El documento describe las enzimas de restricción, endonucleasas que cortan el ADN en secuencias específicas. Se explica que estas enzimas se descubrieron originalmente en bacterias como mecanismo de defensa contra virus, cortando el ADN invasor pero no el propio debido a la metilación. También se detalla que las enzimas de restricción tipo II son las más utilizadas en ingeniería genética, cortando ambas hebras del ADN en la misma posición para generar extremos cohesivos que permiten recombinar fragmentos de ADN.

1. INTRODUCCIÓN
El método clásico de clonación de ácidos nucleicos es el que
aprovecha la capacidad de las células para replicar el DNA.
Surge gracias a la aparición de una serie de técnicas que
permiten el aislamiento del DNA y al descubrimiento en los
años 70 de las enzimas de restricción, que hace posible en el
laboratorio cortar el DNA e incorporar los fragmentos a
vectores, que a su vez se introducen en células anfitrionas,
donde tiene lugar su replicación. Aunque, en principio, esta
tecnología sólo se planteaba para clonación del DNA, existen
actualmente variantes que amplían su eficiencia y extienden
su aplicación al RNA.

2. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Para poder describir el proceso de clonación del DNA, es necesario hacer un inciso para
estudiar con cierto detenimiento las propiedades y características de las endonucleasas de
restricción. Aunque estas enzimas desempeñan una función propia en las células procariotas
en las que se descubrieron, son particularmente importantes por su empleo experimental en
varias áreas de la Biología Molecular, de interés tanto básico como aplicado al diagnóstico
clínico. En especial, se utilizan en el proceso de la clonación molecular de DNA; de ahí la
oportunidad de su estudio en este lugar. Además, tienen aplicación en otras técnicas, como
la secuenciación del genoma y el estudio de los polimorfismos, se inicia el estudio de estas
enzimas con un breve recordatorio de las nucleasas en general.
INTRODUCCIÓN A LAS NUCLEASAS
Se denomina de forma genérica nucleasa a cualquier enzima con capacidad de escindir los
enlaces fosfodiéster de la cadena polinucleotídica de los ácidos nucleicos; son por tanto,
fosfodiesterasas. Su especificidad puede analizarse con respecto a tres criterios:
1. Escisión en posiciones internas o terminales en la estructura primaria (endonucleasas
y exonucleasas, respectivamente).

3. Las exonucleasas hidrolizan exclusivamente enlaces fosfato en los que participa el
nucleótido terminal (bien 5´o bien 3´, dependiendo de la exonucleasa). Generan, por
tanto, una cadena polinucleotídica acortada y un nucleósido (N), un nucleósido-
monofosfato (pN o Np) o un nucleósido-bifosfato (pNp).
Las endonucleasas sólo hidrolizan enlaces internos de la cadena, es decir, sin afectar
a los nucleótidos terminales. Generan dos fragmentos polinucleotidícos.
2. Actuación sobre uno de los dos tipos de enlace fosfoéster:
Algunas nucleasas (tipo “a”) actúan específicamente hidrolizando los enlaces fosfato
formados con el OH 3´, mientras que otras (tipo “b”) hidrolizan los formados con el
OH 5´.
De este modo, las de tipo “a” dan lugar a extremos 3´-OH y 5´-P, mientras que las de
tipo “b” producen extremos 3´-P y 5´-OH.
Ejemplos de especificidad tipo “a” y “b” de endonucleasas:

4. 3. Reconocimiento de nucleósidos, bien por la pentosa o bien por la base nitrogenada
(sólo en algunas nucleasas): desoxirribonucleasas o DNasas, que actúan sólo sobre
DNA; ribonucleasas o RNasas, que hidrolizan RNA; finalmente, algunas nucleasas
distinguen entre nucleósidos purínicos de pirimidínicos.
Ejemplos de especificidad por nucleósidos:
 ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
 Características Generales
Las enzimas de restricción se llaman también nucleasas de restricción, endonucleasas de
restricción y, en ocasiones, enzimas restrictivas o restrictasas. Pertenecen a este grupo
una gran diversidad de endodesoxirribonucleasas, descubiertas como enzimas propias de
distintas bacterias y caracterizadas en los años 70. Se disponen hoy comercialmente de
un gran número de ellas con elevada especificidad, estabilidad y pureza.

