Este documento describe técnicas de biología molecular como la PCR, el uso de enzimas de restricción, electroforesis en gel y clonación molecular. Explica cómo estas técnicas permiten aislar, amplificar, cortar y recombinar fragmentos de ADN de diferentes orígenes para estudiar y modificar genes.

1. BIOLOGIA MENCIÓN
BM-34
UNIDAD I: ORGANIZACIÓN, ESTRUCTURA Y ACTIVIDAD CELULAR
GENOMA, GENES E INGENIERÍA GENÉTICA
BIOLOGÍA MOLECULAR II
BIOTECNOLOGÍA
Gen de interés cortado
con enzimas de
Tecnología de ADN restricción
recombinante
Clonación del
ADN
Proteína que se
utiliza para simular
nieve a una mayor
temperatura

2. INTRODUCCION
Es sabido que la información genética se encuentra guardada en pequeñas partículas especiales
que llamamos cromosomas, y en ellos, se encuentra el DNA organizado en unidades funcionales
que conocemos como genes. La transmisión de la información genética de un individuo a otro
generalmente es entre individuos de una misma especie ya que la naturaleza impone ciertas
barreras biológicas, sin embargo, por otro lado también la misma naturaleza ofrece la posibilidad
de que la información hereditaria traspase las barreras de las especies, como es el caso de
algunos virus y algunas bacterias que funcionan como verdaderos movilizadores de información
genética entre especies, así la bioquímica y la biotecnología han logrado reproducir estos
procesos. Con el correr del tiempo los científicos también se percataron que los seres vivos tienen
mecanismos para defenderse de estos genomas foráneos que eran insertados por los virus y/o
bacterias, así, la era del ADN recombinante (o ingeniería genética) se inició en la década de
1970. Cuando los investigadores descubrieron que las bacterias se protegen de la infección por
virus debido a la presencia de ciertas enzimas que restringen o interfieren la invasión viral. Ellas
provocan cortes del ADN viral en sitios específicos el que ahora cortado, no puede realizar la
síntesis de las proteínas del propio fago. Los científicos llamaron a estas proteínas enzimas de
restricción que ha permitido obtener secuencias de nucleótidos determinadas produciendo
fragmentos de ADN reproducibles que pueden generar clones (DNA cloning). Pero por otra parte,
la biotecnología podría utilizar la siguiente frase “logremos que las modificaciones del genoma de
organismos simples, nos ayude a modificar el genoma de organismos superiores”
1. MANIPULACIÓN DE ADN
AMPLIFICACIÓN DE ADN IN VITRO
La técnica de reacción en cadena de la polimerasa o PCR, del inglés Polymerase Chain Reaction,
revolucionó la biología molecular. Kary Mullis fue el desarrollador de la técnica del PCR en 1983 y
fue galardonado en 1993 con el Premio Nobel de Química por su descubrimiento.
La idea de la reacción en cadena de la polimerasa es simple, se utilizan dos cebadores o primers
que son complementarios a las cadenas opuestas de una secuencia de ADN, lo que permite que la
enzima ADN polimerasa actúe sobre ellos para replicar el ADN. Si este procedimiento se realiza
cíclicamente, el resultado es una gran cantidad de una secuencia de ADN de interés.
 Teoría de la reacción en cadena de la polimerasa o PCR: Etapas (Figura 1)
A) Desnaturalización: El ADN que se quiere amplificar se desnaturaliza a través de la
separación de ambas hebras. Este ADN no necesita estar purificado ni clonado, y puede
provenir de distintas fuentes, incluyendo ADN genómico, muestras forenses como sangre
seca o semen, muestras almacenadas en registros médicos, pelos, restos momificados y
fósiles. El ADN es desnaturalizado por calor a unos 95ºC hasta que se disocia en cadenas
simples, normalmente en unos 5 minutos.
B) Hibridación: Luego de la separación los cebadores o primeros hibridan el ADN de cadena
simple. Los cebadores son oligonucleótidos sintéticos que hibridan con las secuencias
flanqueantes del segmento a amplificar. Generalmente se utilizan dos cebadores diferentes,
cada uno de ellos tiene una secuencia complementaria a una de las dos cadenas del ADN.
Los cebadores se alinean con sus extremos 3` encarados ya que hibridan a cadenas
opuestas. Al necesitar cebadores sintéticos se requiere alguna información de la secuencia
del ADN a amplificar.
2

3. C) Elongación: Finalmente a la mezcla de reacción se le añade una ADN polimerasa resistente
al calor, enzima que extiende los cebadores en dirección 5`- 3` utilizando como molde al
ADN de cadena simple unido al cebador. El producto es una molécula de ADN de doble
cadena con los cebadores incorporados en el producto final.
2
3
1
Figura 1. Técnicas de PCR (amplificación de ADN).
