shock 10kDa protein 1 (chaperonin 10) HSPD1 (Homo sapiens): heat shock 60kDa protein 1 (chaperonin) Hspd1 (Mus musculus): heat shock protein 1 (chaperonin) Al seleccionar la primera entrada de la lista de secuencias correspondiente a Hsp10 human se obtendrán muchos descriptores. Explóralos y busca en el apartado de regiones genómicas, transcritos y productos, en donde dice GenBank, para obtener la secuencia genómica de nu- cleótidos del gen Hsp10 a partir de la Base de Datos Genbank: ORIGIN 1 acccgcgcag ggtgtgctag cgcgctcagc cctctccggc cggcttagtc tagttcccgg 61 gcctcgctcg gttccagaac tttccagaaa atgccgcgct ccctacggct caagggtcaa 121 atcgcgtcat ttccgggagg ggacgaaggg gtagttcttt cacctcggct gggcgcctag 181 aaaagcctag aaacagctcc ttttttcttc cgcctccgag tcttcgcgtc agcgtcctgc 241 gcagggccct tggggcgaat cgcggtgcgc gtcggggcga ccgccctccc tccctgggag 301 gggcgagggg gctagcggcg accgctgggg cgagcgcgcc tgcgcgctgg gtgatttttt 361 cacgtgtcgc cagggccgga ctgcgagtct ctttgcggcg ctacactaga gcagagtacg 421 agtctgaggc ggagggagta atggtgagtc ccgcgtggcc ccgaggcctg caggcccggg 481 cctgtctgag gcgtacgggg atccctgacg cccctctttt gttgggctgg gcgggaggga 541 ttggtggcca ctcagtgacc agcgcccgat ggcaccttgg agcggcaagg cccgcccgac 601 ccttttctcc cccagggctc tttgcacgcg cgtgtgctgc cggtgtgtaa ggcagggggg 661 cgagaacccg ggcgcacgcg cagcgtctca cctgcttctg cagggccttt gtggatgtgt 721 aatatcttgg gtaaaaatca tggtgccagg cagggagctt gacccagcgt ttcctgaaaa 781 tttctggaaa aacctgaaga aggaaaacat ttgaccttgg aataaactaa ggttgacctt 841 aaagctggtc tggttgctca ccggaggagc gacaacgacc cctaacagac gtaaggaatc 901 gggaattaaa cttggaatat tggttagtac attcaaatgc gcttccttaa cgaataagct 961 gaggtttggt gttaactttc aaagccaaaa cgtgttgaga tgtatagcac ggtggcgttg 1021 cctgttgata atgtgattac atttagtttt tgtttcaaaa catttctctt cctacaggca 1081 ggacaagcgt ttagaaagtt tcttccactc tttgaccgag tattggttga aaggagtgct 1141 gctgaaactg taaccaaagg aggcattatg cttccagaaa aatctcaagg aaaagtattg 1201 caagcaacag tagtcgctgt tggatcgggt tctaaaggaa aggtaaatgg gagctgcagt 1261 ggaactattt tttatagtgt gcagtggagg gaaaagaagt aattctggag tattaaaagt 1321 cgcttattaa gtagagttta tgtcgttttc aagatcatta actgctttgg ttctaatctg 1381 tttcttaaag ggaaatgact aatataaagt tgcttatttt atatgaccaa tgctatgatg 1441 cttattttat gtgatagttt cagagtatta aaaattgtcc tcaataggcc gggtgcggtg
- 36. Manualdebiotecnología|práctica4 36 1501 gctctcgcct gtaatctcagcactttggga ggccgaggtg tgcggatcac aaggtcagga 1561 gttcaagacc agcctgacca acatggtgaa accccgtctc tactaaagat acaaaaatta 1621 gccgggtgtg gtggcatgcg cctgtaatcc cagctactgg ggaggctgag gcaggagaat 1681 catttgaacc ctggaggcgg aggttgcaag gagccgaggt tgcaaggcgc ccctgcattc 1741 cagtatgggg gacagggcga gattctgtct caaaaaaaaa aaaaaaaaat cccctcaata 1801 gcaatttggt agcctagtgt gatcagtgtt tgccttacat tctaaatttt taataagaca 1861 aaagaggctg tgcgtggtgg ctcacacctg taatccttgc attttgggag gccaaagcag 1921 gaggatcgtt tgagctcagg attcaaaatc aggagttcaa aatcagtctg ggcaacataa 1981 tgagacctcc tgtctacaaa ataaataaat acaaaagatg tgcttcaagg taaaatgagg 2041 gggcatttaa gaattgagag gaaacttgga ctgttcgttt aacccctaac acattgaaat 2101 tgccctaatc ttaaccagtt ggtatacctg gttgtatacc taccagagga acaggttggt 2161 cagtcttgtc caatctgcag cctgggacag ctctgaatgc cgcctaacgc aaatccctaa 2221 actttcttaa aacctgatat ttcttttgca atttttttta agcttaccag ctactgctaa 2281 tgttagtgta ttttatgtgt ggcccaacac agttcttcca gtgtggccca gggaagccaa 2341 aagattgcac acctctgttt tagatgttcc tcagttaatt gtttaggcct cgggcttcta 2401 aagatctcag ccaaaataca cagtaaacgc cgttggggcc aaataatgtt aactgcattg 2461 ttctagttgc ttctgaggag gaaagctcta ctgaggagct gtcatggagt taggaatagg 2521 aagactttgg ggagtggaca cttagctgca gtccctttcc ccaaatctgt tctttggagg 2581 gaacaaaaca atcacaagag tatgttctaa atccaaaaaa actttaaatt tttgtatgtt 2641 gaaagaagga aaatatgacc atttgtatat ggcattttct gggtgctggc tactgttgca 2701 ggtttatttc atatagttga taagttatgt taatatttaa cagttataaa gttagcttta 2761 gttaactaaa gttagctttt ccagaatatt ttcttgaact tttacgttgg agtcaggttt 2821 tagtttaagc cactgtgtat tatttcaaag tgtaactaca gtggtatttt tgagtgaaga 2881 tctgtaattc tagtatgagt cgtatcactt agccacgaaa tatattttta atataattgg 2941 atttgagtga ccatgtttca ttagttgtag tgatttaaaa gttaactgtt tatgttgggt 3001 gaactagata tctttgctaa taaacatcct tcctttttta agggtggaga gattcaacca 3061 gttagcgtga aagttggaga taaagttctt ctcccagaat atggaggcac caaagtagtt 3121 ctagatgaca aggtgtgtaa acttaataat tctaaaaaga agtcagatat ttgcaattag 3181 ttgtcttaac taatggtttt tttcacttgc aggattattt cctatttaga gatggtgaca 3241 ttcttggaaa gtacgtagac tgaaataagt cactattgaa atggcatcaa catgatgctg 3301 cccattccac tgaagttctg aaatctttcg tcatgtaaat aatttccata tttctctttt 3361 ataataaact aatgataact aatgacatcc agtgtctcca aaattgtttc cttgtactga 3421 tataaacact tccaaataaa aatatgtaaa tgagtggtta atcttta // Como se puede observar, la secuencia contiene una numeración que facilita la búsqueda de una subsecuencia particular. De igual forma se puede recuperar, dando clic en transcript, la secuencia del rna mensajero del gen, y en este caso, la secuencia “NM_002157.2” recuperada solamente muestra los exones que conforman el rna mensajero maduro: /gene=”HSPE1” HSPE1/RNAm ORIGIN 1 acccgcgcag ggtgtgctag cgcgctcagc cctctccggc cggcttagtc tagttcccgg 61 gcctcgctcg gttccagaac tttccagaaa atgccgcgct ccctacggct caagggtcaa 121 atcgcgtcat ttccgggagg ggacgaaggg gtagttcttt cacctcggct gggcgcctag 181 aaaagcctag aaacagctcc ttttttcttc cgcctccgag tcttcgcgtc agcgtcctgc 241 gcagggccct tggggcgaat cgcggtgcgc gtcggggcga ccgccctccc tccctgggag 301 gggcgagggg gctagcggcg accgctgggg cgagcgcgcc tgcgcgctgg gtgatttttt 361 cacgtgtcgc cagggccgga ctgcgagtct ctttgcggcg ctacactaga gcagagtacg 421 agtctgaggc ggagggagta atggcaggac aagcgtttag aaagtttctt ccactctttg 481 accgagtatt ggttgaaagg agtgctgctg aaactgtaac caaaggaggc attatgcttc 541 cagaaaaatc tcaaggaaaa gtattgcaag caacagtagt cgctgttgga tcgggttcta 601 aaggaaaggg tggagagatt caaccagtta gcgtgaaagt tggagataaa gttcttctcc 661 cagaatatgg aggcaccaaa gtagttctag atgacaagga ttatttccta tttagagatg 721 gtgacattct tggaaagtac gtagactgaa ataagtcact attgaaatgg catcaacatg 781 atgctgccca ttccactgaa gttctgaaat ctttcgtcat gtaaataatt tccatatttc
- 37. SesióndeBioinformática.Basesdedatosyherramientasbioinformáticas|práctica5 37 841 tcttttataa taaactaatgataactaatg acatccagtg tctccaaaat tgtttccttg 901 tactgatata aacacttcca aataaaaata tgtaaatgag tggttaatct ttaaaaaaaa 961 aaaaa // Con la secuencia del gen, ya sea en forma de secuencia completa con intrones o en la forma de rna mensajero, se iniciará una búsqueda de secuencias relacionadas en otros genomas, con la finalidad de explorar el grado de divergencia de ambas secuencias o de comparar la presencia de inserciones o deleciones de nucleótidos a lo largo de la evolución de ambas secuencias a partir de un ancestro común. Para esto el Ncbi cuenta con un programa de comparación de secuencias denominado blast (Basic Local Alignment Search Tool o Herramienta Básica de Bús- queda por Alineamiento Local). Este algoritmo está basado en la comparación de similitudes de nucleótidos o aminoácidos entre secciones cortas (locales) de la secuencia de búsqueda (query) y cada una de las secuencias de la base de datos; para proteínas, la longitud de las se- cuencias comparadas es de tres aminoácidos y para nucleótidos la longitud mínima es de 11. Cuando el algoritmo encuentra regiones idénticas o similares, amplía la búsqueda en regiones contiguas, extendiendo el alineamiento hasta que ya no encuentre identidades o similitudes y evaluando el grado de sustituciones o de inserciones y deleciones de nucleótidos o aminoáci- dos entre las secuencias. Al seleccionar en la página de entrada la opción blast, aparecerá una ventana con la siguiente información: En esta página se selecciona nucleotide blast para realizar la búsqueda con una secuencia de nucleótidos. Aparecerá una ventana en la que se inserta la secuencia del mRna obtenida anterior- mente. Más abajo, en selección de programa, conviene seleccionar blastn (somewhat similar sequences [blast n]) para permitir una búsqueda amplia. Entre los parámetros opcionales más importantes del algoritmo figuran: Expect threshold: Número de secuencias que pueden ser encontradas al azar (Valor de Expect con elevada significación estadística: 0.000001 = (1 x 10-6 )). Word Size: La longitud de la secuencia que comienza el alineamiento entre secuencias relacionadas.
- 38. Manualdebiotecnología|práctica4 38 Filter: Elimina secuenciascon baja complejidad composicional, por ejemplo: AAAAAAAAAA….., TATATATATAT…., AGAGAGAGAG…. Pulsar la tecla Blast, con lo cual el programa buscará en la bases de datos las secuencias que muestren identidad total o parcial, según se mencionó antes. El resultado de la búsqueda aparecerá en el siguiente formato: Las barras horizontales indican las secuencias con mayor índice de similitud con la secuencia de búsqueda, expresado esto como el valor de Score (puntuación), que va en decremento des- de la línea superior a la inferior en función de los valores de puntuación señalados: < 40 hasta > 200. Al colocar el cursor sobre una línea determinada aparecerá en la pantalla la secuencia correspondiente. Si en vez de hacer el Blast contra todos los genomas, se selecciona en la ventana previa sólo la base de datos de humano, se puede obtener una visión cromosómica de las ubicacio- nes de las secuencias obtenidas con la opción Human genome view y el programa desplegará una pantalla mostrando las ubicaciones de las secuencias recuperadas por cromosoma, tal como se observa en la siguiente ventana:
- 39. SesióndeBioinformática.Basesdedatosyherramientasbioinformáticas|práctica5 39 Chromosome view hsp10human 2. Comparación de secuencias La base de datos del ncbi también da la opción de llevar a cabo búsquedas de secuencias relacionadas con la de interés en muy diversos genomas totalmente secuenciados, tanto pro- cariontes como eucariontes, lo que permite hacer comparaciones evolutivas y construir re- laciones filogenéticas entre diversos organismos. Un ejemplo de lo anterior lo representa la recuperación de la secuencia homóloga del gen de Hsp10 humano en el genoma del chim- pancé; en la pantalla siguiente se muestra el formato de la ventana configurada en la opción Blast (Blast Home), listando una pequeña muestra de los genomas secuenciados hasta la fe- cha con la opción Blast Assembled RefSeq Genomes: BLAST Assembled Genomes Choose species genome to search or list all Genomic BLAST databases Human Mouse Rat Arabidopsis thaliana Oryza sativa Bos taurus Danio rerio Drosophila melanogaster Gallus gallus Pan troglodytes Microbes Apis mellifera También con la opción list all Genomic Blast databases se tendrá acceso a las bases de datos de todos los genomas secuenciados hasta la fecha. Si se selecciona el genoma del chimpancé (Pan troglodytes) para buscar en él la secuencia del gen de interés, -Hsp10-, y se repite el procedimiento anterior de copiar y pegar la secuencia
- 40. Manualdebiotecnología|práctica4 40 de Hsp10 enel cuadro en blanco de la pantalla Blast y se pulsa la opción Begin Search (comen- zar la búsqueda), el programa dará por resultado un alineamiento pareado entre la secuencia del gen de Hsp10 humano y las secuencias homólogas de Hsp10 en el genoma del chimpancé. La primera entrada corresponde al gen tal como se muestra en el siguiente recuadro: Se puede observar que el programa indica el porcentaje de identidad registrado entre las dos secuencias –en este caso de 93%–, el valor de Expect, probabilidad de alineamientos al azar entre dos secuencias no relacionadas, que en este caso es del orden de 1 x 10-6 y en donde no hay línea, las sustituciones que han ocurrido en estas proteínas desde el tiempo de divergen- cia entre las dos especies. Para el caso de recuperar y comparar secuencias de aminoácidos, un recurso bioinformá- tico muy útil es UniProt, el cual es una base de datos combinada de tres depositorios inter- nacionales de secuencias de proteínas, PIR, SwissProt y TrEMBL; el sitio Web es <http://www. uniprot.org/>. Al entrar a la base de datos de UniProt y teclear el comando Hsp10 human en la casilla de búsqueda (QUERY), se obtendrá el siguiente resultado:
- 41. SesióndeBioinformática.Basesdedatosyherramientasbioinformáticas|práctica5 41 La primera entradacorresponde a la proteína de humano. Al dar un “clic” en esa entrada se obtiene toda la información disponible sobre dicha proteina, incluyendo la secuencia de ami- noácidos: Esta secuencia corresponde a la de 102 aminoácidos de Hsp10; una vez recuperada, la secuen- cia se copia en formato FASTA y se lleva a cabo una nueva búsqueda de su secuencia homóloga en diversos organismos, de manera similar a como se realizó con la secuencia del gen. La base de datos de UniProt también cuenta con el recurso bioinformático del blast, así que se puede conducir una búsqueda entre secuencias de proteínas utilizando el algoritmo blast. El programa realiza búsquedas de similitud entre proteínas de todos los organismos que están en las bases de datos. En el siguiente ejemplo, la búsqueda mediante blast produjo los alineamientos entre las secuencias de Hsp10 humana y Hsp10 de diversas especies, saliendo primero los de mamífero; se muestra el ejemplo del alineamiento de la secuencia de Hsp10 humana con la secuencia de Hsp10 de cerdo, Q6WSP6:
- 42. Manualdebiotecnología|práctica4 42 En este ejemplo,el programa blast recuperó y alineó las secuencias de Hsp10 humana y Hsp10 de cerdo (Sus scrofa) que muestran una identidad de 100%. Discusión de resultados Puntos a discutir: a) Explicar cuál es el método de búsqueda del algoritmo blast. b) Analizar, desde el punto de vista estadístico, por qué se deben filtrar las secuencias de baja complejidad. c) Señalar cuál es el significado estadístico del valor de Expect en el programa bioinfor- mático Blast. d) Discutir el impacto de la bioinformática en la biología. Los alumnos presentarán un informe sobre el desarrollo de la sesión que incluya la discusión de los incisos a), b), c), y d). Bibliografía Burks, C., et al. (1990), “GenBanK: Current status and future directions”, Methods in enzimology vol. 183, R. Doolittle (ed.), Molecular Evolution: Computer Analysis of Protein and Nucleic Acid Sequences, Academic Press, Inc. Collado, J. y A. Medrano (2003), “La biología computacional antes, durante y después de los genomas”, Fronteras de la biología en los inicios del siglo Xxi. Módulo 1: Genómica, proteó- mica y bioinformática. Bolívar F. (coord.), El Colegio Nacional, México. Collins, J. y A. Coulson (1990), “Significance of protein sequence similaritie”, Methods in Enzi- mology vol. 183, R. Doolittle (ed.), Molecular Evolution: Computer Analysis of Proteinand Nucleic Acid Sequences, Academic Press, Inc. Dolittle, R. (1990), “Searching through sequence databases”, Methods in Enzimology vol. 183, R. Doolittle (ed.), Molecular Evolution: Computer Analysis of Protein and Nucleic Acid Se- quences, Academic Press, Inc. Mount, D. (2004), Bioinformatics. Sequence and genome análisis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, N.Y.