5. Se nombran con tres letras tomadas del género y especie de la bacteria de la que se
aislaron originalmente, seguidas a veces por una letra más, que identifica el serotipo
(variantes antigénica de la bacteria), y finalmente por un número romano que las identifica
en el caso de que en una misma variante se hayan encontrado varias enzimas con
distinta especificidad:
La importancia de las enzimas de restricción radica en su gran especificidad de
reconocimiento de una secuencia corta de DNA dúplex y la consiguiente hidrólisis de un
enlaces fosfodiéster en cada hebra, justamente en secuencias concretas del DNA
llamadas sitios de reconocimiento o de restricción. Los fragmentos de DNA originados son
útiles para iniciar la clonación celular o acelular, para el análisis de DNA, para elaborar
mapas físicos de restricción, para la detección de polimorfismos, etc.
Las diversas enzimas de restricción se agrupan normalmente en tres familias, de acuerdo
con sus propiedades:

6. Nos concentraremos en el estudio de las enzimas de tipo II, pues, al cortar en secuencias
muy definidas, son loas utilizadas como herramientas en ingeniería genética.
 Papel biológico del sistema metilación-restricción
La existencia natural de las nucleasas de restricción en muchas bacterias ofrece a estas
un mecanismo de defensa contra la entrada de material genético de otro organismo,
concretamente de virus bacteriófagos (cuya reproducción depende de la maquina
genética de la bacteria): se trata de los sistemas de restricción-modificación o metilación-
restricción. Para cada enzima de restricción, una metilasa reconoce la misma secuencia
que constituye el sitio de restricción y une covalentemente grupos metilo a determinadas
bases del DNA en dicha secuencia. En el caso de enzimas de tipo II, la metilasa es una
proteína independiente, mientras que las de tipo I y III poseen las actividades nucleasa y
metilasa en su molécula oligomérica, como subunidades que actúan coordinadamente.
El mecanismo de defensa es el siguiente: el DNA propio de la bacteria es metilado de una
forma específica característica de cada especie bacteriana (en las secuencias
reconocidas tanto por la restrictasa como por la metilasa de esa especie). La metilación
de las bases impide la unión de la enzima de restricción, con lo que el DNA propio no es
hidrolizado. Por el contrario, al entrar en la célula DNA de otro organismo, no metilado o
con un patrón de metilación diferente, este DNA puede ser degradado por la enzima de
restricción, ya que carece de los grupos metilo en la secuencia diana (por razones
puramente aleatorias, en cualquier genoma habrá un cierto número de secuencias de 4,6
u 8 pb iguales a la reconocida por la enzima, luego habrá secuencias diana disponibles).
A partir de este mecanismo de acción combinada surgió precisamente el nombre de
enzimas de restricción: la acción de la nucleasa restringe la posibilidad de infección por
virus.

7. Si esté metilada una solo hebra del DNA, el sito no es reconocido por la enzima de
restricción, pero si por la metilasa, que añade el grupo metilo a la otra hebra. Esto es lo
que ocurre, por ejemplo, al final de la replicación, donde el dúplex está formado por una
hebra molde, preexistente y, en consecuencia, metilada, y la otra hebra recién
sintetizada, que aún carece de grupo metilo. Esta acción de las metilasas asegura que
todo el DNA de las dos células hijas quede metilado lo antes posible.
La metilación del DNA afecta principalmente a citosinas y adeninas de la secuencia
reconocida. En la reacción, las metilasas utilizan como donador del grupo metilo el
compuesto S-adenosilmetionina.