1 Desnaturalización: los fragmentos del ADN a amplificar se calientan a 95ºC para romper los
puentes de hidrógeno que mantienen unidas ambas hebras del ADN. 2 Hibridación: se baja la
temperatura a 55 ºC para que los cebadores o primers se unan de manera complementaria a cada
hebra del ADN. 3 Elongación: se sube la temperatura hasta 72ºC para que la enzima Taq ADN
polimerasa agregue nucleótidos libres a cada hebra de ADN para generar las hebras
complementarias. Luego este proceso se repite varias veces y se obtiene gran cantidad de
moléculas de ADN de interés.
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4. CORTES EN LA MOLÉCULA DE ADN (Figura 2)
Una herramienta muy útil en biotecnología y necesaria para las tecnologías del ADN recombinante
son las endonucleasas de restricción o simplemente llamadas enzimas de restricción. Estas
enzimas, aisladas en bacterias, reciben su nombre debido a que limitan o previenen las
infecciones víricas degradando el ácido nucleico invasor. Las enzimas de restricción reconocen una
secuencia específica de nucleótidos, denominados sitios de restricción, de una molécula de ADN
de doble cadena y cortan en esa secuencia (Figura 2). El premio Nobel de 1978 se otorgó a
Werner Arber, Hamilton Smith y Daniel Nathans por su investigación sobre enzimas de restricción.
Hasta la fecha se han aislado y caracterizado casi 200 tipos de enzimas de restricción diferentes.
La capacidad para cortar el ADN en lugares específicos es importante por dos razones:
 En primer lugar, permite generar mapas físicos en el ADN que se construyen a partir de la
localización de sitios de corte para enzimas de restricción. Estos mapas de restricción
proporcionan datos cruciales para identificar y trabajar con moléculas de ADN.
 En segundo lugar, la escisión o cortes por endonucleasa de restricción permite la creación de
moléculas recombinantes. La capacidad de construir moléculas recombinantes es
importante para la investigación, porque muchos pasos en el proceso de clonación y
manipulación de ADN requieren la capacidad de combinar moléculas de ADN de diferentes
orígenes.
Figura 2. Corte del ADN por enzimas de restricción y unión por ADN ligasa.
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5. Si se quieren unir dos fragmentos de ADN provenientes de distintos orígenes (ADN
recombinante), se pueden utilizar enzimas de restricción que reconozcan secuencias de ADN
presentes en ambos fragmentos y luego los corten, generando fragmentos complementarios que
hibridarán y serán unidos gracias a la ayuda de la enzima ADN ligasa.
SEPARACIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN: ELECTROFORESIS EN GEL
Muchos procedimientos que evalúan las moléculas de ADN utilizan electroforesis en gel (figura
Nº3). Esta técnica usa un gel como tamiz molecular para separar los ácidos nucleicos o las
proteínas en función de su tamaño, su carga eléctrica y otras propiedades físicas. Como las
moléculas de ácidos nucleicos poseen cargas negativas en sus grupos fosfato, en un campo
eléctrico viajan hacia el polo positivo. A medida que se mueven, la mayor parte de las fibras
poliméricas obstruyen el paso de las moléculas más largas en mayor medida que el de las
moléculas más cortas, de esta manera las separa de acuerdo con su longitud. Por tanto, la
electroforesis en el gel separa una mezcla de moléculas de ADN lineal en bandas, cada
una formada por moléculas de ADN de la misma longitud.
s
Figura 3. Electroforesis de ADN en gel.
En el análisis de fragmentos de restricción, los fragmentos de DNA obtenidos después de la
digestión de una molécula de DNA con enzimas de restricción, se separan mediante electroforesis
en gel. Cuando la mezcla de fragmentos de restricción que proviene de una molécula de DNA
específica se somete a electroforesis, se obtiene un patrón de bandas característico de la molécula
original y de la enzima de restricción utilizada.
5

6. Como el ADN se puede extraer el gel en forma íntegra, el procedimiento también proporciona una
forma de preparar muestras puras de fragmentos individuales.
El análisis de fragmentos de restricción también es útil para comparar dos moléculas de DNA
diferentes; por ejemplo, dos alelos de un gen. Una enzima de restricción reconoce una secuencia
específica de nucleótidos y un cambio en un solo par de bases impide que se corte en un sitio
específico. Por tanto, si se presentan diferencias en los nucleótidos entre los alelos dentro de una
secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción, la digestión con esa enzima permite
obtener una mezcla de fragmentos de cada alelo. De esta manera, cada mezcla proporciona su propio
patrón de bandas en la electroforesis en gel. Por ejemplo, la anemia falciforme se debe a una
mutación en un solo nucleótido dentro de una secuencia de restricción en el gen de la β-
globina.
Como se ilustra en la Figura el análisis de fragmentos de restricción por electroforesis puede distinguir
los alelos normales de este gen de los alelos que producen células falciformes.
