ENZIMAS DE RESTRICCIÓN.pdf

UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
CURSO
Biotecnología
DOCENTE
Dr. Soto Gonzales, Hebert Hernan
ESTUDIANTE
Mamani Velasquez, Yanira Brigitte (2019205037)
VII CICLO
ILO-MOQUEGUA
2022

ÍNDICE
I. INTRODUCCIÓN ..........................................................................................................................3
II. OBJETIVOS ...............................................................................................................................3
2.1. Objetivo general......................................................................................................................3
2.2. Objetivos específicos ..............................................................................................................3
III. MARCO TEÓRICO....................................................................................................................3
3.1. New England BioLabs (NEB).................................................................................................3
3.2. Enzimas de restricción ............................................................................................................4
3.3. Funciones y aplicaciones de las endonucleasas de restricción................................................5
3.4. Tipos de endonucleasas de restricción....................................................................................6
3.4.1. Tipo I...............................................................................................................................6
3.4.2. Tipo II .............................................................................................................................6
3.4.3. Tipo III............................................................................................................................6
3.5. Inactividad térmica..................................................................................................................7
3.6. Sensibilidad a la metilación ....................................................................................................7
3.6.1. Estados de metilación del ADN......................................................................................7
3.7. Actividad estelar .....................................................................................................................8
3.8. Isoesquizómero .......................................................................................................................9
3.8.1. Neoesquizómero..............................................................................................................9
3.8.2. Isoesquizómeros que reconocen ADN metilado.............................................................9
3.9. Versión de alta fidelidad .......................................................................................................10
IV. MATERIALES .........................................................................................................................10
V. MÉTODOS ...................................................................................................................................10
VI. RESULTADO...........................................................................................................................12
VII. CONCLUSIONES ....................................................................................................................52
BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................................................53

I. INTRODUCCIÓN
Una enzima de restricción, descubierta simultáneamente entre 1968 y 1970 por Werner
Arber y Hamilton Smith, es una proteína aislada de bacterias que corta hebras de ADN en sitios
de secuencia específicos, creando fragmentos de ADN con una secuencia conocida en cada
extremo. El uso de enzimas de restricción es extremadamente importante para varios métodos
de laboratorio, como la tecnología de ADN recombinante y la edición de genes. (Genome.gov,
2022)
Actualmente el análisis de las endonucleasas de restricción es menos complejo debido
a la existencia de diferentes programas bioinformáticos que facilitan la información de la
misma, un claro ejemplo de esto es New England BioLabs (NEB), que permite observar y
analizar las enzimas de restricción elegidas, permitiéndonos conocer a profundidad cada una
de ellas.
En este trabajo conoceremos algunas enzimas de restricción y sus principales
características, como por ejemplo si son enzimas isoesquizómeras o neoesquizómeras, o las
condiciones para su reacción, entro otros. Por ello, se realizará un análisis conceptual de las
características de 30 enzimas de restricción que se encuentran en la lista del NEB. Asimismo,
se desarrollará una parte teórica relacionado con las endonucleasas y algunos términos técnicos.
II. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general
Analizar conceptualmente las características de 30 enzimas de restricción.
2.2. Objetivos específicos
➢ Seleccionar 30 endonucleasas de la lista de NEB.
➢ Realizar una ficha técnica sencilla de las enzimas de restricción seleccionadas.
III. MARCO TEÓRICO
3.1. New England BioLabs (NEB)
Fundada a mediados de la década de 1970 como un colectivo de científicos
comprometidos con el desarrollo de productos innovadores para la industria de las ciencias de
la vida, New England Biolabs es ahora un líder mundial reconocido en el descubrimiento y

producción de enzimas para aplicaciones de biología molecular. NEB ofrece la mayor selección
de enzimas nativas y recombinantes para la investigación genómica. Si bien las enzimas de
restricción siguen siendo parte de nuestra cartera de productos principal, nuestro catálogo en
constante expansión también incluye productos relacionados con PCR, expresión génica,
preparación de muestras para secuenciación de próxima generación, biología sintética,
glicobiología, epigenética y análisis de ARN. Además, NEB se enfoca en fortalecer alianzas
que permitan que las nuevas tecnologías lleguen a sectores clave del mercado, incluido el
desarrollo de diagnóstico molecular. (New England Biolabs, s. f.-e)
Imagen 1
New England BioLabs (NEB).
3.2. Enzimas de restricción
Las enzimas de restricción son una herramienta primordial para la ejecución de diversos
ensayos útiles en investigación clínica, desde la determinación de polimorfismos de longitud
de fragmentos de restricción (restriction fragment length polymorphism, RFLP), así como en
la construcción de vectores con ADN recombinante y clonación de secuencias de ADN
provenientes de humano, virus, bacterias y demás microorganismos de interés para la
generación de conocimiento o para su aplicación en el área de la medicina. Entre las enzimas
que modifican los ácidos nucleicos se encuentran las nucleasas, las cuales se denominan
endonucleasas si son capaces de cortar el enlace fosfodiéster en nucleótidos localizados dentro
de la cadena del ácido nucleico, y reciben el nombre de exonucleasas si cortan los enlaces
fosfodiéster de los nucleótidos en los extremos de las cadenas. Así, existen 3’exonucleasas las
que escinden enlaces en el extremo 3’ de la cadena, y 5’exonucleasas que rompen enlaces
fosfodiéster en el extremo 5’ de la cadena.
Las enzimas de restricción presentan actividad endonucleasa, son de origen bacteriano
y cortan los enlaces fosfodiéster del ADN en una secuencia específica denominada secuencia
diana. El uso de estas enzimas como herramienta biotecnológica surgió de la necesidad de
cortar las largas cadenas de ADN genómico para manipularse y analizarse en fragmentos más