- 43. 43 Análisis de laactividad de catalasas Práctica 6 Introducción El oxígeno es una molécula altamente reactiva que se reduce parcialmente dando lugar a di- versos agentes químicamente reactivos conocidos como especies reactivas de oxígeno (Ros, por sus siglas en inglés). Estas formas de oxígeno son altamente dañinas para los componen- tes celulares, incluyendo a los ácidos nucleicos, los lípidos y las proteínas. Además de estas mo- léculas muy reactivas, tanto el peróxido de hidrógeno (H2 O2 ) como el anión superóxido (O2 - ), son incluidos también como ros, ya que llevan a la producción de más especies reactivas, par- ticularmente en presencia de iones metálicos. Las Ros se pueden generar endógenamente en las células como consecuencia de los procesos metabólicos. También se forman por la exposi- ción de las células a agentes ionizantes, radiación y recicladores redox presentes en el medio y por la exposición a metales pesados. Así, todos los organismos aeróbicos están expuestos con- tinuamente al ataque de agentes oxidantes a través de estos mecanismos. El estrés oxidativo ocurre cuando la concentración de estos oxidantes se incrementa por encima de la capacidad amortiguadora antioxidante de la célula. Dada la ubicuidad de las Ros no es sorprendente que todos los organismos hayan desarrollado medios para proteger a sus componentes celulares contra estos oxidantes altamente reactivos. Para defenderse contra estas especies reactivas de oxígeno las células contienen enzimas antioxidantes, como la superóxido dismutasa, las catalasas y varias peroxidasas, además de que también producen moléculas antioxidantes como el ascorbato, el tocoferol y el glutatión. Las catalasas son un sistema de enzimas hemoproteicas cuyo papel es la detoxificación de los metabolitos de oxígeno generados en los diversos procesos celulares: 2 H2 O2 O2 + 2 H2 O La ingeniería genética es la técnica que se utiliza con el fin de cambiar alguna o algunas carac- terísticas del código genético. Estos cambios pueden consistir en retirar, modificar o agregar genes al dna de un organismo. Al modificar esta información, la ingeniería genética cambia el tipo o cantidad de proteínas que puede producir un organismo, con lo cual hace posible que éste elabore sustancias nuevas o desempeñe funciones distintas. En esta práctica se utilizarán dos cepas que han sido genéticamente manipuladas y su cepa parental, con el fin de que mediante un experimento muy sencillo los estudiantes pue- dan apreciar la diferencia en la expresión genética entre una cepa silvestre y cepas genética- mente alteradas, además de que comprendan y analicen tanto el poder como los alcances y limitaciones de la manipulación genética.
- 44. Manualdebiotecnología|práctica6 44 Objetivo general Identificar cómoa través de la ingeniería genética se puede alterar la expresión genética de los organismos. Objetivo específico Determinar la actividad de catalasa en cepas bacterianas usando un ensayo de liberación de oxígeno. Material y equipo Material Equipo Círculos de 3 cm de diámetro de papel filtro Vórtex Perlas de vidrio para romper 2 vasos de precipitados de 250 ml Centrífuga 1 pipeta de 5 ml Incubadora con agitación 1 pipeta de 10 ml Cronómetro 1 probeta de 1 00 ml Cámara de video 1 probeta de 1,000 ml Reactivos 2 tubos de cultivo de vidrio estériles a Triptona Tubos eppendorf de 1.5 ml a Extracto de levadura Tubos para centrífuga a NaCl Baño de hielo Agua destilada Pinza para papel filtro a KCl a Na2 HPO4 a KH2 PO4 a NaOH a Ampicilina(50 mg/ml) Hielo * Peróxido de hidrógeno (agua oxigenada, H2 O2 ) * Material que deberán traer los alumnos a Reactivos para preparar medios de cultivo. La elaboración de los medios de cultivo está en el anexo. Material biológico: cepas de Rhizobium etli CFN42, cepa silvestre, contiene cromosoma y 6 plásmidos CFNX186/katG (Derivada de la CFN42, mutante del plásmido p42f complementada para actividad de catalasa ++) CFNX186/katG (Derivada de la CFN42, mutante del pásmido p42f, catalasa –)
- 45. AnálisisdelaactividaddeCatalasas|práctica6 45 Metodología 1. Inocular lastres cepas (silvestre, catalasa- y catalasa+ ) cada una por separado en tu- bos de cultivo que contengan 3 ml de PY con 10 ml de ampicilina 50 mg/ml. Incubar a 37 0 C con agitación constante (250 rpm) durante 12 hrs. 2. Centrifugar los cultivos tres minutos a 13,000 g. 3. Resuspender las pastillas en 200 µl de PBS, añadir perlas de vidrio cubriendo hasta ¾ del líquido y romper 5 intervalos de 1 min por uno de reposo en el vórtex. 4. Centrifugar a 13,000 g por cinco minutos y trasladar los sobrenadantes a un tubo nuevo. 5. En este momento preparar 400 ml de una solución al 1% de H2 02 en agua destilada y distribuir 200 ml en tres vasos de precipitados de vidrio. 6. Empapar los círculos de papel filtro con el sobrenadante de cada cepa, tener cuidado de marcar antes con lápiz cada uno de los círculos. Tener lista la cámara y el cronó- metro. 7. Cada uno de los círculos mojados se toman con las pinzas por una orilla y se colocan en la solución de H2 O2 depositándolos hasta al fondo del vaso. 8. Se observa durante cinco minutos. Resultados 1. De acuerdo con los resultados, discutir los siguientes puntos: 2. ¿En qué vaso se formaron más burbujas? ¿En cuál vaso no se formaron? ¿Por qué? 3. ¿Por qué se forman estas burbujas? 4. ¿Las burbujas se generarían de la misma forma con otro reactivo? 5. ¿Qué aplicaciones potenciales tiene una cepa con gran actividad de catalasa? Agradecimientos Se agradece al Dr. Alejandro García de los Santos del Centro de Ciencias Genómicas por permi- tirnos utilizar sus cepas. Bibliografía Díaz, A. (2003), La estructura de las catalasas, REB 22 (2): 76-84. Luque, J. y A. Herráez (2001), Biología molecular e ingeniería genética, Harcourt.
- 46.
- 47. 47 Síntesis de celulosabacteriana de Gluconacetobacter xylinum para aplicaciones biotecnológicas Práctica 7 Introducción La celulosa es el polímero de mayor abundancia natural, conformado por una larga cadena lineal de moléculas de D-glucopiranosa enlazadas mediante los carbonos C1 y C4 (enlace ß1- 4, ver figura). Estructura lineal de la celulosa. Diversas especies dentro de los géneros Acetobacter, Achromobacter, Agrobacterium, Escheri- chia, Pseudomonas, Rhizobium, Salmonella, Sarcina, Zoogloea y Gluconacetobacter producen celulosa, siendo G. xylinum la bacteria que tiene la mayor capacidad de síntesis. Al estudiar la fermentación de vinagre se observó que se formaba una masa gelatinosa sobre la superficie del medio de cultivo a la que se denominó “madre del vinagre”. Análisis pos- teriores determinaron que la masa estaba compuesta por celulosa y que la bacteria Bacterium aceti era el organismo responsable de su producción. Posteriormente, la bacteria fue referida como Acetobacterium xylinum ó Bacterium xyli- nodes; el nombre derivó a Acetobacter xylinum y finalmente la denominación actual de esta bacteria es Gluconacetobacter xylinum. G. xylinum es un miembro de la familia Acetobactereaceae; es una bacteria Gram negati- va con forma de bacilo cuyo tamaño varía entre 0.6 – 0.8 µm x 1.0 – 1.4 µm. Es un microorga- nismo aerobio estricto, con metabolismo respiratorio que oxida en forma incompleta azúcares y alcoholes —fermentación oxigénica—. Su hábitat natural son frutas y vegetales en proceso de descomposición. En cultivo estático, la bacteria secreta microfibrillas de celulosa, las cuales en el exterior se ensamblan formando una nata gruesa o “película”. Se ha propuesto que la celulosa permite a las células alcanzar la superficie del medio de cultivo, donde existe mayor disponibilidad de O2 para su crecimiento.
- 48. Manualdebiotecnología|práctica7 48 La película decelulosa posee funciones de vital importancia para G. xylinum: aumenta su capacidad para colonizar sustratos, evita la desecación y protege a la bacteria contra la radia- ción ultravioleta. La celulosa producida por G. xylinum tiene alta pureza y una estructura similar a la de la celulosa vegetal. La estructura de la celulosa depende de las condiciones de cultivo: en con- diciones de cultivo estático se genera una “película” en la interfase aire/líquido mientras que en cultivo agitado se forman gránulos irregulares, cadenas fibrosas o ramificadas de celulosa. El mecanismo de síntesis de celulosa bacteriana le confiere una pureza superior a la de la celulosa vegetal y posee características peculiares: alto grado de cristalización, alta resistencia a la presión, elasticidad y durabilidad, elevada absorción de agua y mayor área superficial que la que presenta la celulosa vegetal. Además, es inerte metabólicamente, no es tóxica ni provo- ca reacción alérgica al contacto, propiedades de particular importancia para fines biomédicos y cosméticos. G. xylinum no lleva a cabo glucólisis (carece de la enzima fosfofructocinasa-1), pero en cambio a partir de triosas fosfato realiza gluconeogénesis; la ruta de las pentosas fosfato y el ciclo de Krebs son las vías anfibólicas más activas en la bacteria. Mediante estas vías se pro- duce la celulosa tanto a partir de la poza de hexosas fosfato (glucosa, fructosa, manosa) como por síntesis a través de la vía gluconeogénica. La síntesis de celulosa es un proceso costoso debido a los requerimientos de energía y fuente de carbono; sin embargo, la película permite a G. xylinum situarse cerca de la superficie del medio y obtener así un mayor acceso a los nutrientes y sobre todo al oxígeno, indispensa- ble para la síntesis de Atp. Aplicaciones biotecnológicas La celulosa bacteriana (cb) generada por G. xylinum tiene cualidades únicas que no están pre- sentes en la celulosa vegetal: es un producto de alta pureza que no posee lignina ni ningún otro material común en la celulosa de otras fuentes. La celulosa nativa exhibe un alto grado de hidrofilicidad, puede retener una cantidad de agua aproximada a 600 veces su peso seco, se ha demostrado que el 99% de la cb es agua. La Cb es permeable a gases, tiene una alta fuerza tensil y resistencia a la presión; es inerte metabólicamente y no tiene propiedades alergénicas; estas últimas características le permiten una variedad de aplicaciones en la industria cosméti- ca, farmacéutica y biomédica (ver cuadro). Industria Aplicaciones Turística Ropa deportiva, equipo para acampar. Textil Material de alta absorción acuosa. Papel Restauración de documentos, papel de alta calidad. Alimentos Aditivo de alimentos, emulsificante, fibra dietética. Refinería Material para la absorción de aceites. Maquiladora Componente de partes y refacciones para autos, aviones, etc. Tecnología Diafragmas de alta sensibilidad en micrófonos y audífonos. Investigación Inmovilización de proteínas y células, resinas para cromatografía. Médica Fabricación de piel artificial en terapia de quemaduras. Componente en implantes dentales. Aplicaciones industriales de la celulosa de origen bacteriano.