Alelo normal -globina
175 bp 201 bp Fragmento grande
Ddel Ddel Ddel Ddel
Alelo de la β-globina con la mutación causante
de la anemia drepanocítica
376 bp
Fragmento grande
Ddel Ddel Ddel
a) Sitios de restricción Ddel en los alelos del gen de la
β-globina normal y de la anemia drepanocítica.
Alelo Alelo de la
normal anemia drepanocítica
2
Fragmento
grande
376 bp
201 bp
175 bp
b) Electroforesis de los gragmentos de restricción de los alelos
Normales y de la anemia drepanocítica.
Figura 4. Uso del análisis de fragmentos de restricción para distinguir los alelos normales de los alelos
causantes de la anemia drepanocítica en el gen de la β-globina. La mutación causante destruye uno de los
sitios de restricción Ddel dentro del gen de β-globina.
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7. 2. CLONACIÓN MOLECULAR
El plásmido bacteriano se denomina vector de clonación, que se define como una molécula
de ADN que puede transportar ADN extraño a una célula y replicarse dentro de ella. Los plásmidos
bacterianos se emplean de forma universal como vectores de clonación debido a dos razones. En
primer lugar, pueden aislarse con facilidad de las bacterias y manipularse para formar plásmidos
recombinantes mediante la inserción de ADN extraño in vitro, y luego volver a introducirse en las
células bacterianas. En segundo lugar, las células bacterianas se reproducen con rapidez y en el
proceso multiplican todo el ADN extraño que alberguen.
En la figura Nº4 se muestra un método de clonación de un gen humano específico a través de un
vector de clonación representado por un plásmido bacteriano. Los números de los pasos en la
figura se explican en detalle a continuación.
1 Se comienza con el aislamiento del plásmido bacteriano de la célula de E. coli y del ADN que
contiene el gen en cuestión de células humanas cultivadas en el laboratorio. El plásmido ha sido
sometido a ingeniería genética para portar dos genes que más adelante serán útiles: ampr que
determina que las células de E. coli sean resistentes al antibiótico ampicilina, y lacZ, que codifica
una beta-galactosidasa, esta enzima hidroliza el azúcar lactosa y también una molécula sintética
similar denominada X-gal. Dentro del gen lacZ hay una sola copia del sitio de restricción
reconocido por la enzima de restricción empleada en el siguiente paso.
ADN
Figura 5. Clonación molecular.
7

8. 2 La misma enzima de restricción digiere el plásmido como el ADN humano y produce
extremos cohesivos o adherentes. La enzima corta el ADN del plásmido en el único sitio de
restricción dentro del gen lacZ, pero también corta el ADN humano en múltiples sitios, generando
varios miles de fragmentos. Uno de los fragmentos de ADN humano transporta el gen de interés.
3 Luego de mezclar los fragmentos de ADN humano con los plásmidos cortados para permitir
la formación de pares de bases entre los extremos adhesivos complementarios. A continuación se
agrega una ADN ligasa que forma uniones permanentes entre los pares de bases de los plásmidos
y los fragmentos de ADN humanos. Alguno de los plásmidos recombinantes resultantes contiene
fragmentos de ADN humano como los tres que se ilustran en la figura. Este paso también genera
otros productos, como por ejemplo, un plásmido que contiene varios fragmentos de ADN humano,
una combinación de dos plásmidos o una versión no recombinante del plásmido original que se
volvió a unir.
4 El ADN preparado en el paso 3 se mezcla con bacterias portadoras de una mutación de su
propio gen lacZ, que las imposibilita para metabolizar la lactosa. Bajo condiciones experimentales
adecuadas, las células adquieren ADN extraño por transformación. Algunas células obtienen un
plásmido recombinante portador del gen en cuestión. Sin embargo muchas otras células
incorporan un plásmido recombinante portador de un gen distinto, un plásmido no recombinante o
un fragmento de ADN humano. Estas distintas posibilidades se comentarán más adelante.
5 En este paso de la clonación, las bacterias se siembran en un medio sólido de nutrientes
(agar) que contiene ampicilina y X-gal, que es una molécula similar a la lactosa. El uso de este
medio permite identificar los clones de células transformadas con un plásmido recombinante.
¿Cómo podemos reconocer los clones de células portadoras de plásmidos
recombinantes?
 En primer lugar, solo las células con plásmidos se reproducen porque solo estas células
tienen el gen ampr, que les confiere resistencia contra la ampicilina del medio. Cada bacteria
que se reproduce genera un clon después de varias divisiones celulares, lo que produce un
gran grupo de células que descienden de la célula original. Una vez que el clon alcanza unas
105 células se forma una masa o colonia de células visibles en la placa de agar. A medida
que las células se reproducen también se copian, o clonan, todos los genes extraños
transportados por los plásmidos recombinantes.