pequeños. El empleo de las enzimas de restricción y otras enzimas que modifican ácidos
nucleicos, como la ligasa, permitió desarrollar la metodología del ADN recombinante.
Estas endonucleasas se denominan enzimas de restricción debido a que restringen la
permanencia de un ADN exógeno en la célula bacteriana que produce dicha enzima. Las
enzimas de restricción empleadas con más frecuencia en la metodología del ADN
recombinante suelen reconocer una secuencia única de 4 a 8 nucleótidos, donde realizan el
corte. (Mhmedical, 2022)
Imagen 2
Endonucleasas de restricción.
3.3. Funciones y aplicaciones de las endonucleasas de restricción
Las enzimas de restricción son una herramienta básica en clonación e ingeniería
genética; se utilizan para hacer mapas de restricción de plásmidos o genomas. Un mapa de
restricción se define como la serie de fragmentos que se generan por el corte con determinada(s)
enzima(s), específicos en tamaño (y secuencia) y que permiten emplearlos para la
caracterización de dicho ADN. Esta herramienta es sumamente importante para la clonación
con vectores. También, en estudios de determinación de polimorfismos, como la técnica de
RFLP, según se presente o no el sitio de corte de una enzima de restricción, se puede establecer
la variante alélica, ya que el peso molecular del fragmento o fragmentos de ADN generado(s)
permitirá la caracterización de la secuencia. Asimismo, la construcción de moléculas de ADN
recombinante implica el obvio empleo de las enzimas de restricción para definir y delimitar las
secuencias que se insertarán en el constructo recombinante. De la misma manera, el corte de
ADN genómico que suele ser, según el organismo, del orden de millones de pb, es más
manipulable cuando es digerido por estas enzimas en fragmentos más pequeños. Esto permite

un manejo adecuado sin el riesgo de degradación y manipulación para la construcción de
bibliotecas genómicas (Mhmedical, 2022).
3.4. Tipos de endonucleasas de restricción
3.4.1. Tipo I
Las enzimas que pertenecen a este grupo reconocen una secuencia específica de
nucleótidos y hacen un corte aleatorio en la doble cadena en cualquier secuencia del ADN y a
una distancia aproximada de 1000 pb del sitio de corte; además tienen la función de metilar su
propio genoma. Estas enzimas necesitan adenosín trifosfato (ATP) para moverse a lo largo de
la molécula de ADN desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio de corte. (Mhmedical,
2022)
3.4.2. Tipo II
Son enzimas que reconocen secuencias específicas y hacen el corte de la doble cadena
de ADN en el mismo sitio de reconocimiento. Estas enzimas sólo tienen actividad de restricción
no de metilación y son las utilizadas en ingeniería genética, ya que cortan el ADN en secuencias
específicas reconocidas. Requieren Mg2+ como cofactor y no requieren de ADN. Las
secuencias de reconocimiento de estas enzimas son palindrómicas, es decir, son secuencias que
se leen igual en las dos cadenas de ADN. (Mhmedical, 2022)
3.4.3. Tipo III
Estas enzimas reconocen una secuencia específica y cortan el ADN de doble cadena
fuera de la secuencia diana (aproximadamente de 25 a 27 pares de bases corriente abajo del
sitio de reconocimiento). Tienen, al igual de las de tipo I, actividad de metilasa y requieren de
ATP para desplazarse a lo largo de la molécula de ADN. (Mhmedical, 2022)
Tabla 1
Características de las enzimas de restricción tipo I, II y III.

3.5. Inactividad térmica
La inactivación por calor es un método conveniente para detener una reacción de
endonucleasa de restricción. La incubación a 65 °C durante 20 minutos inactiva la mayoría de
las endonucleasas de restricción que tienen una temperatura de incubación óptima de 37 °C.
Las enzimas que no pueden inactivarse a 65 °C a menudo pueden inactivarse mediante
incubación a 80 °C durante 20 minutos. Para las enzimas que no se pueden inactivar con calor
a 65 °C u 80 °C, recomendamos usar una columna para la limpieza (como el Monarch ® PCR
& DNA Cleanup Kit) o ejecutar la reacción en un gel de agarosa y luego extraer el ADN.
(recomendamos el Monarch Gel Extraction Kit), o realizar una extracción con
fenol/cloroformo. (New England Biolabs, s. f.-b)
3.6. Sensibilidad a la metilación
La metilación del ADN es la modificación epigenética (todas las células se crean a partir
del mismo material genético) más estudiada. Muchas enzimas de restricción son sensibles a los
estados de metilación del ADN. La escisión puede bloquearse o deteriorarse cuando se
modifica una base particular en el sitio de reconocimiento de la enzima.
Las enzimas de restricción sensibles a la metilación se pueden utilizar para generar
fragmentos para un análisis epigenético adicional. Cuando se usa junto con un isoesquizómero
que tiene el mismo sitio de reconocimiento, pero que no es sensible a la metilación, se puede
obtener información sobre el estado de la metilación. (New England Biolabs, s. f.-d)
3.6.1. Estados de metilación del ADN
La mayoría de las cepas de laboratorio de E. coli contienen tres metilasas de ADN
específicas del sitio. La metilasa codificada por el gen dam (Dam metilasa) transfiere un grupo
metilo de la S-adenosilmetionina (SAM) a la posición N6 de los residuos de adenina en la
secuencia GATC (1,2). La metilasa Dcm (codificada por el gen dcm; denominada Mec metilasa
en referencias anteriores) metila los (segundos) residuos internos de citosina en las secuencias
CCAGG y CCTGG (1,3) en la posición C5. La metilasa Eco KI, M. Eco KI, modifica residuos
de adenina en las secuencias AAC(N6) GTGC y GCAC(N6) GTT. ecológico Los sitios KI (~1
sitio por 8 kb) son mucho menos comunes que los sitios Dam (~1 sitio por 256 pb) o los sitios
Dcm (~1 sitio por 512 pb) en el ADN de secuencia aleatoria (GC=AT). (New England Biolabs,
s. f.-a)