- 49. SíntesisdecelulosabacterianadeGluconacetobacterxylinumparaaplicacionesbiotecnológicas|práctica7 49 Objetivo general Que elalumno obtenga celulosa de origen bacteriano de alta pureza. Objetivos específicos • Demostrar las aplicaciones biotecnológicas industriales de los productos del meta- bolismo bacteriano. • Que el alumno compare las ventajas y desventajas de la producción de la celulosa bacteriana vs la celulosa vegetal. Material y equipo Material Equipo 200 ml de medio BEGG Potenciómetro 1 matraz Erlenmeyer de 500 ml Balanza analítica Pipeta serológica de 5 ml Horno (opcional) * Caja Petri (estéril) Campana de flujo laminar Pinza (estéril) * Recipiente para colocar la película de celulosa en NaOH Papel aluminio 1 bisturí (con navaja estéril) 50 ml de NaOH 0.5 M * Algodón y gasas para elaborar un tapón *Material que deberán traer los alumnos. Metodología Inocular G. xylinum —cultivada por el profesor durante una semana anterior a la fecha de la práctica a una temperatura ~ 30°C. Para inocular se utilizará un fragmento de la película de celulosa formada en el cultivo estático, ya que G. xylinum crece en la matriz de la película de celulosa en estas condiciones. Para hacer más fácil la inoculación de G. xylinum, se sugiere que en condiciones de esterilidad (campana de flujo laminar o cerca del mechero) se coloque, con la ayuda de unas pinzas, la película de celulosa formada en una caja de Petri vacía y una sola persona corte cinco fragmentos con el bisturí; cada equipo inoculará su respectivo matraz con un fragmento de celulosa. Dejar los matraces en reposo a temperatura ambiente durante una o dos semanas (es importante no mover estos matraces para evitar que la película de celulosa se hunda).
- 50. Manualdebiotecnología|práctica7 50 Resultados Transcurrido el tiempo,se obtiene la película de celulosa. Determinar el peso húmedo y el pH final del medio de cultivo. La película de celulosa se coloca en NaOH O.5 M por 30 min. a 100 °C, con el fin de blan- quearla; posteriormente, se lava con abundante agua y se deja secar a temperatura ambiente para determinar su peso seco. De no contar con un horno se puede dejar en la sosa a tempe- ratura ambiente por varios días. El alumno reportará el rendimiento de celulosa tanto en peso húmedo como seco. Tam- bién debe reportar, con base en este rendimiento, cuál es el porcentaje de humedad que retie- ne la película de celulosa. Agradecimientos Se agradece al Dr. José Edgardo Escamilla Marván, investigador del Instituto de Fisiología Celu- lar de la unam por la donación de la cepa de Gluconacetobacter xylinum IFO 13693. Bibliografía Brown, A.J. (1886), “On acetic ferment which forms cellulose”J. Chem. Soc. 49: 432-439. Englehardt, J. (1995), “Sources, industrial derivatives, and commercial applications of cellulo- se”, Carbohydr. Eur, 12: 514. Ross, P., R. Mayer y M. Benziman (1991), “Cellulose biosynthesis and function in bacteria”, Mi- crobiol 55: 35-58. Yamanaka, S. y K. Watanabe (1994), Applications of bacterial cellulose in cellulosic polymers, Chapter 11, Gilbert, R. (ed.), Hanser Publishers Inc, Cincinnati, OH. Yamanaka, S. y K. Watanabe, N. Kitamura y M. Iguchi (1989), “The structure and mechanical properties of sheets prepared from bacterial cellulose”, J. Mater. Sci. 24: 3141-3145.
- 51. 51 Emulsificación de diesel,gasolina y aceite de maíz por Pseudomonas aeruginosa y Serratia marcenses Práctica 8 Introducción Los ramnolípidos son moléculas tensoactivas que actúan como biosurfactantes. La función principal de los biosurfactantes es permitir a los microorganismos crecer en sustratos inmis- cibles en agua a través de la reducción de la tensión superficial. Los ramnolípidos están for- mados por una molécula hidrofóbica que generalmente es un dímero de ácido ß-hidroxideca- noico y una parte hidrofílica constituida por una (monorramnolípido) o dos (dirramnolípido), moléculas de ramnosa. En particular, los ramnolípidos producidos por P. aeruginosa han sido estudiados para su aplicación en distintas áreas, que incluyen la detoxificación de suelos con- taminados con petróleo, la eliminación de metales tóxicos de suelos, recuperación terciaria de petróleo, protección contra plagas, así como en la industria cosmética y farmacéutica. Son también una fuente importante de L-ramnosa, que es usada en química fina y como materia prima para la síntesis de compuestos orgánicos. Pseudomonas aeruginosa es una bacteria ambiental que puede proliferar en diversos há- bitats, incluyendo agua, suelo y plantas. Esta bacteria secreta numerosos compuestos que se encuentran involucrados en el éxito de colonizar diferentes ambientes. Dentro del género Pseudomonas, solo P. fluorescens (viscocina) y P. aeruginosa tienen la capacidad de producir biosurfactantes llamados ramnolípidos. Los factores de virulencia son expresados de una ma- nera coordinada a altas densidades celulares por un mecanismo llamado respuesta sensora de quórum (Qs). Aunque la función fisiológica de los ramnolípidos en P. aeruginosa no ha sido completa- mente establecida, se les ha considerado como factores de virulencia y antimicrobianos y se les ha implicado en el establecimiento de la estructura y en la disgregación de las biopelículas, así como en la movilidad tipo “swarming”de esta bacteria. La síntesis de ramnolípidos se lleva a cabo por la ramnosiltranferasa I (Rt 1), codificada por el operón rhlAB; rhlA produce el dímero de ácidos grasos (HAAs), el papel de RhlB es el de trans- ferir una molécula de dTDP-L-ramnosaal dímero de HAAs. La ramnosiltranferasa II (Rt 2), toma una segunda molécula de dTDP-L-ramnosa. La producción de ramnolípidos por P. aeruginosa depende de factores nutricionales y medioambientales, como la limitación de nitrógeno, el pH, y la temperatura. La biosíntesis de ramnolípidos ocurre durante la fase exponencial tardía y la fase estacionaria de crecimiento, bajo condiciones de limitación de nitrógeno o de fosfatos.
- 52. Manualdebiotecnología|práctica8 52 Objetivo Evaluar la emulsificacióndel diesel y del aceite de maíz por las cepas Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcenses y Escherichia coli. Material y equipo Material Equipo 4 matraces Erlenmeyer de 125 ml Incubadora a 30 °C Tubos para centrífuga Incubadora a 37 °C 1 gradilla Centrífuga 12 tubos con tapa de 15 ml Vórtex Pipetas de 10 ml Reactivos * Papel periódico Medio PPGAS * Regla Medio PG Tritón X-100 *10 ml de gasolina *10 ml de diesel *10 ml de aceite de maíz *Material que deberán traer los alumnos Metodología Obtención de los biosurfactantes producidos por las cepas Pseudomonas aeruginosa y Serratia marcenses. 1. Inocular, en un matraz Erlenmeyer de 125 ml con 50 ml de medio PPGAS, una colonia fresca de la cepa Pseudomonas aeruginosa y en otro matraz con el mismo medio ino- cular una colonia de Escherichia coli, e incubar ambos matraces a 37 °C con agitación de 200 rpm durante 24 horas. Al mismo tiempo, inocular en otro matraz Erlenmeyer de 125 ml con 50 ml de medio PG, una colonia fresca de la cepa Serratia marcenses, e incubar a 30 °C con agitación de 200 rpm durante 24 horas. 2. Transferir los cultivos crecidos a tubos para centrífuga. Centrifugar a 4 000 rpm por diez minutos y guardar el sobrenadante (fuente de biosurfactantes) a 4 °C. 3. Esterilizar los paquetes celulares para desecharlos. Prueba de emulsificación. 1. Cubrir la mesa de trabajo con papel periódico antes de comenzar. 2. Poner 3 ml de diesel a c/u de los tres tubos de ensaye, 3 ml de gasolina a c/u de los otros tres tubos, 3 ml de aceite de maíz a c/u de los tres tubos y a un último se le colocan 3 ml de tritón, que será utilizado como blanco de reacción. Los tubos deben etiquetarse de la siguiente manera: PaD (por P. aeruginosa Diesel, y así los demás tubos), PaG, PaA, PaT, SmD, SmG, SmA, SmT, EcD, EcG,EcA y EcT. Agregar 2 ml del sobrenadante de cada cepa a evaluar; los que están marcados con Pa corresponden al sobrenadante de Pseudomonas aeruginosa, mientras que los que llevan las letras Sm corresponden a la cepa de Serratia marcenses y los que van etiquetados con
- 53. Emulsificacióndediesel,gasolinayaceitedemaízporPseudomonasaeruginosaySerratiamarcenses|práctica8 53 las letras Eccorresponden al sobrenadante de Escherichia coli, de acuerdo con la siguiente tabla: Diesel Gasolina Aceite de maíz Tritón Sobrenadante P. aeruginosa Sobrenadante S.marcenses Sobrenadante E.coli PaD 3 ml - - - 2 ml - - PaG - 3 ml - - 2 ml - - PaA - - 3 ml - 2 ml - - PaT - - - 3 ml 2 ml - - SmD 3 ml - - - - 2 ml - SmG - 3 ml - - - 2 ml - SmA - - 3 ml - - 2 ml - SmT - - - 3 ml - 2 ml - EcD 3 ml - - - - - 2 ml EcG - 3 ml - - - - 2 ml EcA - - 3 ml - - - 2 ml EcT - - - 3 ml - - 2 ml 3. Agitar en el vórtex cada tubo a velocidad máxima durante dos minutos y dejar re- posar 30 minutos, hasta que se forme una nata blanca que es el indicador de emul- sificación. Resultados Cada equipo deberá determinar los mililitros de nata que se forman en cada tubo y obtener el porcentaje de emulsificación, con base en la siguiente apreciación: si la nata blanca que se forma es de 5 ml y existe una sola fase, el porcentaje de emulsificación es del 100%; en caso de que la nata formada sea de menor volumen y coexistan dos fases se deberá hacer una relación con una regla de proporciones. Anotar el porcentaje (%) de emulsificación en la siguiente tabla: Diesel Gasolina Aceite de maíz Tritón X-100 P. aeruginosa S. marcenses E. coli En el pizarrón se anotarán los resultados de todos los equipos y con éstos se obtendrá el pro- medio y la desviación estándar de cada muestra.
- 54. Manualdebiotecnología|práctica8 54 Bibliografía De Kievit, T.R.,R. Gillis, S. Marx, C. Brown y B.H. Iglewski (2001), “Quorum-sensing genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms: their role and their expression patterns”, Appl. Environ. Microbiol. 67: 1865-1873. Maier, R.M. y G. Soberón-Chávez (2000), “Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids: biosynthesis and potential applications”, Appl. Microbiol. Biotechnol. 54:625-633. Medina, G., K. Juárez, B. Valderrama y G. Soberón-Chávez (2003), “Mechanism of Pseudomonas aeruginosa RhlR transcriptional regulation of the rhlAB promoter”, J. Bacteriol 185: 5976- 5983. Medina, G., K. Juárez y G. Soberón-Chávez (2003), “The Pseudomonas aeruginosa rhlAB operon is not expressed during the logarithmic phase of growth even in the presence of its acti- vator RhlR and the autoinducer N-butyryl-homoserinelactone”, J. Bacteriol. 185: 377-380. Soberón-Chávez, G., F. Lépine y E. Déziel (2005), “Production of rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa”, Appl. Microbiol. Biotechnol. 68:718-725.
- 55. 55 Metabolismo secundario Práctica 9 Introducción Amedida que en las plantas se generan los compuestos primarios como son los aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos, ácidos carboxílicos, a través de las mismas o similares vías de biosíntesis, de manera paralela, se originan también otro tipo de compuestos que de acuerdo con sus características particulares y específicas se denominan compuestos o metabolitos secundarios. Las vías están interrelacionadas con el metabolismo primario; éste provee un cierto nú- mero de pequeñas moléculas que son empleadas como precursores de todas las vías metabó- licas secundarias importantes. Existen tres precursores principales: 1. El ácido shikímico, precursor de muchos compuestos aromáticos, incluyendo los aminoácidos aromáticos, los ácidos cinámicos y ciertos polifenoles. 2. Los aminoácidos que dan origen a los alcaloides y a los antibióticos peptídicos inclu- yendo las penicilinas y las cefalosporinas. 3. El acetato, precursor de los poliacetilenos, las prostaglandinas, antibióticos macrocí- clicos, polifenoles e isoprenoides. Entre los numerosos grupos de metabolitos secundarios producidos por una planta se encuen- tran los alcaloides, terpenos, glucósidos, flavonoides, fenoles, etc., por mencionar los principa- les y más comunes. Estos compuestos pueden o no encontrarse en un determinado vegetal; por su abundancia o ausencia, proporcionan a la planta características químicas útiles para su sobrevivencia, su clasificación botánica y su aprovechamiento por parte del hombre, y como principios activos que pueden presentar alguna actividad biológica para un gran número de organismos, aún de diferentes reinos. Las pruebas específicas para la determinación de grupos de metabolitos secundarios se llevan a cabo con un extracto de planta y a través de las técnicas colorimétricas y de precipi- tación reportadas por Domínguez. Se identifica cualitativamente la presencia o ausencia de cada uno de los grupos según el cambio de coloración o la precipitación: • Terpenos: se determinan mediante la prueba de Libermann-Burchard. • Alcaloides: se determinan mediante la prueba de Draguendorff. • Flavonoides: se determinan mediante la prueba de Shinoda. • Glucósidos: se determinan mediante la prueba de Mölish.