 En segundo lugar, el color de las colonias permite distinguir las colonias bacterianas
con plásmidos recombinantes de las que tienen plásmidos no recombinantes. Las
colonias con plásmidos no recombinantes y el gen lacZ intacto son de color azul
porque producen beta-galactosidasa funcional, que hidroliza el X-gal en el medio y forma un
producto de color azul. En cambio, en colonias con plásmidos recombinantes que
tienen ADN extraño insertado en el gen lacZ no se produce beta-galactosidasa
funcional; por tanto, estas colonias son de color blanco.
Hasta este momento, el procedimiento permite clonar muchos fragmentos diferentes de ADN
humano, no solo el que interesa en el experimento. La parte final más difícil de la clonación
de un gen específico es identificar la colonia que contiene el gen entre varios miles de
colonias portadoras de otros fragmentos de ADN humano.
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9. IDENTIFICACIÓN DE CLONES PORTADORES DE UN GEN DE INTERÉS
Para rastrear todas las colonias con plásmidos recombinantes (las colonias blancas del método
explicado antes) en busca de un clon de células que contengan un gen de interés, se puede
buscar el gen propiamente dicho o su producto proteico. En el primer sistema, que describimos
aquí, se detecta el ADN del gen a través de su capacidad de formar pares de bases con una
secuencia complementaria en otra molécula de ácido nucleico, proceso denominado hibridación
de ácido nucleico. La molécula complementaria, un ácido nucleico corto de cadena simple que
puede ser tanto ADN o ARN, se denomina sonda de ácido nucleico. Si se conoce por lo menos
parte de la secuencia nucleotidica del gen en cuestión (a partir de las proteínas que codifica o de
su secuencia en el genoma de una especie relacionada) se puede sintetizar una sonda
complementaria con esta molécula. Por ejemplo, si parte de la secuencia en una cadena del gen
estudiado es 5`GGCTAACTTAGC3` se deberá sintetizar la siguiente sonda: 3`CCGATTGAATCG5`
Cada molécula de la sonda, que forma puentes de hidrógeno específicas con una cadena
complementaria en el gen estudiado, se marca con un isotopo radioactivo o con una marca
fluorescente para poder rastrearla.
Por ejemplo, se pueden trasladar unas pocas células de cada colonia blanca ilustrada en la
figura 4 (paso 5) a un punto en una nueva placa de agar y permitir que se formen nuevas
colonias. Una forma en que estos clones bacterianos pueden evaluarse de forma simultánea para
determinar la presencia de ADN complementario a una sonda de ADN. Un paso esencial de este
método es la desnaturalización de ADN circular; esto es, la separación de sus dos cadenas. Al
igual que la desnaturalización de las proteínas, este proceso se lleva a cabo con productos
químicos o calor.
Una vez identificada la ubicación de una colonia portadora del gen deseado se pueden hacer
proliferar algunas células procedentes de esas colonias en un medio de cultivo líquido en un
tanque grande para luego aislar con facilidad grandes cantidades del gen. Además, se puede usar
el mismo gen clonado como sonda para identificar genes similares o idénticos de ADN de otros
orígenes, como por ejemplo, ADN de otras especies.
a) Vectores
Después de unirse a un vector o vehículo de clonación, un segmento de ADN puede llegar a entrar
en una célula huésped y replicarse o clonarse. Los vectores son, esencialmente, moléculas
de ADN transportadoras. Para servir de vector, una molécula de ADN debe tener unas
determinadas características:
 Poder replicarse independientemente junto con el segmento de ADN que transporta.
 Contener algunos sitios de corte para enzimas de restricción, presentes sólo una vez en el
vector. Estos sitios de restricción se cortan con una enzima de restricción y se utilizan para
insertar segmentos de ADN cortados con la misma enzima.
 Tener algún marcador de selección (normalmente genes de resistencia a antibióticos o genes
de enzimas que la célula huésped no tenga) para poder distinguir las células huésped que
transportan el vector de las que no lo contienen.
 Ser fácil de recuperar desde la célula huésped.
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10. Actualmente se utilizan varios tipos de vectores, los más utilizados son: los plásmidos y los
bacteriófagos.
 Plásmidos: Los plásmidos son moléculas de ADN de doble cadena extracromosómicas de
origen natural que tienen un origen de replicación (ori+) y que se replica automáticamente
en las células bacterianas. Para poder utilizarlos en ingeniería genética se han modificado o
diseñado muchos plásmidos de manera que contengan un número limitado de sitios de
restricción y genes de resistencia a antibióticos específicos. El vector pBR322 fue uno de los
primeros plásmidos diseñados que se utilizó en ADN recombinante (Figura 6a).