Estas metilasas son de interés aquí por dos razones. En primer lugar, algunos o todos
los sitios para una endonucleasa de restricción pueden ser resistentes a la escisión cuando se
aíslan de cepas que expresan las metilasas Dam o Dcm. Esto ocurre porque el ADN está
protegido contra la escisión cuando se metila una base particular en el sitio de reconocimiento
de una endonucleasa de restricción. La segunda razón por la que estas metilasas son de interés
es que el estado de modificación del ADN plasmídico puede afectar la frecuencia de
transformación en situaciones especiales. La eficiencia de transformación se reducirá cuando
1) se introduzca ADN de plásmido modificado con Dam en Dam - E. coli (se podría hacer esto
para preparar ADN para digestión con BclI, por ejemplo; y 2) el ADN modificado con Dam o
Dcm se introduce en otras especies bacterianas determinadas. (New England Biolabs, s. f.-a)
3.7. Actividad estelar
En condiciones de reacción no estándar, algunas enzimas de restricción son capaces de
escindir secuencias que son similares, pero no idénticas, a su secuencia de reconocimiento
definida. Esta especificidad alterada se ha denominado "actividad estelar". Se ha sugerido que
la actividad estelar es una propiedad general de las endonucleasas de restricción y que cualquier
endonucleasa de restricción escindirá sitios no canónicos en ciertas condiciones extremas,
algunas de las cuales se enumeran a continuación (New England Biolabs, s. f.-c).
Tabla 2
Condiciones que contribuyen a la actividad estelar y pasos para inhibir esta actividad.

3.8. Isoesquizómero
Son dos enzimas de restricción que comparten la misma secuencia de reconocimiento,
aunque no pueden escindirse en el mismo sitio (por ejemplo, uno puede dejar los extremos
romos y su isoesquizómero con extremos cohesivos). Por el contrario, dos enzimas que
reconocen secuencias ligeramente diferentes y se cortan para dejar los mismos extremos se
denominan isocaudomeros. Un par de isoesquizómeros son las enzimas Asp718 y KpnI. No
debe confundirse con enzimas con extremos compatibles, que, aunque reconocen secuencias
diferentes, dejan extremos cohesivos iguales (y por tanto complementarios) extremos de unión.
Por ejemplo, las enzimas BamHI y Bg/II (www.wiki.es-es.nina.az, 2021).
Imagen 3
Isoesquizómero entre BamHI y Bg/II.
3.8.1. Neoesquizómero
Son un subconjunto de isoesquizómeros que reconocen la misma secuencia, pero se
escinden en posiciones diferentes del prototipo. Así, AatII (secuencia de reconocimiento:
GACGT↓C) y ZraI (secuencia de reconocimiento: GAC↓GTC) son neoesquizómeros entre sí,
mientras que HpaII (secuencia de reconocimiento: C↓CGG) y MspI (secuencia de
reconocimiento: C↓CGG) son isoesquizómeros (New England Biolabs, s. f.).
3.8.2. Isoesquizómeros que reconocen ADN metilado
En algunos casos, uno de los isómeros puede reconocer si su secuencia de restricción
está metilada, mientras que otros isómeros solo pueden reconocer las secuencias no metiladas.
Esta propiedad de ciertos isómeros ayuda a determinar el estado de metilación del sitio de
restricción al analizar el estado epigenético de la secuencia de ADN. (www.wiki.es-es.nina.az,
2021)
Dos ejemplos de tales isómeros son HpaII y MspI, que reconocen la secuencia CCGG
cuando no está metilada. Sin embargo, cuando la segunda citosina está metilada, MspI también
puede reconocer la secuencia, a diferencia de HpaII.

3.9. Versión de alta fidelidad
NEB durante más de 45 años ha desarrollado, en cuanto a las enzimas de restricción,
una línea de enzimas de alta fidelidad (HF, por sus siglas en ingles). Estas enzimas modificadas
comparten la misma especialidad que la enzima original o nativa, con el beneficio adicional de
tener la actividad reducida, una digestión rápida (5 – 15 minutos) y una actividad del 100% en
rCutSmart™ y CutSmart® Buffer (New England Biolabs, s. f.-a).
Fueron diseñadas intercambiando residuos de aminoácidos funcionales y luego
seleccionando mutantes óptimos que funcionan en una variedad de condiciones, ya sea
preparándose para un resumen de 5 a 15 minutos o durante la noche. Asimismo, se tuvo en
cuenta el rendimiento, las enzimas de restricción HF son completamente operativas en una
amplia variedad de condiciones, minimizando los productos fuera del objetivo y brindando
flexibilidad en el diseño de la prueba (New England Biolabs, s. f.-a).
IV. MATERIALES
➢ Laptop
➢ Conexión a internet
➢ New England Biolabs (NEB)
V. MÉTODOS
1. Buscamos la página de NEB en el buscador y la seleccionamos
2. Seleccionamos Applications & Products, luego Product Categories y finalmente en
Restriction Endonucleases.