- 56. Manualdebiotecnología|práctica9 56 Objetivos • Que elalumno determine, a través de pruebas químicas preliminares la presencia de grupos de metabolitos secundarios en el extracto hexánico de hoja de planta. • Determinar el efecto del extracto de la planta sobre el crecimiento de Escherichia coli. Material y equipo Parte I Material Equipo * 2 frascos Gerber * Alcohol de curación (para elaborar el extracto) 3 goteros Vórtex 1 espátula Propipeta 1 vaso de precipitados de 500 ml 4 pipetas serológicas de 5 ml Cloroformo 5 tubos de ensaye Ácido clorhídrico Espátula Draguendorff 1 vaso de precipitados de 500 ml para el baño de agua – hielo Ácido sulfúrico Metanol Mölish Liebermann-Burchard Viruta de Mg Material biológico *a Extracto de planta *Material que deberán traer los alumnos Parte II Material Equipo * 3 cajas de Petri Mechero Perlas estériles para espatular Campana de flujo laminar Sensi-discos o papel filtro (1 cm diámetro) Incubadora a 37 o C Pinzas Reactivos * Regla o Vernier Agar nutritivo Violeta de genciana Hexano Material biológico Cepa de Escherichia coli GM2163, cultivada en LB entre 8-24 horas previo a la práctica *a Extracto de planta
- 57. Metabolismosecundario|práctica9 57 a Preparación del extracto: Unasemana antes de llevar a cabo la práctica, colocar clavo entero (especia), hasta aproxima- damente ¼ de volumen de un frasco de Gerber limpio y cubrir hasta la mitad del frasco con etanol al 70%; tapar y dejar macerar. El día anterior a que se lleve a cabo la práctica, tomar ~ 10 ml del extracto líquido y transferir a otro frasco Gerber limpio. Dejar destapado para evaporar el etanol. Una vez reducido el volumen, tapar y llevar ambos frascos a la clase. Metodología Esta práctica se lleva a cabo en dos partes, en la primera se determinarán los grupos de meta- bolitos secundarios del extracto de la planta y en la segunda parte se determinará la actividad biológica del extracto mediante un ensayo biológico con bacterias. Parte I. Determinación de los grupos de metabolitos secundarios 1. Se prepara una solución madre del extracto y se toma 1 ml colocándolo en un tubo de ensaye, procedimiento que se repite para cada una de las pruebas (5 tubos de ensaye). 2. Se agrega el reactivo que corresponde a cada grupo: Tubo 1. Control. Sólo se agrega 1ml del extracto. Tubo 2. Terpenos. El extracto se disuelve en 1 ml de cloroformo concentrado, se agita un minuto y se deja reposar, si se llegaran a formar dos fases se retira la superior. A la fase inferior se le agrega 1 ml de reactivo de Libermann-Burchard. Se considera posi- tiva la prueba si se observa un cambio de coloración al azul-verdoso o rojo-naranja. Tubo 3. Alcaloides. Al mililitro de extracto se le añade una gota de ácido clorhídrico concentrado y dos gotas del reactivo Draguendorff. La prueba se considera positiva si se observa un precipitado de color naranja-marrón. Tubo 4. Flavonoides. Se le agrega al extracto un trocito de viruta de magnesio (2–4 mm) y dos gotas de ácido clorhídrico concentrado, si se observa un cambio de colo- ración hacia el verde o naranja la prueba se considerará positiva. Tubo 5. Glucósidos. A 1 ml de extracto se le agrega 1 ml de metanol; después, se le agregan dos gotas de Mölish. Se coloca el tubo en un baño agua–hielo y se añade 1 ml de H2 SO4 concentrado dejando que éste se deslice por las paredes del tubo de en- saye formando así una interfase. Se toma lectura de la coloración del anillo formado en la interfase, se considera la prueba positiva si se observa un color violeta. 3. Observar y anotar la presencia o ausencia de los grupos funcionales, de acuerdo al viraje o precipitado según la prueba. Parte II. Determinación de la actividad biológica de un extracto de planta 1. Preparar agar nutritivo: Pesar 2.0 g de agar nutritivo y suspender en 90 ml de agua purificada. Calentar agitando suavemente hasta su completa disolución y esterilizar en autoclave a 121 0 C a 15 lb de presión por 15 minutos. Dejar enfriar a 45 – 50 0 C. 2. Vaciar ~25 ml del medio en cada una de tres cajas Petri y dejar solidificar. 3. Distribuir, con perlas estériles, 0.2 ml de cultivo líquido de Escherichia coli GM2163. 4. Impregnar los discos de papel filtro con cuatro diferentes cantidades del extracto del frasco 1 (20, 40, 60 y 80 ml) y uno más que será el control positivo, que se impregnará con 20 ml de violeta de genciana. Realizar el ensayo por triplicado. 5. Dejar secar los discos por aproximadamente 10 min antes de colocarlos en la caja, para que se evapore el solvente.
- 58. Manualdebiotecnología|práctica9 58 6. Distribuir loscinco discos por caja, separándolos de manera que se alejen lo más posible entre ellos y del borde de la caja (ver figura). Distribución de los discos 7. Incubar las cajas por 24 horas a 37 °C. 8. Observar las cajas a las 18 y a las 24 horas y determinar si hubo actividad bacteriostáti- ca, esto es, presencia de un halo de inhibición alrededor de los filtros, con una densidad celular menor que la presentada en el resto de la caja, asumiendo que esto se debe a la inhibición parcial del crecimiento bacteriano; o bien bactericida, inhibición total de crecimiento bacteriano alrededor del disco, observado como un halo transparente. 9. Medir con una regla o Vernier el diámetro de los halos Resultados Para las pruebas colorimétricas y de precipitación, completar la tabla siguiente y asignar valo- res (+), (++), (+++) y (++++) según la intensidad de la reacción y (-) para aquéllas en las que no se observa reacción. Grupo químico Intensidad Terpenos Alcaloides Glucósidos Flavonoides Para el ensayo con E. coli, elaborar una tabla como la indicada abajo, en donde se especifique el diámetro de los halos, indicando con un asterisco (*) los que tuvieron actividad bactericida. Caja 20µl 40 µl 60 µl 80 µl 1 2 3 4 5
- 59. Metabolismosecundario|práctica9 59 Graficar el promediode los halos por la cantidad de extracto en una gráfica de línea: Diámetrodelhalo(mm) 20 40 60 extracto (µl) 80 Discusión 1. De acuerdo con los resultados obtenidos en las pruebas colorimétricas y de precipi- tación, analizar los valores asignados (+) según la intensidad de la reacción y deter- minar la abundancia de los grupos de metabolitos secundarios. 2. Para el bioensayo con E. coli, analizar en la tabla si presenta o no halo de inhibición en cada una de las concentraciones y de qué tipo principalmente (bacteriostático o bactericida). 3. En la gráfica, al observar la media del diámetro de los halos de inhibición, analizar si la actividad biológica (bacteriostática o bactericida) depende de la cantidad de extracto. Bibliografía Anaya, L. A. L. (2003), Ecología química, Instituto de Ecología, unam/ Plaza y Valdés, México. Domínguez, X. A. (1988), Métodos de investigación fotoquímica, Limusa, México. Romeo, J. T. (2004), Secondary metabolism in model systems, Elsevier, Amsterdam. Hui, Y. H. (2008), Food drying science and technology: microbiology, chemistry applications, Lan- caster Pennsylvania.
- 61. 61 Degradación de compuestos xenobióticosa través de actividades enzimáticas Práctica 10 Introducción La biorremediación es el proceso que se ocupa de la utilización de sistemas biológicos para degradar compuestos tóxicos, contaminantes y sustancias de importancia ambiental (deno- minados genéricamente compuestos xenobióticos) en suelos, aguas y aire, generando com- puestos de menor o ningún impacto ambiental, o bien aislando la sustancia tóxica. Algunas de estas degradaciones o cambios ocurren usualmente en la naturaleza —en- tonces se denomina “atenuación natural”— sin embargo, la velocidad de tales cambios es baja. Mediante una adecuada manipulación, los sistemas biológicos pueden ser optimizados para aumentar la velocidad de cambio o degradación para que puedan ser usados en sitios con una elevada concentración de contaminantes. Una gran variedad de contaminantes pueden ser eliminados por biorremediación: pestici- das, herbicidas, petróleo y sus hidrocarburos derivados, gasolinas y metales pesados, entre otros. Entre los sistemas más interesantes para la biorremediación se encuentran los hongos ligninolíticos. Estos organismos degradan la madera a través de un conjunto de enzimas oxi- dasas poco específicas que pueden usar como sustrato un sinnúmero de compuestos xeno- bióticos. Entre estas enzimas, las lacasas han sido más estudiadas ya que son enzimas robus- tas y con un amplio rango de sustratos. Las lacasas pertenecen al grupo de las fenol oxidasas y contienen cuatro átomos de cobre en su sitio activo que son los que llevan a cabo las reaccio- nes de óxido reducción. En esta práctica se harán ensayos destinados a demostrar la importancia de las lacasas en la capacidad de crecimiento de diversos hongos ligninolíticos, así como su determinación por métodos colorimétricos. Objetivo general Determinar la actividad enzimática de lacasas y relacionarla con su función como agentes de biorremediación. Objetivos específicos • Determinar el crecimiento de diversas cepas de hongos ligninolíticos en presencia de petróleo. • Determinar la actividad de lacasa de los hongos crecidos en el inciso anterior.
- 62. Manualdebiotecnología|práctica10 62 Parte I. Monitoreode la actividad de lacasas en hongos tolerantes a petróleo Material y equipo Material Reactivos 1 mechero Petróleo crudo Maya 2 vasos de precipitados de 1,000 ml K2 HPO4 1 probeta de 1,000 ml MgSO4 •7H2 O 3 matraces Erlenmeyer de 1,000 ml Lecitina de soya Bisturí KCl * 24 cajas Petri de 45 mm de diámetro Agar * Frasco de vidrio de boca ancha de 500 ml (previa- mente esterilizado) (de café Oro) ABTS (2,2’-azinobis 3 etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico) * Papel aluminio Carbonato de calcio * Jugo V8 Equipo Autoclave Incubadora Cámara fotográfica Balanza *Material que deberán traer los alumnos Material biológico Cepa de hongo resistente a petróleo Cepa de hongo no resistente a petróleo Metodología Preparación del medio V8 + petróleo crudo Maya y crecimiento de hongos 1. En un vaso de precipitados preparar como se enlista a continuación: Reactivo Por litro de volumen final Jugo V8 180 ml CaCo3 2.0 g Agar 20 g Composición del medio V8 2. Aforar a 1,000 ml y dividir en dos matraces con 500 ml c/u. A uno de ellos se le agre- ga lecitina de soya (0.25% p/v). Esterilizar ambos matraces durante 15-20 min a una temperatura de 120 °C y 1 atm de presión. 3. Al salir de la autoclave y mientras sigue caliente el medio que contiene lecitina de soya, se vacía en el frasco de vidrio de boca ancha y se agrega 20 g de petróleo crudo Maya, para una concentración final de 200 000 partes por millón (ppm). Agitar vigo- rosamente hasta alcanzar un mezclado homogéneo.
- 63. Degradacióndecompuestosxenobióticosatravésdeactividadesenzimáticas|práctica10 63 4. Se vacían~ 10 ml de medio con petróleo en cada caja Petri (45 mm de diámetro) y lo mismo del medio sin petróleo. 5. Los micelios de los dos tipos de hongos se siembran tomando un fragmento de 4×4 mm de la caja original, inoculando por triplicado en las cajas V8 con y sin petróleo bajo condiciones de esterilidad. 6. Los hongos se dejan crecer 30 días a temperatura ambiente y se observa el resultado. Nota: Para llevar a cabo la segunda parte se utilizarán los hongos tolerantes y no tolerantes cultivados en medio V8 de esta primera parte de la práctica. Resultados La cepa del hongo tolerante a petróleo deberá crecer de manera similar a la condición control, mientras que el crecimiento de la cepa no tolerante se notará afectado. Anotar las observaciones, teniendo en cuenta los siguientes puntos: 1. ¿Qué mecanismos son los responsables de comportamientos diferentes en los hon- gos bajo estas condiciones? 2. ¿Qué efectos tendrá el petróleo en los organismos vivos? Parte II. Actividad enzimática Los hongos cuentan con diversas enzimas extracelulares que les permiten degradar ciertos compuestos, entre estas enzimas se encuentran las lacasas, que están involucradas en la transformación de una amplia variedad de compuestos fenólicos. Con base en esto se pretende probar la capacidad ligninolítica de estos hongos a través de un ensayo colorimétrico, en donde un sustrato es oxidado (cambiará el color del sustrato como indicador) en presencia de la enzima lacasa. Material y equipo 1. Preparación del medio mineral 20X + ABTS [1mM] modificado de Olsson, 2001. Composición del medio mineral 20X (stock 1 L): Reactivo Por litro de volumen final K2 HPO4 2 g MgSO4 ·7H2 O 2 g KCl 2 g En un vaso de precipitados, preparar: Reactivo Por litro de volumen final Stock medio mineral 20X 50 ml ABTS [1mM] 0.5487 g Agar 20 g
- 64. Manualdebiotecnología|práctica10 64 Nota: Este medioes sólo para la determinación de actividad, la abundancia del hongo no es relevante. 2. Aforar a 1 litro con agua destilada. Transferir a un matraz Erlenmeyer y esterilizar durante 15–20 min. a una temperatura de 120 o C y 1 atm de presión. Vaciar 10 ml de medio en cada caja Petri (45 mm de diámetro). Colocar a 4 o C en oscuridad (envolver con papel aluminio). 3. Se toman micelios de los hongos ya crecidos en las cajas con medio V8 y se cortan en cuadros de 1 cm2 ; se inoculan en el medio mineral 20X + ABTS [1mM]. Se incuban durante una semana a 28 o C. en ausencia de luz, cubriendo las cajas con papel alu- minio. El ensayo se lleva a cabo por triplicado. Resultados El ABTS oxidado por la lacasa se vuelve visible cuando el medio cambia la coloración a verde o azul oscuro, por lo que la cepa del hongo tolerante a petróleo deberá hidrolizar al ABTS, mien- tras que la cepa no tolerante no tendrá reacción alguna. De acuerdo con lo observado, responder: 1. ¿Qué relación tiene el ABTS con el petróleo? 2. ¿Por qué cambia de color el ABTS en presencia de la lacasa? Bibliografía Baldrian P. (2006), “Fungal laccases - occurrence and properties”, FEMS Microbiol 30: 215-242. Field, J.A., E. De Jong, G. Feijoo-Costa, y J.A.M. De Bont (1993), “Screening for ligninolytic fungi applicable to the biodegradation of xenobiotics”. Trends Biotechnol 11: 44-49. Rojas-Avelizapa, N., E. Olvera-Barrera y L. Fernández-Linares (2005), “Feasibility study of biore- mediation of a drilling-waste-polluted soil: Stimulation of microbial activities and hydro- carbon removal”. Journal of environmental science and health, Part A, Toxic/hazardous substances & environmental engineering 40: 2189-2201. Margesin, R., A. Zimmerbauer y F. Schinner (2000), “Monitoring of bioremediation by soil biolo- gical activities”, Chemosphere 40: 339-346.