 Bacteriófagos: Corresponden a virus capaces de infectar bacterias, por lo que a su ADN se
les puede insertar genes de forma similar que a los plásmidos bacterianos, para
posteriormente introducirlos en bacterias que puedan clonarlo. Uno de los bacteriófagos más
utilizados es el bacteriófago lambda, del cual se han identificado y ubicado todos su genes y
se conoce toda la secuencia nucleotidica de su genoma (Figura 6b).
a) b)
Figura 6. a) muestra el plásmido pBR322, las líneas que seccionan el plásmido muestran varios sitios de
cortes para distintas enzimas de restricción como EcoRI o BamHI que son las más utilizadas. Además
muestra en líneas sombreadas dos genes de resistencia a antibióticos (ampicilina y tetraciclina) utilizados
como marcadores de selección, y un sitio desde donde se origina la replicación del plásmido (ori+).b)
muestra la morfología de un bacteriófago capaz de infectar bacterias para transferir su ADN.
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11. 3. INGENIERÍA GENÉTICA
La posibilidad de clonar genes individuales para el análisis marcó el comienzo de una era de
progreso sin precedentes en la investigación. A la vez, este desarrollo fue acompañado de grandes
anuncios de los posibles avances médicos y otras aplicaciones. La capacidad para diseñar
genéticamente cualquier tipo de célula u organismo es un largo camino por recorrer. Pero nos
estamos acercando a esta posibilidad, lo que ha generado entre los científicos mucho entusiasmo
y controversia.
 Vectores de expresión y formación de productos génicos.
Una variedad de vectores especializados se han construido desde el desarrollo de la tecnología de
clonación. Un tipo muy importante de vector, es el de expresión. Estos vectores contienen las
secuencias necesarias para dirigir la expresión de ADN insertado en un tipo celular específico, es
decir, las secuencias correctas para permitir la transcripción y traducción del gen. La producción
de proteínas recombinantes en bacterias, por ejemplo, utiliza vectores de expresión con
promotores bacterianos y otras regiones de control. Las bacterias transformadas por dichos
vectores sintetizan grandes cantidades de la proteína codificada por el ADN insertado. Productos
farmacéuticos se han producido de esta manera, la primera de las cuales era la insulina, que
se utiliza para tratar la diabetes.
 Organismos transgénicos
La capacidad de introducir los genes en una célula huésped, o para introducir genes de la
misma célula, es un tema del cual se encarga la ingeniería genética. Un animal que contiene un
gen que se ha introducido sin el uso de la reproducción convencional se llama un animal
transgénico. Vamos a explorar una serie de usos de animales transgénicos en medicina y la
agricultura, pero es importante darse cuenta de que su uso original era para la investigación
básica.
La capacidad para diseñar genes permite que un
experimentador se plantee preguntas que nunca podría
plantearse de otra manera. Un ejemplo dramático fue el uso
del gen “sin ojos” de ratones en Drosophila. Cuando este gen
de ratón se introdujo en Drosophila, se originó una mosca
transgénica sin ojos, quedando demostrada la capacidad de
sustituir un gen de Drosophila en la organización de la
formación de ojos. Incluso podría causar la formación de ojos
en lugares incorrectos cuando se expresa en el tejido que
normalmente no forman ojos. Este resultado muestra que la
formación del ojo compuesto de un insecto no es tan
diferente de la formación del ojo de los vertebrados.
Una de las formas de obtener un animal transgénico es
microinyectando el gen en el núcleo de un cigoto, luego el
embrión se implanta en un útero de la misma especie y se
obtiene un organismo transgénico con el gen de interés, por
ejemplo capaz de producir una proteína humana (Figura 7).
11 Figura 7. Formación de un animal transgénico.

12. En plantas, uno de los métodos más utilizados es introducir genes, en el tejido meristemático
(embrionario), capaz de originar una planta completa, a través del plásmido Ti recombinante
como vector. Se introduce el gen de interés en el plásmido Ti y se introduce en bacterias
Agrobacterium tumefaciens (Figura 8, izquierda), con las cuales se infectan las células
meristemáticas. Estas células infectadas formaran un callo, que posteriormente se incuba con
hormonas vegetales, para producir una planta transgénica completa, con el gen de interés, como
por ejemplo el gen de la luciferasa. (Figura 8, derecha)
Figura 8. Utilización del plásmido Ti para producir plantas transgénicas. A la derecha se presenta una planta
de tabaco expresando un gen de la luciérnaga, el gen de la luciferasa que codifica una enzima que cataliza
una reacción química que libera energía luminosa.
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13.  Organismos Knockout
Una de las tecnologías más importantes para fines de investigación es la mutagénesis in vitro, que
consiste en la capacidad de crear mutaciones en cualquier sitio en un gen clonado para examinar
su efecto sobre la función. Un objetivo es reemplazar un gen normal o silvestre por una copia
mutante, para probar la función del gen mutado. Desarrollado por primera vez en la levadura,
esta técnica se ha extendido ahora al ratón.