3. Hacemos clic en Product Listing, y empezamos a seleccionar las enzimas de
restricción.
4. Anotamos los aspectos importantes de las endonucleasas de restricción.

VI. RESULTADO
N ENZIMAS DE RESTRICCIÓN CARACTERÍSTICAS
1
Acc65I
Calificado para la digestión en
5 – 15 min, en las condiciones
de reacción recomendadas.
Sitio de corte: G/GTACC
Es un neoesquizómero de KnpI. Puede exhibir actividad
estelar en NEBuffer 2.1.
FUENTE DEL PRODUCTO: Una cepa de E. coli que
porta el gen Acc65I clonado de Acinetobacter calcoaceticus
65 (SK Degtyrev)
REACTIVOS SUMINISTRADOS: Los siguientes
reactivos se suministran con esta endonucleasa.
DEFINICIÓN DE UNIDAD: La cantidad de enzima
necesaria para digerir 1 µg de ADN de pBC4 en 1 hora a 37
°C en un volumen de reacción total de 50 µl.
CONDICIONES DE REACCIÓN:
1X NEBuffer™ r3.1
Incubar a 37°C
TEMPERATURA ÓPTIMA DE INCUBACIÓN: 37°C
INACTIVIDAD TÉRMICA: 65°C durante 20 minutos.
SENSIBILIDAD A LA METILACIÓN:
Metilación de dam: No sensible.
Metilación de dcm: Bloqueada por algunas combinaciones
de superposición.
Metilación de CpG: Bloqueada por algunas combinaciones
de superposición.
APLICACIONES: Clonación rápida y Digestión de
enzimas de restricción.
Mas información en:
https://international.neb.com/products/r0599-
acc65i#Product%20Information

2
AccI
5 – 15 minutos
100 % de actividad en el búfer
rCutSmart TM
(hay más de 210
enzimas disponibles en el
mismo búfer) lo que permite
digestiones dobles más
sencillas
Sitio de corte: GT/MKAC
Los polienlazadores que se encuentran en los vectores de
clonación M13 y pUC contienen un solo sitio AccI. AccI
requiere al menos 13 pares de bases más allá del final de su
secuencia de reconocimiento para dividirse de manera
eficiente. Se ha demostrado que esta enzima tiene menor
actividad en algunos plásmidos superenrollados y se requiere
más de 1 unidad para digerir 1 µg de ADN plasmídico.
porta el gen AccI de Acinetobacter calcoaceticus (R.
Roberts).
reactivos se suministran con esta endonucleasa.
requerida para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 37°C en
un volumen de reacción total de 50 µl.
1X Tampón rCutSmart TM
Incubar a 37 °C

TEMPERATURA ÓPTIMA DE INCUBACIÓN:37 °C
INACTIVIDAD TÉRMICA: 80 °C durante 20 min.
Metilación de dam: No sensible.
Metilación de dcm: No sensible.
Metilación de CpG: Bloqueada por superposición.
Mas información en:
acci#Product%20Information
3
AlwNI
5 – 15 minutos.
100% de actividad en el búfer
rCutSmart™ (hay más de 210
porta el gen AlwNI clonado de Acinetobacter Iwoffii N (R.
Morgan).
reactivos se suministran con este producto:

sencillas.
Sitio de corte: CAGNNN/CTG
1X Tampón rCutSmart™
Incubar a 37°C
Metilación de dam: No sensible
Metilación de dcm: Bloqueada por superposición
Metilación de CpG: No sensible
Más información en:
alwni#Product%20Information
4
BmtI
Es un neoesquizómero de NheI. No es sensible a la
metilación de CpG, dcm o dam. La actividad estelar puede
resultar de una digestión prolongada.

Versión de alta fidelidad
(HF®)
Calificado para la digestión de
5 – 15 minutos, con la
flexibilidad de digerir durante
la noche sin degradación del
ADN.
Tiene una actividad del 100%
en el tampón rCutSmart™
buffer, la simplicidad de un
solo búfer significa un
procesamiento de muestras
más sencillo y optimizado.
Sitio de corte: GCTAG/C
porta el gen BmtI clonado de Bacillus megaterium S2 (SK
Degtyarev).
requerida para digerir 1 µg de pXba en 1 hora a 37°C en un
volumen de reacción total de 50 µl.
1X NEBuffer™ r3.1
Incubar a 37°C
Metilación de dcm: No sensible
APLICACIONES: Digestión de enzimas de restricción.
bmti#Product%20Information

5
BpuEI
5 – 15 minutos.
100% de actividad en el búfer
sencillas.
Las enzimas de restricción tipo
IIS reconocen secuencias de
ADN asimétricas y se
escinden fuera de su secuencia
de reconocimiento.
Sitio de corte: CTTGAG
(14/16)
Puede exhibir actividad estelar en NEBuffer r1.1 y NEBuffer
r3.1. En función de la estabilidad de la enzima en la
reacción, las incubaciones de más de 1 hora no mejorarán la
digestión, a menos que se agregue enzima adicional. BpuEI
requiere S-adenosilmetionina (SAM) en la mezcla de
reacción para una actividad óptima (SAM se suministra en la
formulación enzimática).
porta el gen BpuEI clonado de Bacillus pumilus 2187 a (C.
Nkenfou).
Incubar a 37°C

enzimas de restricción
bpuei#Product%20Information
6
BstXI
5 -15 minutos.
Sitio de corte:
CCANNNNN/NTGG
La actividad estelar puede resultar de una concentración de
glicerol >5%
porta el gen BstXI clonado de Bacillus stearothermophilus
X1 (N. Weiker).