8. Debe adelantarse que la metilación del DNA interviene en eucariotas como un
mecanismo de regulación de la expresión génica, aunque este proceso no tiene nada
que ver con el mecanismo de protección que desempeñan los sistemas metilasa-
restrictasa en procariotas. Esencialmente, en eucariotas los genes tienden a estar
desmetilados en los tejidos donde se expresan y metilados donde no se expresan,
especialmente en las regiones de DNA llamadas “islotes CpG”, por tener esta secuencia
dinucleotídica en la que C sufre la metilación.
 Acción de las enzimas de restricción de tipo II.
Son estas las restrictasas estructuralmente más simples y las mejor estudiadas por su
utilidad en Ingeniería Genética, a modo de “tijeras” para el corte del DNA. El sitio de
restricción es a la vez lugar de reconocimiento y de hidrólisis. Se hidrolizan de forma muy
específica enlaces fosfoéster del DNA, uno en cada hebra, generándose dos fragmentos
de restricción. El enlace hidrolizado es siempre el 3´-P (es decir, son endonucleasas del
tipo “a”,), por lo que el fosfato queda unido a 5´,dejando en ambos fragmentos extremos 3
´-OH y 5´-P.la reacción no necesita ATP, lo que la diferencia de la catalizada por las
enzimas de tipo I y III.

9. Ilustración de los distintos tipos de extremos resultantes de la acción de enzimas de
restricción:
Algunas enzimas de restricción de tipo II empleadas en Ingeniería Genética:

10. * Extremos compatibles: en algunos casos, distintas enzimas de restricción generan extremos
cuyo saliente tiene la misma secuencia. Ejemplo: Bam HI, Bgl II Y MboI ( ).
* Isoesquizómeros: nombre que se aplica a dos o más enzimas que reconocen la misma
secuencia; pueden cortar en el mismo punto o bien se diferencian en que el corte o la metilación
asociada tienen lugar en puntos distintos dentro de esa secuencia común de reconocimiento.
Ejemplos: MboI y Sau 3AI ( ); Acc 651 y KpnI ( ).
Obsérvese que en todos los casos los extremos de los dos fragmentos generados son
idénticos, tienen la misma secuencia (se puede ver girando 180° uno de ellos). Esto es
consecuencia de la simetría del palíndromo y de la posición simétrica de los puntos de
corte en cada hebra. Todo ello se debe a que la enzima actúa en forma de dímero, por
tanto reconociendo una misma secuencia y cortando un mismo tipo de enlace en las dos
hebras: por ejemplo, Eco RI corta el enlace (5´) G—AATTC (3´) en ambas hebras. La
formación de extremos cohesivos es de gran interés aplicado en ingeniería genética, pues
fragmentos generados con una misma restrictasa a partir de dos DNAs distintos pueden
interaccionar mediante el apareamiento de las bases de sus extremos cohesivos (tal
interacción no es posible entre extremos romos). Igualmente se pueden asociar los
fragmentos producidos por enzimas distintas que producen extremos compatibles.
Debe resaltarse que el producto de la reasociación de los dos fragmentos en ninguno de
los casos es idéntico al DNA de partida, pues está formado por dos moléculas. La falta de
enlace covalente entre los extremos de los fragmentos reasociados se indica con el
nombre de “mella” o “muesca”. Estas se pueden cerrar o “sellar” por la acción de las
enzimas ligasas (o DNA ligasas), dando una molécula única de doble hebra. Como se ha
visto, las ligasas catalizan la formación en cada hebra del enlace fosfoéster que faltaba,
con consumo de energía. Pueden, incluso, unir o “ligar” dos fragmentos de DNA con
extremos romos, aunque con mucha menor eficacia, pues no hay apareamiento entre
ellos.

11. La acción de las ligasas es, pues, contraria a la de las nucleasas (formación de enlace
fosfoéster frente a su hidrólisis), pero el mecanismo de la reacción no es exactamente
opuesto, por el requerimiento energético de la primera. Debe resaltarse que la ligasa
siempre requiere un grupo 5´-p para su actuación, propiedad que posee utilidad
experimental.