Algunos ratones tienen genes que han sido deliberadamente "apagados". Estos ratones,
llamados ratones knockout de genes, se producen por mutagénesis que generan una pérdida de la
función de un gen. Los ratones knockout son muy útiles para estudiar la función de genes y
enfermedades genéticas, ya que, un investigador puede observar los cambios específicos
en la expresión de genes y rasgos. Por ejemplo, los científicos están usando un ratón knockout
de genes para estudiar la obesidad, como se puede ver en la figura Nº8. El ratón knockout (a la
izquierda) no tiene un gen funcional de una proteína llamada leptina, que ayuda a controlar la
ingesta de alimentos. Los investigadores están usando este tipo de ratón para estudiar la
obesidad.
Figura 9. A la izquierda ratón knockout de leptina, a la derecha ratón normal o silvestre.
4. APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGÍA
a) APLICACIONES MÉDICAS
Diagnóstico y tratamiento de enfermedades
Es una de las más recientes innovaciones para el diagnóstico de enfermedades contagiosas, en
especial, a través del uso de los PCR. Por ejemplo, como la secuencia del ARN genómico del
VIH se conoce, es posible usar un PCR para amplificar, y así detectar, el ARN del VIH en
la sangre o muestras de tejido.
Los médicos pueden ahora diagnosticar cientos de enfermedades genéticas usando PCR
con primers que reconocen los genes asociados con ese desorden. El producto de ADN
amplificado es luego secuenciado para revelar la presencia o ausencia de la mutación causante de
la enfermedad. Entre los genes para enfermedades humanas que han sido identificadas están la
anemia falciforme, hemofilia, fibrosis quística, enfermedad de Huntington y distrofia
muscular de Duchenne. Los individuos afectados con enfermedades como estas pueden ser
identificados antes de presentar los síntomas, incluso antes de nacer. Un PCR puede también ser
usado para identificar portadores asintomáticos de enfermedades recesivas.
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14. Las técnicas antes descritas también han permitido mejoras el tratamiento de enfermedades.
Analizando la expresión de muchos genes en pacientes con cáncer de mamas, investigadores han
encontrado correlaciones entre los patrones de expresión de varios genes con la posibilidad de
desarrollar el cáncer. El análisis de la expresión génica permite a médicos y pacientes acceder a
información valiosa para considerar opciones de tratamiento.
Terapia Génica
La introducción de genes en individuos afectados con fines terapéuticos, tiene gran
potencial para el tratamiento de un número relativamente pequeño de desórdenes asociados sólo
a un gen defectuoso. En teoría, un alelo normal del gen defectuoso puede ser insertado en
células somáticas del tejido afectado por el desorden.
Para que la terapia génica de células somáticas sea permanente, las células que reciben el alelo
normal deben ser las únicas que se multipliquen a lo largo de la vida del paciente. Las células de
la médula ósea, las que incluyen células madre que originan todas las células sanguíneas, son los
primeros candidatos.
La figura 9 muestra un procedimiento posible de terapia génica para un individuo cuyas células
de su médula ósea no pueden
producir una enzima vital por
poseer un único gen defectuoso. Si
el tratamiento es exitoso, las células de
la médula ósea del paciente
comenzarán a producir la proteína
faltante, y el paciente puede curarse.
El procedimiento mostrado en la figura
fue usado en pacientes con un tipo de
Inmunodeficiencia Severa Combinada
(SCID). En una prueba realizada en
Francia en el 2000, diez niños con SCID
fueron tratados con el mismo
procedimiento. Siete de estos pacientes
mostraron mejoras significativas luego
de dos años. Sin embargo, tres de
estos pacientes desarrollaron leucemia,
y uno de ellos falleció.
Así la terapia génica plantea varias
cuestiones técnicas. Por ejemplo ¿cómo
se puede asegurar que la inserción de
un gen no afecta otras funciones
celulares? O ¿cómo se puede controlar
la actividad de los genes transferidos
para que sinteticen una cantidad
apropiada del producto?
Figura 10. Terapia génica en células de la médula ósea.
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15. b) APLICACIONES FARMACÉUTICAS
● Síntesis de pequeñas moléculas para ser usadas como drogas.
La determinación de la secuencia y estructura de proteínas cruciales para la sobrevivencia
de células tumorales ha permitido la identificación de pequeñas moléculas que combaten
ciertos tipos de cánceres bloqueando la función de estas proteínas. Las drogas que trabajan
de este modo han sido usadas exitosamente para tratar la leucemia mielogénica crónica
(CML), algunos tipos de cáncer de mama y de pulmón. Estas aplicaciones sólo son
posibles en cánceres para los que la base molecular es bien conocida.
● Producción de proteínas en cultivos celulares.
Por medio de las técnicas de ingeniería genética, es posible producir grandes cantidades de
proteínas que naturalmente están presentes en pequeñas cantidades. Las células que
reciben el gen de interés pueden sintetizar y secretar una proteína, simplificando la tarea de
purificación por métodos bioquímicos tradicionales.