1X NEBuffer™ r3.1
Incubar a 37°C
Metilación de dcm: Bloqueada por algunas combinaciones
superpuestas
APLICACIONES: Clonación rápida
bstxi#Product%20Information
7
CviKI-1
Es una endonucleasa de restricción con 4 sitios de
reconocimiento esperados, así como hasta once sitios
relajados no afines (sitios estrella). Según la estabilidad de la
enzima en la reacción, las incubaciones de más de 1 hora no
mejorarán la digestión, a menos que se agregue enzima

sencillas
Sitio de corte: RG/CY
adicional. La actividad estelar puede resultar de una
digestión prolongada, una alta concentración de enzimas o
una concentración de glicerol >5%
lleva el gen de restricción CviKI clonado y modificado
derivado de CA-1A, un virus Chlorella.
necesaria para digerir 1 µg de ADN de pBR322 en 1 hora a
37 °C en un volumen de reacción total de 50 µl.
Incubar a 37°C
INACTIVIDAD TÉRMICA: No
https://international.neb.com/products/r0710-cviki-
1#Product%20Information

8
DraI
5 – 15 minutos.
sencillas
Se suministra con 1 vial de
Gel Loading Dye, Morado
(6X)
Sitio de corte: TTT/AAA
Es un isoesquizómero de AhaIII. No es sensible a la
metilación de CpG, dcm o dam.
porta el gen DraI de Deinococcus radiophilus (ATCC
27603).
Incubar a 37°C
INACTIVIDAD TÉRMICA: 65°C durante 20 minutos

drai#Product%20Information
9
EciI
sencillas
de reconocimiento
Según la estabilidad de la enzima en la reacción, las
incubaciones de más de 1 hora no mejorarán la digestión, a
menos que se agregue enzima adicional. La actividad estelar
puede resultar de una digestión prolongada.
porta el gen EciI clonado de Escherichia coli T-8 (R. Croft)

Sitio de corte: GGCGGA
(11/9)
Incubar a 37°C
de superposición
ecii#Product%20Information
10
EcoNI
5-15 minutos
EcoNI produce fragmentos de ADN que tienen una
extensión 5´ de una sola base que son más difíciles de ligar
que los fragmentos de extremos romos.
porta el gen EcoNI clonado de Escherichia coli CDC A-193
(ATCC 12041)

sencillas
Sitio de corte:
CCTNN/NNNAGG DEFINICIÓN DE UNIDAD: La cantidad de enzima
Incubar a 37°C
econi#Product%20Information

11
EcoRI
5-15 minutos
(HF®) suministrada con
rCutSmart™ Buffer
Viene con 1 vial de Gel
Loading Dye, Purple (6X)
Sitio de corte: G/AATTC
Puede exhibir actividad estelar en NEBuffer r2.1 o
rCutSmart Buffer. Se ha demostrado que esta enzima tiene
menor actividad en algunos plásmidos superenrollados, y se
requiere más de 1 unidad para digerir 1 μg de ADN
plasmídico. Bloqueado por algunas combinaciones de
metilación de CpG superpuestas. Además, tiene una versión
de alta fidelidad (EcoRI-)
porta el gen EcoRI clonado de E. coli RY13 (RN
Yoshimori).
1X NEBuffer™ EcoRI/SspI
Incubar a 37°C
de superposición.

ecori#Product%20Information
12
FspEI
sencillas
Especificidad para
modificaciones de ADN
epigenéticamente relevantes
(5-mC y 5-hmC)
Sitio de corte: CC (12/16)
Esta enzima se ha utilizado para el análisis epigenético en el
que FspEI escinde el ADN objetivo que contiene sitios CpG
metilados en ambas cadenas para generar fragmentos de 32
pb que contienen los sitios CpG metilados. Los fragmentos
de 32 pb aislados pueden secuenciarse para revelar sitios de
modificación de 5 mC (Cohen-Karni et al., (2011) PNAS
108: 11040-11045). El uso de exceso de enzima inhibe la
escisión. Puede ser necesaria la optimización de la cantidad
de enzima necesaria para la digestión completa para cada
sustrato de ADN.
La actividad estelar, incluida la digestión de sustratos de
ADN no metilados, puede deberse a condiciones de reacción
no óptimas, como un tiempo de digestión prolongado, una
concentración alta de enzima o activador o una
concentración de glicerol >5 %.
La especificidad óptima de la escisión en los sitios de 5 mC
se puede lograr manteniendo la relación molar de FspEI a los

sitios objetivo de 5 mC entre 0,1:1 y 1:1 en presencia de la
solución activadora de enzimas 1X y la digestión durante
hasta 60 minutos. (La molaridad de FspEI~0,6 μM).
porta el gen FspEI sintético de la especie Frankia EAN1pec.
requerida para digerir 1 µg de ADN de pBR322 (dcm +) en
1 hora a 37°C en un volumen de reacción total de 50 µl.
Suplemento de tampón 1X rCutSmart™
con solución de activador de enzimas 1X
Incubar a 37 °C
APLICACIONES: Enzimas de restricción para epigenética
y Digestión de enzimas de restricción.
fspei#Product%20Information

13
HaeII
5-15 minutos
sencillas
Sitio de corte: RGCGC/Y
Según la estabilidad de la enzima en la reacción, las
incubaciones de más de 1 hora no mejorarán la digestión, a
menos que se agregue enzima adicional. Bloqueado por
metilación de CpG.
porta el gen HaeII de Haemophilus aegypticus (ATCC
11116).
Incubar a 37°C

Metilación de CpG: Bloqueada
haeii#Product%20Information
14
HinfI
5-15 minutos
sencillas
Sitio de corte: G/ANTC
porta el gen HinfI de Haemophilus influenzae Rf (ATCC
49824).
necesaria para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 37 °C en
una reacción total de 50 µl.