12.  PREPARACIÓN DEL VECTOR DE CLONACIÓN
En general, un vector es una molécula de ADN de tamaño pequeño, fácil de aislar y
caracterizar, con secuencia y mapa de restricción, de fácil introducción en la célula
anfitriona y una vez allí con capacidad de replicación autónoma, es decir, independiente
de la replicación del genoma de la célula anfitriona.
Es conveniente que el vector posea el mayor número posible de sitios de restricción, para
insertar el fragmento de ADN quiere clonar, que incluya al menos un gen marcador (por
ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos) que permita identificar y/o seleccionar las
células que llevan el ADN recombinante. Lo común es que el vector natural no posean
todas estas características, por lo que habitualmente se emplean vectores modificados (a
su vez, obtenidos por técnicas de ADN recombinante, pero ya disponibles comercialmente
con todas las prestaciones deseadas).
La misión del vector es unirse al ADN que se quiere clonar (llamado inserto) para facilitar
su entrada en la célula anfitriona y su replicación. Para poder unir con facilidad ambos, se
debe cortar el vector con las mismas enzimas de restricción que se utilizaron para escindir
el ADN de la muestra o con enzimas que proporcionan extremos compatibles; de ese
modo, sus secuencias complementarias pueden asociarse y ser unidos por la ligasa,
dando lugar a una sola molécula de ADN de doble hebra, llamada ADN recombinante
(ADNr).
En función de los objetivos de clonación (amplificación y expresión), se suele hablar de
dos grandes grupos de vectores. Por un lado, los vectores de clonación, que se emplea
únicamente para amplificar el ADN de interés, también se les llama vectores de inserción
o vectores de propagación. Teóricamente, solo incorporarían el inserto de interés. Por
otro lado, los vectores de expresión, que poseen además características que facilita la
expresión por la célula anfitriona del ADN de interés. En este caso deberá incorporarse,
además de este, el ya mencionado inserto auxiliar con una región de control de la

13. expresión. En la práctica, los vectores de expresión comerciales suelen incluir ya una
región de control, comúnmente un promotor potente que se induzca fácilmente bajo
condiciones experimentales controlables, válido para expresar cualquier inserto de interés
que se situé tras él en el ADNr.
Aunque existe diversos tipos de vectores, por ahora la descripción se hará con un
plásmido, una molécula pequeña de ADN circular.

14.  FORMACIÓN DE MOLÉCULA RECOMBINANTE
Consiste en la unión covalente, in vitro, del inserto de ADN al vector fragmentado, mediante
una ligasa. La especificidad de la unión depende del tipo de extremos que hayan resultado al
preparar el inserto y el vector: si son cohesivos, su secuencia es la especifica de la enzima
de restricción empleada y solo se asocian los extremos compatibles; una vez asociado por
apareamiento de bases, la ligasa establece la unión covalente sellando las dos mellas. Si se
trata de extremos romos, no pueden asociarse, pero la ligasa se puede unir, aunque con
menor eficacia, y no supone ninguna diferencia la enzima de restricción con la que se
prepararon (se puede decir que todos los extremos romos son compatibles).

15. En la práctica, puede ocurrir diversos tipos de asociación entre fragmento de restricción con
extremos compatibles, todas ellas catalizadas por la ligasa. En primer lugar, siempre puede
darse la asociación intramolecular, es decir, entre los dos extremos de la misma molécula
(vector o inserto); si se trata de un vector circular, da lugar a su recirculación. Esta
interacción esta favorecida cuando la concentración de ADN es baja (pues la probabilidad de
que dos moléculas se encuentren es menor). En segundo lugar, puede tener lugar una
asociación intermolecular, tanto la que conduce al ADNr (vector +inserto) como otras que
conducen a productos no deseados: vector +vector, inserto + inserto, unión de más de dos
moléculas, etc.; todas ellas circulares o lineales. Estas interacciones son más probables para
concentraciones elevadas de ADN.
Para evitar la formación de estos productos secundarios, que disminuya el rendimiento de la
clonación, se acuda a estrategias experimentales, previa a la mezcla del vector e inserto,
tales como la escisión con dos enzimas de restricción diferentes, que evita la recirculación
del vector o, como se describe a continuación, la desfosforilación del vector con fosfatasa
alcalina.