Entre los primeros productos farmacéuticos “manufacturados” de esta forma, se encuentra
la insulina humana y la hormona del crecimiento.
● Producción de proteínas en animales.
En algunos casos, en vez de usar sistemas celulares para producir grandes cantidades de
productos proteicos, los farmacéuticos pueden usar animales completos. Pueden introducir
un gen desde un animal en el genotipo de otro individuo, a menudo de diferentes especies.
A este individuo se le denomina animal transgénico. Este animal ahora puede actuar como
una fábrica farmacéutica. Por ejemplo, el gen para una proteína sanguínea humana
como la antitrombina puede ser insertada en el genoma de una cabra donde la vía
de secreción del producto transgénico es la leche del animal (Figura Nº12). La
proteína luego es purificada desde la leche (que es más fácil que la purificación desde
cultivos celulares). Los investigadores también han creado pollos transgénicos que expresan
grandes cantidades de un producto en sus huevos.
Las compañías biotecnológicas consideran las características de los posibles animales
candidatos para decidir cuál usar para la manipulación. Por ejemplo, una cabra se reproduce
más rápido que una vaca, y es posible obtener más proteínas de la leche de cabra que de la
leche de otros mamíferos que se reproducen más rápidamente, como los conejos.
Figura 11. Animal transgénico que produce en su leche una proteína sanguínea.
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16. Las proteínas humanas producidas por animales transgénicos pueden diferir
sutilmente en algunos aspectos de la proteína naturalmente producida. Por esto, las
proteínas deben ser probadas cuidadosamente para asegurarse que estas (u otros
contaminantes de los animales domésticos), no provoquen reacciones alérgicas u otros
efectos adversos en pacientes.
c) APLICACIONES EN AGRICULTURA Y GANADERÍA
Los científicos están trabajando para aprender más acerca de genomas de plantas y animales de
importancia agronómica. Por algunos años, han usado la tecnología del ADN en un esfuerzo por
mejorar la productividad agrícola.
Las tecnologías del ADN permiten a los científicos producir animales transgénicos. Los
objetivos de crear un animal transgénico son a menudo los mismos objetivos que a cría
tradicional, por ejemplo crear una oveja con lana de mejor calidad, o un cerdo con carne menos
grasa, o una vaca que madure en un tiempo más corto. Los científicos pueden, por ejemplo,
identificar y clonar un gen que provoque el desarrollo de músculos más grandes en el ganado y
transferirlo incluso a una oveja. Sin embargo, problemas como una menor fertilidad o un
aumento en la susceptibilidad a enfermedades no son extraños en animales que portan
genes de otras especies. La salud animal es un punto importante a considerar cuando se
desarrollan animales transgénicos.
En agricultura los científicos ya cuentan con un número de plantas para cultivos con genes para
caracteres deseables, tales como maduración tardía y resistencia a enfermedades,
herbicidas, insecticidas, e incluso resistentes a condiciones del suelo como la salinidad.
Las plantas son fáciles de manipular genéticamente a diferencia de la mayoría de los animales.
Para muchas especies de plantas, un simple tejido puede crecer en un cultivo para originar una
planta adulta. Así, la manipulación genética puede llevarse a cabo en una simple célula somática y
luego esta célula puede ser usada para originar un organismo completo con las nuevas
características.
El vector más comúnmente usado para introducir genes nuevos en células vegetales es un
plásmido, llamado plásmido Ti, obtenido desde la bacteria Agrobaterium tumefaciens. Este
plásmido integra segmentos de su ADN, en el ADN cromosómico de la célula vegetal
hospedera.
¿Cómo los biotecnólogos podrían solucionar problemas agrícolas? (Tabla Nº1).
Tabla 1. Biotecnología y problemas agrícolas a solucionar.
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17. Preguntas de selección múltiple
1. Se utilizó una misma enzimas de restricción para un gen que codifica un factor de
coagulación, siendo el gen N el alelo normal y el gen D el alelo causante de una enfermedad.
La imagen muestra los patrones obtenidos de una electroforesis para ambos fragmentos.
Con esta información es correcto inferir que el alelo
I) causante de la enfermedad posee dos sitios de restricción.
II) normal es más largo que el alelo causante de la enfermedad.
III) normal posee más sitios de restricción que el alelo causante de la enfermedad.
A) Solo I.
B) Solo II.
C) Solo III.
D) Solo I y II.
E) I, II y III.
2. Queda mejor definido un vector de clonación como
A) un gen con resistencia a antibióticos.
B) una bacteria modificada con un gen exógeno.
C) un virus o bacteria que replica material genético con facilidad.
D) un organismo utilizado para sintetizar proteínas recombinantes.
E) una molécula de ADN a la cual se le pueden introducir nuevos genes con facilidad.
3. La amplificación del ADN in vitro por la técnica de reacción en cadena de la polimeraza (PCR),
se realiza en los siguientes pasos
I) desnaturalización (separación de las hebras de ADN).