Incubar a 37°C
de superposición.
hinfi#Product%20Information
15
HphI
5-15 minutos
Se ha sugerido que HphI puede escindirse en N9/N8
dependiendo de la secuencia entre los sitios de
reconocimiento y de escisión (Kang, C. y Wu, C.-W. (1987)
Nucl. Acids Res. 15, 2279-2294 Cho, S.-H. y Kang, C.
(1990) Mol. Cells 1, 81-86). La incubación de > 12 unidades
durante más de 4 horas en el ADN de ΦX174 da como
resultado productos de escisión adicionales. Todavía no se

sencillas
de reconocimiento
Sitio de corte de enzimas de
restricción: GGTGA (8/7)
ha demostrado que esto ocurra en otros ADN. El pH bajo y
la alta concentración de glicerol mejoran esta actividad.
Esta enzima está bloqueada por la metilación de la presa.
Esta enzima está bloqueada por la metilación de dcm. La
actividad estelar puede resultar de una digestión prolongada,
una alta concentración de enzimas o una concentración de
glicerol >5%
porta el gen HphI de Haemophilus parahaemolyticus (ATCC
49700).
Incubar a 37°C
Metilación de dam: Bloqueada
Metilación de dcm: Bloqueada
hphi#Product%20Information

16
I-CeuI
sencillas
Esta es una endonucleasa
autodirigida y requiere
períodos de incubación de 3
horas.
Tolera cierta degeneración de
secuencia dentro de la
secuencia de reconocimiento
Sitio de corte:
TAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAA(-9/-
13)
I-CeuI puede permanecer unido al ADN después del corte y
alterar la velocidad de migración del ADN durante la
electroforesis. Para interrumpir la unión, agregue SDS a una
concentración final de 0,5 % o purifique el ADN antes de la
electroforesis.
Las endonucleasas autodirigidas no tienen secuencias de
reconocimiento estrictamente definidas como las enzimas de
restricción. Es decir, los cambios de una sola base no
suprimen la escisión sino que reducen su eficiencia en
grados variables. El límite preciso de las bases requeridas
generalmente no se conoce. La secuencia de reconocimiento
enumerada es un sitio que se sabe que se reconoce y escinde.
Se suministra con ADN plásmido. El pBHS linealizado con
ScaI se suministra a 0,5 mg/ml en Tris-HCl 10 mM (pH 8,0),
EDTA 1 mM. La escisión de este plásmido de 3,5 kb da
fragmentos de 2100 y 1400 pares de bases.
porta el gen I-CeuI de Chlamydomonas eugametos (C.
Lemieux).

necesaria para escindir 1 µg de plásmido de control
linealizado con pBHS ScaI en 3 horas a 37 °C en un
volumen de reacción total de 50 µl.
Incubar a 37°C
https://international.neb.com/products/r0699-i-
ceui#Product%20Information
17
KpnI-HF®
Es un isoesquizómero de KpnI. KpnI produce una extensión
de 3´ de 4 bases, mientras que Acc65I produce una extensión
de 5´ de 4 bases.

Enzimas de restricción de alta
fidelidad (HF). Diseñado para
mejorar el rendimiento
100% de actividad en
rCutSmart Buffer
5-15 minutos
Actividad estelar reducida
(6X)
Sitio de corte: GGTAC/C
Para las enzimas que no se pueden inactivar con calor,
recomendamos usar una columna para la limpieza o ejecutar
la reacción en un gel de agarosa y luego extraer el ADN, o
realizando una extracción con fenol/cloroformo.
porta el gen KpnI clonado y modificado de Klebsiella
pneumoniae OK8 (ATCC 49790)
necesaria para digerir 1 µg de ADN de pXba en 1 hora a 37
Incubar a 37°C
https://international.neb.com/products/r3142-kpni-
hf#Product%20Information

18
MboI
5-15 minutos
sencillas
(6X)
Sitio de corte: /GATC
BfuCI, DpnII y Sau3AI son isoesquizómeros de MboI. MboI
se escinde para dejar una extensión GATC de 5' que se
puede ligar eficazmente en fragmentos escindidos BamHI,
BclI, BglII, BstYI, DpnII o Sau3AI. Según la estabilidad de
la enzima en la reacción, las incubaciones de más de 1 hora
no mejorarán la digestión, a menos que se agregue enzima
adicional. Bloqueado por la metilación de dam y deteriorado
por la metilación de CpG superpuesta.
porta el gen MboI de Moraxella bovis (ATCC 10900).
requerida para digerir 1 µg de ADN λ (dam-) en 1 hora a
37°C en un volumen de reacción total de 50 µl.