- 65. Cultivo de tejidos vegetales Seconoce como cultivo de células vegetales a una serie de técnicas encaminadas a conseguir la reproducción de células, tejidos u órganos de una planta bajo condiciones controladas y asépticas. Mediante el empleo de estas estrategias se puede reproducir una gran cantidad de plantas completas, en poco tiempo y espacio, a partir de pequeñas porciones de una sola planta. La reproducción de plantas in vitro puede darse por dos rutas: organogénesis y embrio génesis somática. En la organogénesis las plantas se reproducen por formación secuencial de órganos vegetales. Primero tallo y hojas y después raíces. La embriogénesis somática involucra la formación de pequeñas semillas, llamadas embriones bipolares (porque tiene la capacidad de dar origen a raíces y tallos), que pueden germinar y formar plantas completas. Solo excepcionalmente es posible reproducir a una especie por las dos rutas, por lo gene- ral, una de estas técnicas de propagación in vitro es la elegida porque es más eficiente que la otra, o incluso porque es la única que produce plantas completas y fértiles. Pueden iniciarse cultivos a partir de hojas, tallos o raíces de plantas crecidas en suelo, pero los mejores resultados en los cultivos de tejidos vegetales se obtienen cuando se emplean como explantes tejidos de plantas que han sido germinadas in vitro en condiciones estériles. Esto ocurre porque los tratamientos de desinfección pueden ser más severos en semillas que en órganos de las plantas, ya que las primeras cuentan con una o varias cubiertas que prote- gen a las células meristemáticas del efecto de los agentes antisépticos.
- 66.
- 67. 67 Fitorremediación con helechos Práctica11 Introducción La polución de ambientes naturales con metales pesados es un problema muy complejo que ha llevado a la búsqueda de estrategias menos costosas y más efectivas que las utilizadas hasta ahora para su control. La eliminación biológica de contaminantes de los ambientes na- turales es sin lugar a duda la mejor alternativa disponible. Los contaminantes orgánicos como el petróleo, aguas residuales, agrícolas y pesticidas son generalmente susceptibles a ser degra- dados por microorganismos; pero los contaminantes inorgánicos como los metales pesados, nitratos, cianuros y los isótopos radioactivos son más difíciles de tratar. Una posibilidad muy promisoria de biorremediación para elementos tóxicos se encuentra en el empleo de especies vegetales para remover contaminantes de los ecosistemas. La fitorremediación es una tecnología emergente que utiliza a plantas y a los microorga- nismos asociados a la rizósfera para remover, transformar o contener sustancias contaminan- tes localizadas en suelos, sedimentos, acuíferos, cuerpos de agua superficiales e incluso en la atmósfera. Las plantas son el grupo biológico con las más altas capacidades biosintéticas de la tierra, por lo cual pueden transformar y mineralizar una amplia variedad de complejos orgánicos. En el caso de los contaminantes orgánicos, la meta de la fitorremediación es la minera- lización de las sustancias hasta componentes no tóxicos (fitodegradación o fitotransforma- ción). Los contaminantes elementales, que incluyen metales tóxicos y radio nucleótidos, son esencialmente inmutables a la acción enzimática. Las plantas sin embargo pueden secues- trarlos y almacenarlos en sus tejidos (fitoextracción y fitoacumulación). La eliminación biológica de contaminantes ambientales se lleva a cabo generalmente por organismos que han logrado adaptarse a las condiciones particulares del sitio a tratar. Las plantas silvestres que crecen en sitios contaminados con metales pesados pueden ser una fuente muy importante de posibilidades para la biorremediación. Uno de los grupos biológi- cos más resistentes a la presencia de contaminantes elementales son los helechos. Pteridium aquilinum (L.) Kuhn es un helecho silvestre ampliamente distribuido en todo el mundo. Es una especie heliófila, pionera, que tiene propiedades alelopáticas, fungicidas, antibacterianas y cancerígenas. Esta planta se encuentra como especie dominante en zonas perturbadas o con una alta concentración de cromo -el cromo hexavalente es un agente mu- tagénico y altamente cancerígeno que tiene efectos adversos para la salud humana y animal, lo cual sugiere su gran potencial como especie útil para la fitorremediación de suelos conta- minados.
- 68. Manualdebiotecnología|práctica11 68 Objetivo general Determinar latolerancia a cromo VI de los gametofitos de Pteridium aquilinum. Objetivos específicos 1. Probar el efecto de diferentes concentraciones de cromo VI sobre la germinación de esporas de Pteridium aquilinum. 2. Determinar cuál es el efecto del cromo VI sobre el desarrollo de gametofitos y su maduración. 3. Probar el efecto del cromo sobre el desarrollo de esporofitos. Material y equipo Material Equipo Vórtex Autoclave Micropipeta de 1,000 µl Microcentrífuga Mechero Potenciómetro 10 tapas para frascos Gerber Balanza analítica Puntas para micropipetas de 1,000 µL estériles Campana de flujo laminar Microtubos de 2 ml estériles Incubadora de vegetales Papel filtro estéril Microscopio estereoscópico Embudo de cristal estéril Cámara digital 6 filtros Millipore con membrana de 0.22 µm estériles Reactivos * 1 paquete de cajas Petri de 10 cm de diámetro es- tériles Medio MS * 1 espátula delgada Sacarosa * 10 frascos Gerber grandes Agar * Papel aluminio Dicromato de potasio * 2 pinzas largas estériles Alcohol etílico * Un frasco de vidrio con algodón * Cloro * Un rollo de plástico Parafilm o Plastipack * Material que deberán traer los alumnos. Material biológico Esporas de Pteridium aquilinum Metodología Los experimentos se llevarán a cabo empleando un medio de cultivo ms (Murashige y Skoog) modificado —se emplea solo la mitad de la concentración de macronutrientes— (ver anexo). Se ajustará el pH del medio a 5.7 con HCl y KOH 1N y se esterilizará en autoclave durante 20
- 69. Fitorremediaciónconhelechos|práctica11 69 minutos a 1200 C. El medio de cultivo se deja enfriar. Cuando llegue a 55 o 60 0 C se agregarán di- ferentes concentraciones de dicromato de potasio (0, 25, 50, 100, 150, 200 µm) esterilizado por filtración con membranas Millipore de 0.22 µm (cada equipo probará uno de los tratamientos). Germinación de esporas in vitro 1. Se colocan 90 mg de esporas en un microtubo de 2 ml que contiene 1.5 ml de una solución de hipoclorito de sodio al 0.3%. 2. El tubo se agita vigorosamente durante dos minutos en un agitador Vórtex. Nota: Es importante que la solución de hipoclorito de sodio se prepare en el momento en que va a usarse y que las esporas no permanezcan en la solución un tiempo mayor al indicado. 3. Se centrifuga el tubo en microcentrífuga durante un minuto a 14 000 rpm. Nota: Antes de centrifugar debe tenerse listo un tubo con 1.5 ml de agua para equilibrar la centrífuga. A partir de este punto el procedimiento se realiza en condiciones estériles. 4. Se vierte el sobrenadante con las esporas suspendidas, en un papel filtro estéril colo- cado en un embudo de vidrio. 5. Las esporas que se encuentran adheridas al papel filtro se enjuagan tres veces con 5 ml de agua destilada estéril. 6. El papel filtro se coloca en una caja de Petri estéril. 7. Las esporas se resuspenden en 10 ml de agua destilada. 8. Se inoculan 250 µl de suspensión de esporas de P. aquilinum, en cajas de Petri de 10 cm de diámetro con 25 ml de medio de cultivo semisólido. 9. Los bordes de las cajas se sellan usando un rollo de plástico (Parafilm o Plastipack). 10. Las cajas se mantendrán en una cámara de incubación a 25 ºC, en foto-periodo de 16 horas luz 8 oscuridad, bajo lámparas fluorescentes. Inducción de formación de esporofitos 11. Después de 21 días de sembradas las esporas, los gametofitos se transplantan a frascos Gerber con el mismo medio utilizado en la germinación, los gametofitos se riegan con 1 ml de agua destilada cada semana hasta la aparición de los esporofitos La respuesta se evaluará a los 7, 14, 21 y 56 días después de la siembra, por el porcentaje de germinación de las esporas y la capacidad de desarrollar gametofitos y esporofitos. Los resultados de todos los equipos se reunirán y el reporte de la práctica se hará con el resul- tado de todos los experimentos. Para determinar el porcentaje de germinación de las esporas y el desarrollo protálico, se observan los cultivos en un microscopio estereoscópico (a 320 aumentos) y se toman cuatro fotografías de diferentes campos (de cada caja Petri), a los 7, 14 y 21 días después de la siem- bra. Se considera que una espora ha germinado cuando aparece la célula rizoidal (ver figura). A los 56 días después de la siembra se determina en cuáles de los tratamientos se desarrollaron esporofitos.
- 70. Manualdebiotecnología|práctica11 70 Espora trilete (a).Germinación tipo Vittaria, dos a cinco días (b). Filamentos cortos de cuatro a seis células, seis días (c). Gametofito espatulado, ocho días (d). Gametofito cordiforme, desnudo, con simetría bilateral y meristemo apical, 11 días (e). Gametofito masculino con anteridios en la superficie ventral de la lámina, entre los rizoides, 13 días (f). Acercamiento de los anteridios (g). Morfología del anteridio, mostrando la célula basal, la célula media y la célula opercular (h). Gametofito femenino con los arquegonios cerca de la muesca, 17 días (i). Cuello del arquegonio con cuatro células (j). Gametofito monoico, 21 días (k). Gametofitos dioicos con dimorfismo sexual marcado: masculinos (♂), pequeños con alas poco desarrolladas, femeninos (♀) de talla mayor con alas amplias (l). an= anteridio, ar= arquegonio, cb= célula basal, cm= célula media, co= célula opercular, cr= célula rizoidal, cu= cuello, es= espora, fi= filamento, me= meristemo, mu= muesca, ri= rizoide.
- 71. Fitorremediaciónconhelechos|práctica11 71 Resultados Tabla 1. Efecto de diferentes concentraciones de cromo VI sobre la germinación de esporas de P. aquilinum Tratamiento * Porcentaje de germinación (siete días) Caja 1 Caja 2 Caja 3 Caja 4 Caja 5 Promedio Control Cromo VI 25 μM Cromo VI 50 μM Cromo VI 100 μM Cromo VI 150 μM Cromo VI 200 μM Tratamiento * Porcentaje de germinación (14 días) Caja 1 Caja 2 Caja 3 Caja 4 Caja 5 Promedio Control Cromo VI 25 μM Cromo VI 50 μM Cromo VI 100 μM Cromo VI 150 μM Cromo VI 200 μM Tabla 2. Evaluación del desarrollo protálico de los gametofitos de P. aquilinum por tratamien- to *(Cromo VI 25 µM) Tratamiento * Porcentaje (14 días) Caja 1 Caja 2 Caja 3 Caja 4 Caja 5 Promedio Gametofito filamentoso Gametofito laminar Gametofito maduro Tratamiento * Porcentaje (21 días) Caja 1 Caja 2 Caja 3 Caja 4 Caja 5 Promedio Gametofito filamentoso Gametofito laminar Gametofito maduro * Cada equipo reporta sólo sus resultados
- 72. Manualdebiotecnología|práctica11 72 Tabla 3. Efecto de diferentes concentraciones de cromo VI sobre el desarrollo protálico de los gametofitos de P. aquilinum. Etapa Porcentaje (14 días) 0 µM 25 µM 50 µM 100 µM 150 µM 200 µM Gametofito filamentoso Gametofito laminar Gametofito maduro Etapa Porcentaje (21 días) 0 µM 25 µM 50 µM 100 µM 150 µM 200 µM Gametofito filamentoso Gametofito laminar Gametofito maduro Discusión Temas que se sugieren para el análisis: 1. ¿Cuál es la ventaja de la fitorremediación sobre otros métodos de limpieza de sitios contaminados? 2. ¿Cuáles son las condiciones más importantes que pueden influir en el proceso de germinación de las esporas? 3. ¿Cuál es la condición indispensable para que los anterozoides realicen la fecunda- ción de las oosferas? 4. Comparar los resultados obtenidos y los reportados en la literatura con otras espe- cies vegetales. 5. ¿Pteridium aquilinum es una especie prometedora para la fitorremediación de sue- los contaminados con metales pesados? 6. ¿Cuál es la fase haploide y cuál la diploide en el ciclo de vida de los helechos? 7. ¿Cuál es la ventaja que puede tener hacer selección de organismos haploides en un sistema de mejoramiento genético de esta especie? Bibliografía Arthur, E., P. Rice, T. Anderson, S. Baladi, K. Henderson y J. Coats (2005), “Phytorremediation-An overview”, Critical Review in Plant Science 24:109-122. Cervantes, C., J. Campos-García, S. Devars, F. Gutiérrez-Corona y H. Loza-Tavera (2001), “Inte- ractions of chromium with microorganisms and plants”, FEMS Microbiology Reviews 25: 335 – 347. Gomez V. y M.P. Callao (2006), “Chromium determination and speciation since 2000”, Trends in Analytical Chemistry 25: 1006-1015. Lewandowski, I., U. Schmidt, M. Londo y A. Faaij (2006), “The economic value of the phytore- mediation function-assessed by the example of cadmium remediation by willow (Salix spp.)”, Agricultural Systems. 89: 68-89. Lone, M.I., Z. He, P.J. Stoffella y X. Yang (2008), “Phytoremediation of heavy metal polluted soils and water: Progresses and perspectives”, J. Zhejiang Univ. (Sci B) 9:210-220. Padmavathiamma, P.K. y L.Y. Li, (2007), “Phytoremediation technology: Hyper-accumulation metals in plants”, Water, Air, Soil Pollut 184:105-126.