II) hibridación (cebadores o primers hibridan el ADN de cadena simple).
III) elongación (la ADN polimeraza extiende a los colaboradores en dirección 5’ – 3’)
Es (son) correcta(s)
A) solo I.
B) solo II.
C) solo III.
D) solo I y II.
E) I, II y III.
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18. 4. El gráfico muestra la concentración relativa de ADN durante la realización de un PCR, en
donde la letra A señala un aumento de la temperatura y la letra B una disminución.
Con esta información es correcto afirmar que
A) un ciclo de PCR tarda unos tres minutos.
B) la ADN polimerasa no actúa a altas temperaturas.
C) el ADN posee solo hebras simples en el primer minuto.
D) no es aplicable la técnica del PCR.
E) la temperatura no afecta la velocidad de reacción.
5. Una forma que permite curar permanentemente una enfermedad genética es
I) modificar el estilo de vida del individuo afectado.
II) cambiar la secuencia de ADN afectada.
III) translocar el gen afectado.
A) Solo I.
B) Solo II.
C) Solo I y II.
D) Solo II y II.
E) I, II y III.
6. Las bacterias protegen su ADN de los virus por la acción de enzimas de restricción o
endonucleasas de restricción. Al respecto, es correcto afirmar que el hombre las utiliza para
I) combinar moléculas de ADN de diferente origen.
II) combatir enfermedades bacterianas.
III) introducir un segmento de ADN en moléculas de ADN transportadoras.
A) Solo I.
B) Solo II.
C) Solo III.
D) Solo I y II.
E) Solo I y III.
7. Para insertar un gen de interés en el plásmido, como lo muestra la figura, se debe utilizar
A) PCR.
B) mapas de restricción.
C) enzimas de restricción.
D) sitios de restricción.
E) bacteriófago lambda.
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19. 8. A continuación se muestran algunas etapas para generación de ratones capaces de producir
una proteína vegetal en su leche.
L M Z
Es correcto plantear que se señala con la letra
I) L un vector de clonación.
II) M un ADN recombinante.
III) Z un ratón knockout.
A) Solo II.
B) Solo I y II.
C) Solo I y III.
D) Solo II y III.
E) I, II y III.
9. Para la formación de un plásmido recombinante es imprescindible la utilización de
I) ADN ligasa.
II) ADN polimerasa.
III) enzima de restricción.
A) Solo I.
B) Solo I y II.
C) Solo I y III.
D) Solo II y III.
E) I, II y III.
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20. 10. Es común utilizar árboles genealógicos y análisis genéticos para determinar el genotipo de
una familia portadora de una enfermedad. A continuación se muestra un árbol genealógico y
los resultados de una electroforesis, para el gen en cuestión, en donde cada individuo se
señala con una letra distinta.
Con estos resultados es correcto plantear que el individuo
I) A es portador del gen causante de la enfermedad.
II) C es heterocigoto.
III) E es homocigoto recesivo.
A) Solo I.
B) Solo III.
C) Solo I y III.
D) Solo II y III.
E) I, II y III.
11. Sobre la electroforesis es correcto plantear que los fragmentos de
I) igual tamaño forman una misma banda.
II) menor longitud quedan en la superficie.
III) ADN viajan hacia el cátodo.
A) Solo I.
B) Solo II.
C) Solo III.
D) Solo I y II.
E) Solo I y III.
12. Una proteína humana producida por un animal transgénico en el humano puede
I) ser algo distinta de la producida por él.
II) provocarle alergias.
III) bloquear su producción natural.
Es (son) correcta(s)
A) solo I.
B) solo II.
C) solo III.
D) solo I y II.
E) I, II y III.
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21. 13. Las plantas transgénicas pueden adquirir nuevas características que les permiten
I) crecer en ambientes con condiciones adversas.
II) aumentar su concentración de nutrientes.
III) desarrollar resistencia a plagas.
A) Solo I.
B) Solo II.
C) Solo I y II.
D) Solo II y III.
E) I, II y III.
14. ¿Cuál de las siguientes herramientas biotecnológica está mal asociada a su función?
A) Enzimas de restricción – formación de plásmidos recombinantes.
B) ADN ligasa – formación de cortes adhesivos.
C) ADN polimerasa – PCR.
D) Electroforesis – separación de fragmentos de ADN.
E) Vector de clonación – transporte de genes.
15. Las plantas son más fáciles de manipular por ingeniería genética que los animales, porque
A) los genes de las plantas no contiene intrones.
B) existen más vectores disponibles para células vegetales.
C) una célula somática de una planta puede originar una planta completa.
D) se pueden microinyectar genes en núcleos vegetales.
E) las células vegetales no poseen endonucleasas.
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22. RESPUESTAS
Preguntas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Claves C E E A B E C B C E A D E B C
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