16.  TIPOS DE VECTORES
Los vectores empleados para la clonación de insertos de ADN son muy variados. Pueden
clasificarse según varios criterios, tales como procedencia como:
• Su procedencia procariótica o euóariotica.
• El tipo de molécula a partir de la que se preparan:
 Plásmidos: bacterianos, de levaduras o de plantas.
 Virus: que infectan bacterias (bacteriófagos o simplemente fagos), plantas,
invertebrados o vertebrados.
 Cromosomas artificiales: derivados de elementos cromosómicos del fagos
(PACs), de bacterias (BACs) o de levaduras (YACs).
 Quimeras, es decir, moléculas formadas combinadas parte de otras cuyo origen
es diferente.
Normalmente, quimeras de plásmidos y fagos: cósmidos, fagémidos, fásmidos.

17. • El tipo de célula anfitriona en la que el ADN recombinante resultante se puede luego
incorporar.
• El gen de resistencia que contiene el vector para su posterior detección o selección.
• El tamaño del ADN que admiten como inserto.
A. Plásmidos
Son moléculas de ADN de doble hebra, de pequeño tamaño (2-5Kb) y forma circular,
presentes en forma libre en el citosol de muchas bacterias (de 1 a 3.000 plásmidos/célula) y
de algunas eucariotas unicelulares (por ejemplo, el plásmido µ de levaduras o “circular de
2µm”). Son fáciles de purificar a partir del cultivo bacteriano. Permiten la incorporación de
insertos de ADN de un tamaño máximo de unas 10 Kb. Los plásmidos naturales contienen
pocos genes propios, ninguno esencial para la viabilidad de la célula, por lo que pueden ser
modificados sin afectarla. Para su replicación autónoma (independiente de la del cromosoma
bacteriano, aunque utilizando las mismas enzimas), se requiere una secuencia origen de
replicación. En cada división celular, el cromosoma origina una sola copia por célula hija,
mientras que el plásmido (en su caso, el ADNr formado a partir de el9 sufre replicaciones
múltiples y origina varias copias por célula (de 20 a 50). Los plásmidos son así replicones
(unidades de replicación) que se transmiten y mantienen de manera estable como círculos
extracromosómicos.

18. El empleo de un plásmido como vector de clonación se favorece cuando incluye genes
marcadores, cuya presencia puede ser detectada o cuya expresión confiera a la célula
anfitriona portadora del ADNr una serie de propiedades especiales. Por ello, se utilizan
comúnmente plásmidos artificiales o sintéticos, obtenidos a su vez por técnicas de ADN
recombinantes y disponibles comercialmente. Baste como ejemplo el plásmido pUC19.
B. Bacteriófagos
Los virus en general se replican mediante la introducción de su genoma en células
procariotas o eucariotas (infección). Esta propiedad resulta útil para conseguir una alta
eficiencia de clonación, empleando como vectores virus modificados. Cada tipos de virus
infecta a células especificas y, dependiendo del tamaño del genoma vírico, admite insertos

19. más o menos grandes, pero en general mayores que los que se pueden insertar en
plásmidos. Así para clonar en bacterias se usan bacteriófagos, baculovirus para células de
insectos, y virus SV40 o retrovirus para células de mamíferos, por su elevada eficacia de
introducción del ADNr, pero dada su complejidad y por razones de extensión no se tratara el
tema.
Los virus más comúnmente empleados como vectores son los parásitos bacterianos fagos
M13 y λ (lambda). El tamaño del vector recombinante se ve limitado por la necesidad de su
empaquetamiento dentro de la cápsida. El inserto se puede introducir de la misma forma que
para los vectores plasmídicos, es decir, cortando insertos y ADN del fago con las mismas
enzimas de restricción y ligando para obtener un ADNr; esto se denomina técnica de
inserción, y existe vectores específicos para ello. Cuando el tamaño del ADN de interés se
quiera clonar es mayor, se puede incorporar eliminando previamente la parte del genoma
vírico que no se requiere para la infección y replicación; se hable de técnica de sustitución o
reemplazamiento.