- 73. Inducciónydesarrollodeembrionessomáticosdezanahoria|práctica12 73 Inducción y desarrollode embriones somáticos de zanahoria Práctica 12 Introducción Durante la embriogénesis somática las células en cultivo experimentan un proceso de desa- rrollo similar al que ocurre en las plantas cuando se forman las semillas. El desarrollo de un embrión tanto in vivo como in vitro está codificado por los mismos genes. La embriogénesis somática es un proceso complejo regulado por tres programas genéticos que se prenden de forma secuenciada y son los responsables de la formación de tejido competente para la em- briogénesis, del desarrollo y la maduración de los embriones. La obtención de un embrión ma- duro, fértil y bien desarrollado depende de que estos programas se enciendan en el momento adecuado. Generalmente, la producción de embriones somáticos se divide en tres etapas: En la pri- mera, conocida como inducción, se induce el desarrollo de un tejido embriogénico. Sometidas a los estímulos adecuados, las células meristemáticas suelen dar dos tipos de respuestas: a) se multiplican y generan una masa desorganizada de células que recibe el nombre de callo embriogénico (porque tiene capacidad potencial de generar embriones), o bien, b) se dividen para formar directamente embriones. Cuando se obtiene callo embriogénico es necesario es- timular el desarrollo de los embriones. Durante la etapa de desarrollo, el callo embriogénico se transplanta a un nuevo medio de cultivo, donde se estimula a los cúmulos de células poten- cialmente embriogénicos para que experimenten un proceso completo de desarrollo y formen embriones. En ocasiones se somete a los embriones a un proceso de maduración. Durante este pro- ceso se almacenan en los cotiledones sustancias de reserva y el embrión pierde paulatina- mente humedad. La maduración de los embriones mejora la eficiencia de germinación y es muy conveniente cuando los embriones no están destinados a producir de inmediato plantas completas, también hay semillas sintéticas que emplean otros propágulos: brotes (tallos con algunas hojas) o raíces, los cuales pueden generar después de uno o varios pasos de cultivo in vitro plantas completas. Pero la mayor parte de las veces, las plantas se generan directamente por germinación de embriones sin madurar. Como los requerimientos de cultivo de estas tres etapas son distintos, se ocupan en las diferentes etapas, medios de cultivo diferentes. El principal modelo de estudio de la embriogénesis somática es la zanahoria. Esta posi- bilidad tecnológica se descubrió precisamente en esta especie. Steward, en 1958 y Reinert en 1959, observaron que las células de zanahoria crecidas en un cultivo de callos en suspensión, tenían la capacidad de formar unidades estructurales discretas, con una forma de desarrollo similar a la que presentan los embriones cigóticos. Si estos embriones se ponían en condicio- nes adecuadas, germinaban y producían plantas completas. Ellos llamaron a estos propágulos embriones somáticos.
- 74. Manualdebiotecnología|práctica12 74 Objetivo general Obtener embrionessomáticos de zanahoria. Objetivos específicos • Germinar semillas de zanahoria en condiciones estériles. • Probar el efecto de diferentes concentraciones de 2,4-D sobre la inducción de callo embriogénico de zanahoria. • Determinar cuál es el mejor explante para la inducción de callos embriogénicos de zanahoria. • Probar el efecto de la concentración de sacarosa y la fuente de nitrógeno en el desa- rrollo de embriones somáticos de zanahorias. Material y equipo Material Equipo 1 espátula estéril Autoclave 30 tapas para frascos Gerber Potenciómetro Pinzas largas estériles Balanza analítica 2 mecheros Incubadora de vegetales 2 mallas de acero inoxidable estériles Campana de flujo laminar *1 paquete de cajas Petri estériles *12 frascos Gerber grandes de boca ancha (125 ml) Reactivos *Mango para bisturí del no. 4 Medio MS 2, 4-D (2, 4 ácido diclorofenoxiacético) Alcohol etílico al 70% *5 hojas para bisturí estériles del no. 21 o 22 Agar *Papel aluminio Sacarosa *Una caja de cartón L-glutamina *Un rollo de plástico Parafilm o Plastipack Cloro al 30% HCl 1N Material biológico KOH 1N Semillas de zanahoria *Material que deberán traer los alumnos Metodología Los experimentos se llevarán a cabo empleando el medio de cultivo básico ms (ver anexo), al que se le agregarán distintas concentraciones de hormonas de crecimiento en los diferentes experimentos efectuados. En todos los casos se ajustará el pH del medio a 5.7 con HCl y KOH 1N y se esterilizará en autoclave durante 20 minutos a 120 o C.
- 75. Inducciónydesarrollodeembrionessomáticosdezanahoria|práctica12 75 El proceso deinducción de embriogénesis somática se efectuará en tres etapas: germina- ción in vitro de semillas, inducción de callo embriogénico y embriogénesis. PARTE I. Germinación de semillas in vitro Desinfección de semillas 1. Las semillas se colocan en una solución jabonosa ligera (una pizca de cualquier de- tergente) y se agitan durante un minuto para eliminar basura y polvo. 2. Se colocan en un colador de acero inoxidable y se enjuagan con agua corriente hasta que se elimine el detergente por completo. 3. Se bañan con alcohol al 70% para eliminar aceites, grasas y ceras 4. Se sumergen en una solución al 30% de hipoclorito de sodio (a partir de la solución comercial). Las semillas se mantienen en la solución de cloro durante 20 minutos en agitación constante. Es muy importante que las semillas no permanezcan más tiempo en la solución. 5. En la campana de flujo laminar, se remueve la solución con ayuda de un colador de acero inoxidable estéril. 6. Las semillas se enjuagan tres veces con agua destilada estéril. 7. Las semillas quedan listas para ser sembradas en el medio de cultivo. Cultivo in vitro Se emplearán frascos de 125 ml con 25 ml de medio de cultivo básico ms semisólido (ver anexo) adicionado con 30 g de agar y 8 g de sacarosa. 1. El frasco se destapa y la tapa se coloca hacia arriba cerca del mechero 2. Con ayuda de las pinzas se colocan cinco semillas en cada frasco (cada equipo sem- brará cinco frascos). Nota: Las pinzas, después de usarse, se colocan en un frasco con alcohol (al frasco que con- tiene alcohol se le pone un poco de algodón en el fondo para que no se confunda con los frascos de agua). Antes de volver a usar las pinzas, se flamean y cuando el alcohol remanente se apaga, se sumergen en un frasco con agua destilada estéril para que se enfríen. 3. Se toma la tapa con las pinzas, se pasa rápidamente por la flama y se tapa el frasco con las semillas. 4. Los bordes de las tapas se sellan usando un rollo de plástico (Parafilm o Plastipack). 5. Los frascos se mantendrán en una cámara de incubación a 25 °C en foto-periodo de 16 h luz/8 h oscuridad, bajo lámparas fluorescentes. 6. Después de seis semanas de cultivo las plantas están listas para utilizarse como ex- plantes. PARTE II. Inducción de callo embriogénico 1. Se probarán tres tratamientos para la inducción de callo embriogénico: Medio semi- sólido ms (ver anexo) con 1, 1.5 y 2 mg/L de 2,4-D. 2. En todos los casos se colocarán cinco explantes en caja Petri con 25 ml de medio. Se ocuparán porciones de tallos, raíces y hojas (de plantas germinadas in vitro de dos meses de edad) como explantes. Se harán cinco repeticiones por tratamiento. 3. Las cajas se mantendrán a 25 °C bajo condiciones de oscuridad (cada equipo probará uno de los tratamientos).
- 76. Manualdebiotecnología|práctica12 76 4. La respuestase evaluará después de cinco semanas de tratamiento por la presencia de callo embriogénico y la frecuencia de respuesta. Los resultados de todos los equipos se reunirán y el reporte de la práctica se hará con el resultado de todos los experimentos. PARTE III. Embriogénesis 1. Se probarán cuatro tratamientos para el desarrollo de embriones somáticos de zana- horia: Medio ms con 3% de sacarosa, medio ms con 6% de sacarosa, medio ms con 3% de sacarosa y 750 mg/L de L-glutamina y medio ms con 6% de sacarosa y 750 mg/L de L-glutamina (cada equipo probará uno de los tratamientos). 2. En cajas de Petri con 25 ml de medio nutritivo se colocarán cuatro porciones de callo (del mejor callo obtenido en la etapa de inducción, se harán tres repeticiones por tratamiento). 3. Las cajas se mantendrán en las condiciones antes descritas durante cuatro semanas, el resultado se evaluará por la presencia de embriones somáticos en estado cotile- donario. Los resultados de todos los equipos se reunirán y el reporte de la práctica se hará con el resultado de todos los experimentos. Resultados Germinación de semillas Día Frasco 2 4 6 8 10 12 14 16 1 2 3 4 5 Promedio DS Germinación Germinación (%) No.desemillasgerminadas Días Gráfica de velocidad de germinación
- 77. Inducciónydesarrollodeembrionessomáticosdezanahoria|práctica12 77 Inducción de calloembriogénico* Presencia de callo embriogénico por explante** Frasco 1 mg/L de 2,4-D 1.5 mg/L de 2,4-D 2.0 mg/L de 2,4-D 1 2 3 4 5 Total % de respuesta por explante * La evaluación se hace a las cinco semanas de tratamiento ** Las tablas deben tener los resultados de todos los equipos Desarrollo de embriones somáticos* Número de brotes por explante** Frasco 3% de sacarosa 6% de sacarosa 3% de sacarosa 750 mg/L de glutamina 6% de sacarosa 750 mg/L de glutamina 1 2 3 4 5 No. de brotes por tratamiento * La evaluación se hace a las cuatro semanas de tratamiento Las tablas deben tener los resultados de todos los equipos ** Se emplearán como explante los mejores callos obtenidos en la etapa anterior Análisis 1. ¿A qué se llama células totipotenciales? 2. ¿Qué son los meristemos? 3. ¿Cuáles son los factores que determinan la inducción de un cultivo embriogénico? 4. ¿Qué características debe tener un tejido que se usa como explante para embriogé- nesis somática? 5. ¿Cuáles son los factores más importantes durante el desarrollo de embriones somá- ticos?
- 78. Manualdebiotecnología|práctica12 78 Bibliografía Berleth, T. yS. Chatfield, (2002), “Embryogenesis: Pattern formation from a single cell”, Arabi- dopsis Book 7: 1-22. Feher, A., T.P. Pasternak, y D. Dudits, (2003), “Transition of somatic plant cells to an embryogenic state”. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 74: 201-228. Jimenez, V.M. (2005), “Involvement of plant hormones and plant growth regulators on in vitro somatic embryogenesis”. Plant Growth Regulation 47: 91-110. Murashige, T. y F. Skoog (1962), “A revised medium for rapid growth and bioassays with tobac- co tissue culture”. Physiol Plant 15: 473- 497. Rose, R.J. y K.E. Nolan (2006) Genetic regulation of somatic embryogenesis with particular refe- rence to Arabidopsis thaliana and Medicagotruncatula”. In Vitro Cellular and Developmen- tal Biology – Plant 42: 473-481. Invited review. Thorpe, T.A. (2007), “History of plant tissue culture”. Molecular Biotechnology 37: 169-180.
- 79. Organogénesissomáticadenicotianaglauca|práctica13 79 Organogénesis somática de Nicotianaglauca Práctica 13 Introducción La organogénesis somática ha resultado ser una herramienta muy valiosa para la propagación comercial de cultivos industriales, plantas ornamentales y hortalizas. Las condiciones de orga- nogénesis son variables para cada especie vegetal. El enfoque empírico que ha sido extensa- mente usado en estudios in vitro de organogénesis ha mostrado que el proceso depende princi- palmente de tres factores, la elección del explante, el medio de cultivo y el control del ambiente físico. La manipulación de estos factores lleva a la inducción del desarrollo organizado. En general es mejor utilizar explantes jóvenes con crecimiento activo y con meristemos abundantes. Las hojas y los nudos de los tallos suelen dar muy buenos resultados. Cuando los explantes se colocan en un medio de cultivo con ciertas hormonas vegetales, generalmente citocininas (solas o en combinación con una proporción mucho menor de auxinas), los brotes axiales emergen y forman un agrupamiento de brotes. Una vez que estos brotes se desarro- llan pueden subdividirse en grupos más pequeños o brotes individuales que pueden a su vez cultivarse en medio fresco con auxinas, para inducir la formación de raíces. Los explantes de hoja de tabaco (Nicotiana tabacum L.) pueden formar brotes o raíces directamente, dependiendo de las fitohormonas presentes en el medio. La organogénesis de novo inicia a partir de células en división activa localizadas en los centros meristemáticos de las plantas, células que generan primordios que finalmente formarán brotes y raíces. El proceso de organogénesis ocurre en diferentes etapas que incluyen: la adquisición de competencia, la inducción o determinación de una ruta morfogenética particular y la diferen- ciación morfológica y el desarrollo. La determinación se completa cuando el tejido es capaz de continuar su programa de desarrollo en ausencia de reguladores de crecimiento exógenos. Recientemente se ha encontrado que los explantes de hojas de tabaco requieren permanecer de cuatro a seis días en el medio de cultivo para que se determine la formación de brotes y sólo requieren un día en el medio de cultivo para que se determine la formación de raíces. Nicotiana glauca es una planta perteneciente a la familia Solanaceae con una amplia distribución en México y el mundo. Es una especie con rápido crecimiento y alta producción de biomasa que produce alcaloides repelentes de herbívoros. Esta planta se comporta como pionera en ecosistemas perturbados y resiste concentraciones elevadas de diversos contami- nantes. Existen varios estudios que reportan su capacidad de retener en sus tejidos altas con- centraciones de Pb, Zn, Cd y Co. Por estas características, N. glauca es considerada un modelo ideal para llevar a cabo estudios de fitorremediación. Por tratarse de una especie silvestre, su empleo en biorremediación de suelos contami- nados depende en gran medida del desarrollo de un protocolo eficiente de reproducción para la especie.
- 80. Manualdebiotecnología|práctica13 80 Objetivo general Obtener plantascompletas a partir de cultivos in vitro de Nicotiana glauca por organogénesis somática Objetivos específicos 1. Probar el efecto de diferentes concentraciones de bencil aminopurina (Bap) en com- binación con ácido naftalenoacético (Ana) sobre la inducción de brotes adventicios de tabaco. 2. Determinar cuál es el mejor explante para la inducción de brotes. 3. Probar el efecto de la composición del medio de cultivo en la rizogénesis de los bro- tes obtenidos. Material y equipo Material Equipo 2 mecheros Autoclave 30 tapas para frascos Gerber Potenciómetro Tubos eppendorf de 1.5 ml Balanza analítica 1 espátula estéril Incubadora de vegetales Pinzas largas estériles Campana de flujo laminar 1 jeringa hipodérmica estéril Reactivos *1 paquete de cajas Petri estériles de 10 cm de diámetro Sales del medio ms *15 frascos Gerber grandes de boca ancha Sacarosa *Papel aluminio Agar *Algodón Ana *Mango para bisturí del número 4 Bap *5 hojas para bisturí estériles del no. 21 o 22 Alcohol etílico 70% *Un rollo de plástico Parafilm o Plastipack HCl 1N Material biológico KOH 1N Semillas de N. glauca Cloro 30% *Material que deberán traer los alumnos Metodología Los experimentos se realizarán empleando el medio de cultivo básico ms (Murashige y Skoog, al que se le agregarán distintas concentraciones de hormonas de crecimiento en los diferentes experimentos efectuados. En todos los casos se ajustará el pH del medio a 5.7 con HCl y KOH 1N y se esterilizará en autoclave durante 20 minutos a 120 0 C. El proceso de inducción de organogénesis somática se efectuará en tres etapas: germina- ción in vitro de semillas, inducción de brotes y rizogénesis.