Incubar a 37°C
Metilación de dam: Bloqueada
Metilación de CpG: Deteriorada por superposición
mboi#Product%20Information
19
MnlI
5-15 minutos
MnlI produce fragmentos de ADN que tienen una extensión
3´ de una sola base que son más difíciles de ligar que los
fragmentos de extremos romos.
porta el gen MnlI de Moraxella nonliquefaciens (ATCC
17953).

sencillas
de reconocimiento
Sitio de corte de enzimas de
restricción: CCTC (7/6)
Incubar a 37°C
mnli#Product%20Information

20
Nb.BbvCI
sencillas
Esta es una endonucleasa de
corte
Genera moléculas de ADN
que están "cortadas", en lugar
de escindidas
Sitio de corte: CCTCAGC
Es una endonucleasa de corte que corta solo una cadena de
ADN en un sustrato de ADN de doble cadena.
expresa una forma alterada de los genes de restricción
BbvCI de Bacillus brevis (L. Ge)
requerida para convertir 1 µg de ADN plasmídico
superenrollado en forma circular abierta en 1 hora a 37°C en
Incubar a 37°C
APLICACIONES: Enzima de mellado y amplificación por
desplazamiento de hebra.
nbbbvci#Product%20Information

21
Nb.BssSI
Esta es una endonucleasa de
corte
Genera moléculas de ADN
que están "cortadas", en lugar
de escindidas
Esta es una Enzima para la
Innovación (EFI). Estas
enzimas tienen propiedades
interesantes y especificidades
únicas.
Sitio de corte: CACGAG
La incubación a 50°C da como resultado una actividad 3
veces mayor. No es sensible a la metilación de CpG, dcm o
dam.
porta el gen Nb.BssSI clonado y modificado de Bacillus
stearothermophilus.
requerida para convertir 1 μg de ADN pUC19
superenrollado en forma circular abierta en 1 hora a 37 °C en
un volumen de reacción total de 50 μl.
1X NEBuffer™ r3.1
Incubar a 37°C

nbbsssi#Product%20Information
22
NlaIV
sencillas
Sitio de corte: GGN/NCC
NaCl y KCl inhiben la actividad.
porta el gen NlaIV de Neisseria lactamica (NRCC 2118).
necesaria para digerir 1 µg de ADN de pBR322 en 1 hora a
37 °C en un volumen de reacción total de 50 µl.
Incubar a 37°C

Metilación de dcm: Bloqueada por superposición
Metilación de CpG: Bloqueada por superposición
nlaiv#Product%20Information
23
NmeAIII
sencillas
No se recomienda la sobredigestión con > 5 unidades de
NmeAIII por µg de ADN.
NmeAIII requiere S-adenosilmetionina (SAM) en la mezcla
de reacción para una actividad óptima (SAM se suministra
en la formulación enzimática). Además, requiere dos copias
de su secuencia de reconocimiento para que se produzca la
escisión. Por tanto, el único sitio NmeAIII en pUC19 es
resistente a la escisión. Una sobredigestión de 10 veces corta
menos de la mitad del ADN.
El punto de división puede cambiar un par de bases según el
contexto de la secuencia de ADN entre el sitio de
reconocimiento y la posición de división. Para una secuencia
dada, generalmente predominará un sitio de corte.

de reconocimiento
Requiere dos o más sitios para
la escisión. Revise la lista de
enzimas y las
recomendaciones en la
siguiente tabla , así como el
artículo de información
general.
Sitio de corte: GCCGAG
(21/19)
Se produce una escisión significativa en hielo ya 25°C.
NmeAIII produce un patrón de digestión parcial estable
incluso con exceso de enzima.
porta el gen NmeAIII clonado de Neisseria meningitidis2491
(Achtman, M.)
necesaria para digerir 1 µg de ADN de ΦX174 RF I en 1
hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 µl.
Incubar a 37°C
APLICACIONES: Digestión de enzimas de restricción
nmeaiii#Product%20Information

24
PvuI
5-15 minutos
rCutSmart™ Buffer
(6X)
Sitio de corte: CGAT/CG
La escisión del ADN genómico de mamíferos está bloqueada
por la metilación de CpG. Tiene una versión de alta fidelidad
(PvuI-HF®).
porta el gen PvuI clonado de Proteus vulgaris (ATCC
13315)
°C en un volumen de reacción total de 50 µl
1X NEBuffer™ r3.1
Incubar a 37°C

pvui#Product%20Information
25
PI-SceI
Esta es una endonucleasa
autodirigida y requiere
períodos de incubación de 3
horas.
Tolera cierta degeneración de
secuencia dentro de la
secuencia de reconocimiento
Sitio de corte:
ATCTATGTCGGGTGCGGAGAAAGAGGTAAT(-15/-
19)
La inteína que codifica PI-SceI está presente en el gen VMA
ATPasa Saccharomyces cerevisiae (1,5). El gen ha sido
modificado para expresión independiente en E. coli
utilizando un sistema de expresión de polimerasa de ARN
T7 (2). Suministrado con ADN plasmídico: pBSvdeX
linealizado con XmnI se suministra 0,5 mg/ml en Tris-HCl
10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM. La escisión de este plásmido
de 3,7 kb con PI-SceI da fragmentos de 2550 y 1150 pares
de bases.
Las endonucleasas autodirigidas no tienen secuencias de
reconocimiento estrictamente definidas como las enzimas de
restricción. Es decir, los cambios de una sola base no
suprimen la escisión sino que reducen su eficiencia en
grados variables. El límite preciso de las bases requeridas

generalmente no se conoce. La secuencia de reconocimiento
enumerada es un sitio que se sabe que se reconoce y escinde.
PI-SceI puede permanecer unido al ADN después del corte y
alterar la velocidad de migración del ADN durante la
electroforesis.
porta el gen VMA1 ATPasa de Saccharomyces cerevisiae (J.
Thorner).
necesaria para escindir 1 μg de plásmido de control
linealizado con pBSvdeX XmnI en 3 horas a 37 °C en un
volumen de reacción total de 50 μl.
Suplemento 1X NEBuffer™ PI-SceI
con BSA purificado
Incubar a 37 °C
https://international.neb.com/products/r0696-pi-
scei#Product%20Information

26
RsaI
5-15 minutos
sencillas
(6X)
Sitio de corte: GT/AC
porta el gen RsaI de Rhodopseudomonas sphaeroides (S.
Kaplan).
Incubar a 37°C

de superposición
rsai#Product%20Information
27
SphI
rCutSmart™ Buffer
Sitio de corte: GCATG/C
Se escinde para dejar una extensión CATG 3' que puede
ligarse eficientemente a fragmentos de ADN generados por
NlaIII. La actividad estelar puede resultar de una digestión
prolongada.
porta el gen SphI de Streptomyces phaeochromogenes
(NRRL B-3559).