20. C. Cósmidos
Son vectores sintéticos, quimeras que combinan características de plásmidos y fagos para
combinar las ventajas de ambos tipos de vectores. El fragmento plasmídico proporciona las
características de tamaño pequeño (5-7Kb), circularidad, un origen de replicación, un numero
de sitios de restricción donde se va a insertar el ADN, uno o más marcadores seleccionables
y la propagación en bacterias como si fuesen plásmidos. Del fago λ se toma las secuencias
“cos” (del inglés cohesive sites), que proporcionan al cósmido la capacidad, propia del ADN
del fago, de ser empaquetado en cápsidas víricas in vitro.
Los cósmidos son útiles para clonar insectos de gran tamaño(hasta 45 Kb), especialmente
en la preparación de librerías genómicas del organismo superior, ya que disminuye en gran

21. medida el numero de clones necesarios para que todo el genoma este representado en la
genoteca. Los métodos de introducción del ADNr cosmídicos depende del tamaño del
inserto. Si este es pequeño, se puede introducir por transformación (las células se hacen
competentes para incorporarlo en forma de plásmido recombinante). Si el tamaño es
relativamente grande, la transformación se complica y debe acudirse al empaquetamiento
previa en forma de fagos, aprovechando las secuencias cos.
D. Cromosomas artificiales
Este tipo de vectores se ha diseñado en especial para adaptarse al gran tamaño de insectos
requeridos en el caso del genoma humano y de otros mamíferos, y para la clonación en
células eucarióticas.
1. Cromosomas artificiales bacterianos
Se les llama comúnmente BACs (bacterial artificial chromosomes). Se trata de
vectores sintéticos derivados del plásmidos F o el fago P1. Se caracterizan, en primer
lugar, por aceptar grandes insertos de ADN, entre 100 y 300 Kb. En comparación
con otros tipos de vectores, los BACs contienen grandes genes que reducen su
capacidad de copia, es decir, de replicación en una célula anfitriona del ADNr
formado. Como resultado, se consigue mayor estabilidad de los insertos de ADN de
origen eucariótico, que en cósmidos sufren con frecuencia reordenamientos internos.
Gracias a estas dos características, los BACs son vectores adecuados para la
elaboración de genotecas eucarióticos.
2. Cromosomas artificiales de levadura
Los YACs (yeast artificial chromosomes). Son vectores sintéticos que contienen las
tres regiones relacionadas con la funcionalidad de un cromosoma: secuencias
sustituyentes de un centrómero, de dos telómeros y de un origen de replicación.
Además, incorporar genes marcadores seleccionables y un sitio de clonado múltiple
en la que admite un inserto de gran tamaño, que puede alcanzar 1Mb, lo que
constituye una característica fundamental. En ocasiones, este tipo de vectores se

22. denominan ARS/CEN/TEL, por los tres tipos de secuencias que contienen. La
secuencia centromérica permite la segregación correcta de las copias hijas del
cromosomas durante la división de la célula. Mientras que los telomeros estabilizan,
como ya se ha estudiado, los cromosomas a lo largo de sucesivas divisiones. El
origen de replicación o secuencias de replicación autónoma (ARS, autonomously
replicating sequence) permite la formación de copias del cromosoma artificial de
forma independiente a la del genoma propio de la célula anfitriona. Los YACs se
utilizan en particular para preparar genotecas de genomas muy grandes, o para
mantener un gen completo en un único clon.
• BIBLIOGRAFIA
 LUQUE C., José. “BIOLOGÍA MOLECULAR E INGENIERÍA GENÉTICA”. 1° ed.
Editorial Harcourt. Madrid.
 PERERA, Julián. “INGENIERÍA GENÉTICA VOLUMEN 1: Preparación, Análisis,
Manipulación Y Clonaje De DNA. Editorial Síntesis. Madrid.