- 81. Organogénesissomáticadenicotianaglauca|práctica13 81 Parte I. Germinaciónde semillas in vitro Desinfección de semillas • Las semillas se colocan en un microtubo de 1.5 ml con una solución jabonosa ligera (una pizca de cualquier detergente) y se agitan durante un minuto para eliminar basura y polvo. • Con ayuda de una jeringa hipodérmica se retira la solución jabonosa (cuidando no succionar las semillas, que deben permanecer en el fondo). • Se enjuagan las semillas con agua corriente empleando una jeringa hipodérmica, hasta eliminar el detergente por completo. • Se bañan con alcohol al 70% durante un minuto para eliminar aceites, grasas y ceras. • Se adiciona a las semillas una solución al 30% de hipoclorito de sodio (a partir de la solución comercial) que debe prepararse en ese momento y se mantienen en la solu- ción de cloro durante 20 minutos en agitación constante. Es muy importante que las semillas no permanezcan más tiempo en la solución. • En la campana de flujo laminar se remueve la solución con ayuda de una jeringa hipodérmica estéril. • Empleando la jeringa estéril, se enjuagan las semillas tres veces con agua destilada estéril. • Las semillas quedan listas para ser sembradas en el medio de cultivo. • Deben sembrarse las semillas inmediatamente en los frascos con medio de cultivo. Parte II. Cultivo in vitro Se emplearán frascos Gerber de 125 ml con 25 ml de medio de cultivo básico Murashige y Skoog (1962) semisólido, adicionado con 30 g de agar y 8 g de sacarosa. • El frasco se destapa y la tapa se coloca hacia arriba cerca del mechero. • Con ayuda de unas pinzas y una espátula delgada estériles, se colocarán entre 10 y 15 semillas en cada frasco (cada equipo sembrará 5 frascos). Nota: Las pinzas y la espátula después de usarse se colocan en un frasco con alcohol (al frasco que contiene alcohol se le pone un poco de algodón en el fondo para que no se confunda con los frascos de agua). Antes de volverse a usar, las pinzas y la espátula se flamean, cuando el alcohol remanente se apaga, se sumergen en un frasco con agua destilada estéril para que se enfríen. • Se toma la tapa con las pinzas, se pasa rápidamente por la flama y se tapa el frasco con las semillas. • Los bordes de las tapas se sellan usando un rollo de plástico (Parafilm o Plastipack). • Los frascos se mantendrán en una cámara de incubación a 25 o C, en foto-periodo de 16 h luz 8 h oscuridad, bajo lámparas fluorescentes. • Después de 6 semanas de cultivo las plantas estarán listas para utilizarse como ex- plantes.
- 82. Manualdebiotecnología|práctica13 82 Parte III. Inducciónde brotes Se probarán seis tratamientos (uno por equipo) para la inducción de brotes en hojas y raíces de N. glauca: Tratamiento bap (mg/L) ana (mg/L) 1 0.5 0.0 2 1.0 0.0 3 2.0 0.0 4 0.5 0.1 5 1.0 0.1 6 2.0 0.1 Se emplearán como explantes hojas y raíces provenientes de plantas germinadas in vitro de dos meses de edad. Cada equipo sembrará cinco frascos con raíces y cinco frascos con hojas. Los experimentos se evaluarán después de cinco semanas de tratamiento por la frecuencia de respuesta y el número de brotes obtenidos por explante. Los reportes de las prácticas deben contener los resultados de los experimentos efectuados por todos los equipos. Parte IV. Rizogénesis Para la inducción de raíces en los brotes obtenidos se probará el efecto de la osmolaridad del medio de cultivo sobre el desarrollo de raíces. Se utilizarán como medio de inducción: el medio ms completo, el medio ms con la mitad de los macronutrientes y el medio ms con un cuarto de los macronutrientes. Los brotes más desarrollados obtenidos en la etapa anterior se emplearán como explan- tes. Se sembrarán tres brotes por frasco, cinco frascos por tratamiento (un tratamiento por equipo). La respuesta se evaluará después de cuatro semanas de tratamiento por la frecuencia de respuesta y la biomasa fresca promedio de las raíces obtenidas. Resultados Inducción de brotes de N. glauca* Tratamiento** % de respuesta Número de brotes por explante*** Número de brotes por tratamiento Grado de desarrollo de los embriones 1 2 3 4 5 6 * La respuesta se evaluará después de cinco semanas de tratamiento ** Se incluirán los resultados de todos los equipos *** El resultado debe incluir desviación estándar. Los valores deberán estar seguidos por letras (a-d). Los valores con la mis- maletraindicaránquenohaydiferenciasignificativaentretratamientosanivelP=0.05deacuerdoconlapruebadeTukey.
- 83. Organogénesissomáticadenicotianaglauca|práctica13 83 Enraizamiento de losbrotes* Tratamiento** % de respuesta Biomasa promedio de raíz *** Biomasa de raíces por tratamiento 1 2 3 * La respuesta se evaluará después de cuatro semanas de tratamiento ** Se incluirán los resultados de todos los equipos *** El resultado debe incluir desviación estándar. Los valores deberán estar seguidos por letras (a-d). Los valores con la misma letra indicarán que no hay diferencia significativa entre tratamientos a nivel P= 0.05 de acuerdo con la prueba de Tukey. Análisis 1. ¿Cuál es el papel de las hormonas de crecimiento en la inducción de brotes? 2. ¿Cómo se comporta la planta en respuesta a las fitohormonas utilizadas? 3. Observaciones en relación con la eficiencia del proceso de micropropagación generado. 4. Comparar los resultados de esta planta con los procesos de micropropagación de plantas del mismo género 5. ¿Cuál puede ser la utilidad de contar con un protocolo eficiente de micropropaga- ción para el proceso de domesticación de la especie? Bibliografía Debnath, M., C.P. Malik y P.S. Bisen (2006), “Micropropagation: A tool for the production of high quality plant-based medicines”, Current Pharmaceutical Biotechnology 7: 33-49. Parc, G., J. Rembur, P. Rech y D. Chriqui, (2007), “In vitro culture of tobacco callus on medium containing peptone and phytate leads to growth improvement and higher genetic stabi- lity”, Plant Cell Reports 26: 145-152. Pennazio, S. (2002), “The culture of single plant cells: A historical view”, Rivista Di Biologia - Bio- logy Forum 95: 455-472. Thorpe, T.A. (2007), “History of plant tissue culture”, Molecular Biotechnology 37: 169-180. Ziv, M. (2005), “Simple bioreactors for mass propagation of plants. Plant Cell”, Tissue and Organ Culture 81: 277-285.
- 85. 85 Identificación de organismos genéticamentemodificados Práctica 14 Introducción Los jitomates, semillas de soya y granos de maíz fueron los primeros organismos genéticamen- te modificados en ser aprobados en Estados Unidos en los años noventa. A partir de entonces la biotecnología de alimentos continúa creciendo rápidamente. La introducción de genes específicos a través de la biotecnología puede proveer de ciertas ventajas. Como ejemplo, una planta genéticamente modificada se protege a sí misma contra parásitos después de la introducción de un gen para la producción de una endotoxina capaz de destruirlos. Las plantas también pueden ser modificadas para inhibir la expresión de genes específicos que están involucrados en la maduración de la fruta. Existen varios procedimientos biotecnológicos que pueden ser usados para la ingeniería genética de plantas. Como ejemplo podemos mencionar el uso de pistolas genéticas, la intro- ducción de genes mediante el plásmido Ti y la tecnología antisentido. Objetivo Los alumnos podrán identificar la presencia de transgenes en muestras vegetales adquiridas comercialmente. Material y equipo Material Equipo 20 Tubos eppendorf de 1.5 ml limpios y estériles por equipo Baño María a 65 o C por grupo Licuadora o mortero por grupo Micropipetas por equipo Centrífuga por grupo 1 mechero por equipo *100 g de soya *Material que deberán traer los alumnos. La idea es que traigan soya adquirida en distintos sitios: mercados, super- mercados, tiendas orgánicas, pueblos, etcétera.
- 86. Manualdebiotecnología|práctica14 86 Reactivos por grupo 1. 50 ml de amortiguador de extracción CTAB pH 8.0 (CTAB 20 g/l, NaCl 1.4 M, Tris 1 M y Na2 EDTA 0.02 M). 2. 50 ml de amortiguador de precipitación CTAB (CTAB 5 g/l y NaCl 0.04 M) 3. 50 ml de NaCl 1.2 M 4. 50 ml de solución fisiológica salina (NaCl 0.9%) 5. 1 ml de proteinasa K (20 mg/ml) o pronasa (50 mg/ml) 6. 50 ml de cloroformo 7. 50 ml de isopropanol 8. 50 ml de etanol al 75% 9. 10 ml de agua estéril Metodología Esta práctica se realiza en tres módulos: I) Extracción de dna de las muestras. II) Amplificación del dna. III) Electroforesis en geles de agarosa. MÓDULO I. Extracción de dna Extracción de dna usando ctab (bromuro de hexadeciltrimetilamonio) 1. En una licuadora se trituran 100 g de muestra con 25 ml de solución fisiológica sali- na, el homogenizado servirá para todo el grupo. 2. En un tubo eppendorf de 1.5 ml se colocan de 50-300 mg de muestra (1 tubo por alumno) 3. Agregar 1.0 ml de amortiguador de extracción CTAB precalentado a 65 °C, agitar e incubar por 30 min. 4. Adicionar 10 µl de proteinasa K (20 mg/ml), incubar a 55 o C por 30 min. 5. Centrifugar a 14 000 rpm por 10 min. El sobrenadante se transfiere un tubo nuevo y limpio. 6. Agregar un volumen de cloroformo, mezclar y centrifugar a 14 000 rpm por 15 min. 7. Tomar la fase acuosa superior y transferirla a un tubo nuevo y limpio. 8. Agregar 2 volúmenes del amortiguador de precipitación CTAB, incubar a temperatu- ra ambiente por 60 min. Posteriormente centrifugar a 14 000 rpm por 15 min. 9. El sobrenadante se descarta y el dna precipitado se disuelve en 350 µl de NaCl 1.2 M. 10. Adicionar 350 µl de cloroformo, mezclar y centrifugar a 14 000 rpm por 10 min. Transferir la fase superior a un tubo nuevo y limpio. 11. Agregar 600 µl de isopropanol, mezclar suavemente e incubar 20 min a temperatura ambiente. 12. Centrifugar a 14 000 rpm por 15 min, descartar el sobrenadante. 13. Adicionar 500 µl de etanol al 75%, mezclar con vórtex por 2 min. 14. Centrifugar a 14 000 rpm por 2 min, descartar el sobrenadante. 15. Secar la pastilla en el mechero y posteriormente resuspender en agua estéril (aproxi- madamente 100 µl).
- 87. Identificacióndeorganismosgenéticamentemodificados|práctica14 87 La pureza yconcentración del dna puede calcularse de la siguiente manera: 1. Hacer una dilución 1:100 de la muestra obtenida y medir la DO a 260 y 280 nm. La pureza se estima sacando la siguiente proporción: DO260 /DO280 . La concentración se calcula de acuerdo con la siguiente formula: 1.0 de DO260 = 50mg/µl para dna de doble cadena. Módulo II. Amplificación del dna La producción de plantas genéticamente modificadas se lleva a cabo mediante la inserción selectiva de genes foráneos de interés dentro de su genoma. El proceso mediante el cual se realiza la construcción requiere el corte y empalme de diferentes elementos para formar una unidad genéticamente funcional. La modificación generalmente incluye dos elementos regu- latorios, un promotor y un terminador, así como un gen que confiere una ventaja. Dos de los elementos regulatorios más utilizados son el promotor para una elevada expresión constitu- tiva en tejidos de plantas, CaMV-35, aislado del gen 35S del virus del mosaico de la coliflor y el terminador Nos aislado del gene de la nopalina sintasa (nopaline synthase) de Agrobacterium tumefaciens, el cual da la señal de terminación de la transcripción y dirige la poliadenilación. Estos dos elementos pueden estar juntos o separados. Al inicio de los años ochenta, Chua y colaboradores en la Universidad de Rockefeller aisla- ron el promotor responsable de la transcripción del genoma completo del virus del mosaico de la coliflor (CaMV, por cauliflower mosaic virus). El promotor fue nombrado CaMV 35S o promo- tor 35S por su coeficiente de sedimentación. El promotor 35S es un promotor constitutivo muy fuerte, ya que provoca altos niveles expresión de genes en plantas dicotiledóneas, aunque es menos efectivo en plantas monocotiledóneas, especialmente en cereales. La discrepancia se debe probablemente a la diferencia en la cantidad y/o cualidad de los factores de regulación. Metodología Mezcla de reacción: 1. Volumen total 25 µl 2. 2.5 µl de amortiguador de reacción (10X) 3. 50 pmol de cada primer 4. 2.5 U de Taq dna polimerasa 5. X µl de agua libre de nucleasas estéril 6. 1-5 µl de dna 7. 2.5 µl dNTP´s 2 mM. Es conveniente que el profesor haga un stock para todo el grupo con el fin de optimizar el uso de los reactivos. La cantidad de reacciones de PCR será determinada por el profesor, ya que no se pueden realizar para todo el grupo debido al elevado costo de los reactivos. Oligonucleótidos utilizados para la amplificación Promotor CaMV 35S CaMV 35SF CaMV 35SR Tamaño esperado del amplicón: 196 pb
- 88. Manualdebiotecnología|práctica14 88 Terminador NOS NOSF NOSR Tamaño esperadodel amplicón: 180 pb Programa de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Desnaturalización 94 °C, 5 min. Desnaturalización 94 °C, 30 seg. Alineamiento 54 °C, 30 seg. Extensión 72 °C, 30 seg. Extensión final 72 °C, 7 min. Número de ciclos 30 ciclos Módulo III. Electroforesis en geles de agarosa La electroforesis es un proceso que se utiliza para separar macromoléculas en una solución. Muchas moléculas biológicamente importantes (aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleóti- dos, ácidos nucleicos) poseen grupos ionizables y existen en solución como especies cargadas, bien como cationes, o bien como aniones. La electroforesis permite separar moléculas de dna al ser sometidas a un campo eléctrico, ya que son atraídas hacia el polo opuesto a su carga neta. Hay dos fuerzas de acción opuesta que determinan la velocidad de la partícula. Primero, la fuerza eléctrica atrae el dna hacia el electrodo y la intensidad de la atracción es directa- mente proporcional a la carga. Segundo, la fuerza de rozamiento se opone a la migración y su intensidad depende del tamaño y la forma de la partícula. La electroforesis permite además, hacer una aproximación de la cantidad de dna que se obtiene después de un proceso de extracción. También se utiliza para visualizar el resultado de procesos como la restricción y PCR. Reactivos Amortiguador TAE 50X GelRed Agarosa Metodología Preparación del gel de agarosa 1. Determinar la concentración y el volumen de gel que se necesita. Si el dna tiene un tamaño desconocido se debe utilizar un gel de agarosa al 1.0% (1g/100 ml). 2. Preparar el gel al porcentaje de agarosa deseado según se indica en el siguiente ejemplo. Ejemplo 1: preparar 30 ml de agarosa al 1.0% (1g/100 ml). Hay que determinar qué canti- dad de agarosa se necesita para preparar 30 ml: (30 ml)(1 g/100 ml) = (X g)
- 89. Identificacióndeorganismosgenéticamentemodificados|práctica14 89 Se despeja laecuación para la X. El resultado en este caso es 0.3 g 3. Pesar la cantidad de agarosa que se necesita (ejemplo 1 = 0.3 g) y transferir a un ma- traz Erlenmeyer. 4. Añadir el volumen deseado de solución amortiguadora Tris acetato EDTA (TAE) 1X (ejemplo 1 = 30 ml). 5. Calentar en un horno de microondas hasta que se disuelva la agarosa totalmente (aproximadamente un minuto), pausando el horno cada vez que sea necesario para impedir que hierva. 6. Enfriar la agarosa hasta unos 50 °C. 7. Colocar el molde para hacer los pozos en la charola que soporta el gel. Para que el gel quede de un espesor uniforme la charola debe estar en una superficie plana nivela- da. 8. Vaciar la solución de agarosa en la charola evitando la formación de burbujas. Si se forman burbujas, se pueden remover usando una punta para micropipeta. 9. Dejar que el gel se solidifique a temperatura ambiente (aproximadamente 30 minu- tos). El gel sólido tiene una apariencia opaca. Preparación de la cámara y de las muestras 1. Colocar el gel dentro de la cámara de electroforesis. 2. Añadir suficiente TAE 1X para cubrir completamente el gel (aproximadamente 0.5 cm) 3. Las muestras se preparan de la siguiente forma: Tomar5µldelamuestraydepositarlaenuncuadritodeParafilm,agregar1mldeGelRed para monitorear la movilidad electroforética. Siempre se debe de usar una punta de micropipeta nueva para cada tubo, de esta manera se evita la contaminación. 4. Cargar cuidadosamente ~ 6 µl de muestra por pozo utilizando una micropipeta. Car- gar todas las muestras deseadas de igual manera. Incluir en el gel una muestra de un marcador de peso molecular. 5. Conectar el equipo de electroforesis. Unir los electrodos positivos (rojos) y negativos (negros) a las terminales correspondientes. 6. Encender el equipo, seleccionar el voltaje deseado (aproximadamente 100 voltios). Si el equipo está funcionando bien, entonces se podrán observar burbujas saliendo de los electrodos. Conviene asegurarse de que las muestras están corriendo en la dirección correcta, hacia el electrodo positivo. 7. Correr la electroforesis hasta que las muestras se hayan movido aproximadamente entre la mitad y tres cuartos de la charola. 8. Apagar el equipo. Resultados Visualización del dna • Colocar el gel en una lámpara de luz UV o transiluminador • Fotografiar el gel usando una cámara digital.