DEFINICIÓN DE UNIDAD: L a cantidad de enzima
1X NEBuffer™ r2.1
Incubar a 37°C
sphi#Product%20Information
28
SwaI
5-15 minutos
porta el gen SwaI de Staphylococcus warneri (B. Frey).

Sitio de corte: ATTT/AAAT
1X NEBuffer™ r3.1
Incubar a 25°C
swai#Product%20Information

29
TfiI
5-15 minutos
sencillas
Sitio de corte: G/AWTC
La escisión del ADN genómico de mamíferos está bloqueada
por algunas combinaciones de metilación de CpG
superpuestas.
porta el gen TfiI clonado de Thermus filiformis (D. Cowan,
University College London).
necesaria para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 65 °C en
1X tampón rCutSmart™
Incubar a 65 °C
de superposición
tfii#Product%20Information

30
ZraI
sencillas
Sitio de corte: GAC/GTC
Es un neoesquizómero de AatII. La escisión del ADN
genómico de mamíferos está bloqueada por la metilación de
CpG.
porta el gen ZraI clonado de Zoogloea ramigera 11, (SK
Degtyarev).
Incubar a 37°C

zrai#Product%20Information
VII. CONCLUSIONES
➢ Las enzimas de restricción se denominan también nucleasas de restricción,
endonucleasas de restricción y en ocasiones restrictasas. Las enzimas de restricción
cortan el ADN de doble cadena cuando reconocen un patrón de secuencia específico.
Generan fragmentos de ADN conocidos como fragmentos de restricción. Además, las
enzimas de restricción son herramientas imprescindibles en biología molecular,
ingeniería genética y biotecnología.
➢ Las enzimas de restricción y la ADN ligasa se suelen usar para insertar genes y otros
fragmentos de ADN en plásmidos durante la clonación de ADN.
➢ Cada una de las enzimas posee propiedades especificas y propias de ellas, existen tres
tipos de enzimas, con características particulares, y estas son importantes en la biología
molecular pues facilita los análisis genéticos. Además, nos permite conocer algunos
factores que afectan la actividad de las enzimas de restricción como la variación en la
temperatura de incubación ya que inhibe la actividad enzimática.
➢ De acuerdo a la información recopilada es necesario conocer sus propiedades para
poderlas aplicar adecuadamente, junto a ello el protocolo de cada una de las enzimas.

BIBLIOGRAFÍA
Calderón Alvarado, K. C. (s. f.). Endonucleasas o Enzimas de Restricción. Universidad de
Sonora. Recuperado de: http://www.posgradoenbiociencias.uson.mx/wp-
content/uploads/2018/12/UNIDAD-3_KC_CAP-1.pdf
Enzimas de restricción. (s/f). Mhmedical.com. Recuperado el 14 de junio de 2022, de
https://accessmedicina.mhmedical.com/content.aspx?bookid=1473&sectionid=10274
3841
Gelambi, M. (2019, 4 abril). Endonucleasas: funciones, tipos y ejemplos. Lifeder.
https://www.lifeder.com/endonucleasas/
New England Biolabs. (s. f.-a). Dam and Dcm Methylases of E. coli | NEB.
https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/dam-and-dcm-
methylases-of-e-coli
New England Biolabs. (s. f.-b). Heat Inactivation | NEB. https://international.neb.com/tools-
and-resources/usage-guidelines/heat-inactivation
New England Biolabs. (s. f.-c). High-Fidelity (HF®) Restriction Endonucleases | NEB.
https://international.neb.com/products/restriction-endonucleases/hf-nicking-master-
mix-time-saver-other/high-fidelity-restriction-enzymes/high-fidelity-restriction-
endonucleases
New England Biolabs. (s. f.-d). Isoschizomers | NEB. https://international.neb.com/tools-and-
resources/selection-charts/isoschizomers
New England Biolabs. (s. f.-e). NEB Overview | NEB. https://international.neb.com/about-
neb/neb-overview
New England Biolabs. (s. f.-f). Star Activity | NEB. https://international.neb.com/tools-and-
resources/usage-guidelines/star-activity
Prieto, P. B. (2020, octubre 19). Los 6 tipos de enzimas (clasificación, funciones y
características). Medicoplus.com. https://medicoplus.com/medicina-general/tipos-
enzimas
www.wiki.es-es.nina.az. (2021, 15 agosto). Isoesquizómero. https://www.wiki.es-
es.nina.az/Isoesquiz%C3%B3mero.html

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN.pdf

Recomendados

Recomendados

Más contenido relacionado

La actualidad más candente

La actualidad más candente (20)

Similar a ENZIMAS DE RESTRICCIÓN.pdf

Similar a ENZIMAS DE RESTRICCIÓN.pdf (20)

Último

Último (20)

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN.pdf