- 90. Manualdebiotecnología|práctica14 90 Bibliografía Elenis, D.S., D.P.Kalogianni, K. Glynou, P.C. Ioannou y T.K. Christopoulos (2008), “Advances in molecular techniques for the detection and quantification of genetically modified orga- nisms”, Anal Bioanal Chem 392: 347-354. Gryson, N., K. Messens y K. Dewettinck (2004), “Evaluation and optimization of five different extraction methods for soy DNA in chocolate and biscuits. Extraction of DNA as a first step in GMO analysis”, J Sci Food Agric 84:1357-1363. Michelini, E., P. Simoni, L. Cevenini, L. Mezzanotte y A. Roda (2008), “New trends in bioanalytical tools for the detection of genetically modified organism: an update”, Anal Bioanal Chem 392: 355-367. Oraby, H.A.S., A. A. Hassan y A.A. Mossallam, (2005), “Screening food products for the presence of CaMV 35S promoter and NOS 3´ terminator”, J Sci Food Agric 85: 1974-1980.
- 91.
- 93. Manualdebiotecnología|Anexo 93 Práctica 1. Fermentación alcohólicapor Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae se mantendrá sembrada en cajas de medio rico (YPD) y se utilizará para el inóculo una caja con no más de una semana de haber sido sembrada. YPD Y (extracto de levadura) 1% P (peptona de caseína) 2% D (glucosa) 2% Agar 2% DNS (Miller, 1959) Hidróxido de Na 1.40 % Ácido 3,5- dinitrosalicílico 0.75 % Tartrato de Na y K 21.60 % Fenol 0.54 % Metabilsulfito de Na 0.59 % Práctica 3. Transformación de levadura y ensayo de doble híbrido Preparar por grupo: Medio YPD (g/L) (5 matraces con 30 ml c/u para el grupo): Extracto de levadura 10 g, peptona 20 g, dextrosa (glucosa) 20 g. Cajas de SD + Leu (3 por equipo): Base nitrogenada para levaduras, sin aminoácidos (YNB) 0.67 %, glucosa 2 %, leucina 20 mg/L, agar 2%. Cajas de SGal + Leu, pH 7.0 (1 por equipo): YNB 0.67%, galactosa 2%, leucina 20 mg/L, ajustar el pH a 7.0, agar 2%. Cajas SGal + rafinosa al 1% sin leucina (1 por equipo): YNB 0.67%, rafinosa 1%, agar 2%. TE 10X, pH 8.0 (10 ml para el grupo): Tris 100 mM, EDTA 10 mM. Acetato de litio 10X (10 ml para el grupo): Preparar una solución 1 M de acetato de litio, pH 7.5. PEG 50%: Disolver 25 g de PEG 3350 en 50 ml de agua y esterilizarlo. X-Gal: solución al 2% en N,N-dimetilformamida (guardar a -20 °C). dna de esperma de salmón: Solución de trabajo 10 mg/ml, preparado según Sambrook et al., 1989. Práctica 4. Extracción de dna e identificación del sexo en humanos: su importancia en las ciencias antro- pológicas y forenses PBS 20X (0.2 M PBS, pH 7.2): Na2 HPO4 (anhidro) 21.8 g
- 94. Manualdebiotecnología|Anexo 94 NaH2 PO4 (anhidro) 6.4 g NaCl 180 g Agua destilada 1,000 ml Ajustar pH a 7.2 Guardar a temperatura ambiente Solución de Lisis: Tris-HCl 1 M, pH 7.5 1 ml EDTA 500 mM 2 ml NaCl 5 M 1 ml SDS 20% (p/v) 10 ml Agua libre de nucleasas cbp 100 ml Esterilizar y almacenar a temperatura ambiente. TAE 50X (1L): Tris base 242 g Ácido acético 57.1 ml EDTA 0.5 M, pH 8.0 100 ml EDTA 500 mM, pH 8.0: EDTA (sal de sodio) 18.61 g Ajustar a pH 8.0 con lentejas de NaOH. Aforar a 100 ml, esterilizar y almacenar a temperatura ambiente Proteinasa K o Pronasa (20 mg/ml) Proteinasa K o pronasa 100 mg Agua estéril 5 ml Almacenar a -20 °C en alícuotas de 400 µl Acetato de sodio 3 M pH 5.2 (100 ml) Acetato de sodio trihidratado 40.8 g Ajustar el pH a 5.2 con ácido acético glacial. Ajustar el volumen a 100 ml con agua destilada. Esterilizar con autoclave y almacenar a temperatura ambiente Práctica 6. Análisis de la actividad de catalasas Preparación de medio PY, en un vaso de precipitados, preparar como se enlista a continuación: Reactivo Por litro de volumen final Peptona de caseína 5 g Extracto de levadura 3 g Esterilizar en autoclave 20 minutos a 120 0 C y 1 atm de presión. Después, añadir 10 ml de CaCl2 0.7 M.
- 95. Manualdebiotecnología|Anexo 95 Preparación de PBS10X: en un vaso de precipitados preparar como se enlista a continuación: Reactivo Por litro de volumen final KCl 2 g NaCl 80 g Na2 HPO4 . 2H2 O 14.4 g KH2 PO4 2.4 g Ajustar el pH a 7.4 con NaOH Práctica 7. Síntesis de celulosa bacteriana para aplicaciones biotecnológicas, utilizando Gluconacetobacter xylinum Preparar 200 ml (por equipo) de medio de cultivo BEGG (g/L): Glucosa* 40, extracto de levadura 5, glutamato de sodio 10, KH2 PO4 , 13.6, MgSO4 .7H2 O 0.5, etanol** al 1.4% (v/v) pH 6.0. NaOH 0.5 M 50 mL (por equipo): 1 g de hidróxido de sodio, aforar a 50 mL con H2 O * La glucosa se esteriliza por separado y se añade posteriormente al medio para evitar que el grupo amino de las proteínas del extracto de levadura reaccionen con la glucosa. ** El etanol se añade después de la esterilización y una vez que el medio se encuentre a una temperatura ≤ 30 °C para evitar su volatilización. Práctica 8. Emulsificación de diesel, gasolina y aceite de maíz por Pseudomonas aeruginosa y Serratia mar- censes. Medio MS 100 ml (por equipo), para preparar 1 L: Cloruro de amonio 20 mM 1.068 g Cloruro de potasio 20 mM 1.492 g Tris - HCl 120 mM 18.912 g Peptona 1% 10g Dextrosa (20%) 0.5% 26ml Sulfato de magnesio (1.0 M) 1.6 mM 1.6ml Pesar y disolver los reactivos excepto la dextrosa y el sulfato de magnesio en 200 ml de H2 O desionizada, ajustar el pH a 7.4 y aforar a 975 ml. Esterilizar durante 20 minutos. Stock de Dextrosa al 20%, 100 ml Dextrosa 20% 20g Pesar y disolver en 85 ml de H2 O desionizada y aforar a 100ml. Esterilizar durante 20 minutos. Sulfato de magnesio 1.0 M 12.32g Pesar y disolver en 50 ml de H2 O desionizada. Esterilizar por filtración.
- 96. Manualdebiotecnología|Anexo 96 Antes de usarel medio PPGAS, se añaden 26 ml de glucosa al 20% y 1.6 ml de sulfato de mag- nesio. MEDIO PG (50 ml por equipo), para preparar 1,000 ml: Bacto peptona 5 g Glicerol 10 ml Ajustar pH a 7.2 Aforar a 1 L Esterilizar 20 minutos Práctica 9. Metabolismo secundario Preparación de reactivos: Liebermann-Burchard (1 ml por equipo). Mezclar 1 ml de anhídrido acético y 5 ml de clorofor- mo a 4 °C (en baño de agua-hielo), añadir una gota de ácido sulfúrico concentrado. Draggendorff (2 gotas por equipo). Preparar por separado dos soluciones: Solución A.- mezclar 10 ml de ácido acético y 40 ml de agua y agregar 0.85 g de nitrato de bismuto básico. Solución B.- Disolver 20 g de yoduro de potasio en 50 ml de agua. Mezclar la solución A con la solución B y guardar en un frasco ámbar. Mölish (2 gotas por equipo). Pesar 0.5 g de α-naftol y disolver en 10 ml de etanol. Práctica 11. Fitorremediación con helechos Práctica 12. Inducción y desarrollo de embriones somáticos de zanahoria Práctica 13. Organogénesis somática de Nicotiana glauca Estas tres prácticas contemplan el manejo de cultivos vegetales, por lo que se utilizará el me- dio Murashige y Skoog, Ms, modificado. Medio Ms modificado: Preparar soluciones stock. Las soluciones stock se preparan por separado para evitar que se precipiten: Stock Componente gramos/litro 10X (g/L) 1 macros (NH4 )NO3 KNO3 MgSO4 × 7H2 O KH2 PO4 1.65 1.9 0.37 0.17 16.5 19 3.7 1.7 20X (g/L) 2 CaCl2 0.44 44
- 97. Manualdebiotecnología|Anexo 97 3 micros MnSO4 × H2 O ZnSO4 × 7H2 O H3 BO3 KI NA2 MoO4 • 2H2 O CuSO4 •5H2 O CoCl2 •6H2 O 0.01689 0.0086 0.0062 0.00083 0.00025 0.000025 0.000025 1.352 0.688 0.496 0.020 0.020 0.002 0.002 4* FeSO4 •7H2 O Na2 •EDTA 0.0278 0.0373 2.224 2.984 5 vitaminas Tiamina•HCl Ác. nicotínico Piridoxina•HCl 0.0001 0.0005 0.0005 0.008 0.040 0.040 6 Inositol 0.10 8.0 7 Glicina 0.002 0.160 Sacarosa 30 *Pesar y disolver el fierro y el EDTA por separado. Calentar el EDTA sin ebullir has- ta que se disuelva y luego mezclar con el fierro, debe quedar una solución color ámbar (amarillenta). Preparar 1 L de stock 1(10X). Elaborar 200 ml de c/u de los stock 20X restantes. Todas las solu- ciones deben conservarse en refrigerador, de preferencia juntas en un recipiente de plástico. Preparación del medio Ms, 1 L: Poner 500 ml de agua destilada en un vaso de precipitados y en agitación constante, se agregan 100 ml del stock 1 y de manera secuencial 10 ml de cada uno de los demás stocks. Al final se agrega la sacarosa necesaria y cuando se haya disuelto por completo, se añade agua destilada hasta llegar a 950 ml y ajustar el pH de la solución a 5.7 con HCl ó KOH 1N. Finalmente se afora el medio nutritivo a un litro. Para que los alumnos prueben los distintos tratamientos, se llevan a cabo los siguientes pasos durante la práctica con el grupo: Cuando el medio nutritivo va a vaciarse a cajas Petri: se vierte en un matraz Erlenmeyer de 2L (es importante que el volumen del matraz sea mucho mayor que el del medio) y se le agrega el agar (8 g por litro) directamente. El medio se esteriliza en autoclave durante 20 minutos a 120 o C. Se deja que el medio enfríe hasta alcanzar alrededor de 60 0 C y se vacía en cajas Petri estériles en una campana de flujo laminar. Cuando el medio va a vaciarse en frascos de 125 ml (Gerber), se disuelve con agar en una parrilla con agitación hasta que se torna claro y transparente (generalmente cuando llega al punto de ebullición). Se vacían 25 ml del< medio de cultivo a cada frasco. Los frascos con el medio se esterilizan en autoclave durante 20 minutos a 120 o C. Es importante dejar que la autoclave se enfríe lentamente para evitar que las tapas de los frascos se boten por cambios bruscos de presión.
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