_ _ Tema 8-GRADO. Cine_tica enzima_tica-D v.5 (26.10.21)_ALUMNOSb (1).pdf

Prof. José L. Caballero 2º Bioquímica
TEMA 5 - CINÉTICA ENZIMÁTICA
TEMA 8 : CINÉTICA ENZIMÁTICA
- Propiedades cinéticas de los enzimas: Modelo de Michaelis y Menten
- Constantes cinéticas: significado de los valores de KM y Vmax
- El criterio kcat/KM
- Cinética de enzimas alostéricos
- Cálculo de parámetros cinéticos: KM y Vmáx
1 - Representación de Lineweaver-Burk
2 - Representación de Eadie-Hofstee

Cinética de Michaelis y Menten: Cálculo de parámetros cinéticos
http://brunjil.blogspot.com/2008/01/maud-menten-y-leonor-michaelis.html
Leonor Michaelis Maud Menten
http://scientia1.wordpress.com/2011/06/17/¿cual-es-el-articulo-mas-referenciado-de-la-historia-de-la-ciencia/
http://sebbm.es/EN/dissemination-science-for-all_10/women-in-biochemistry-portrait-gallery_511
Los experimentos cinéticos
revelan propiedades de los enzimas

http://brunjil.blogspot.com/2008/01/maud-menten-y-leonor-michaelis.html
Leonor Michaelis Maud Menten
http://scientia1.wordpress.com/2011/06/17/¿cual-es-el-articulo-mas-referenciado-de-la-historia-de-la-ciencia/
http://sebbm.es/EN/dissemination-science-for-all_10/women-in-biochemistry-portrait-gallery_511
Mount Sinai Hospital –Toronto -
Los experimentos cinéticos
revelan propiedades de los enzimas
Mount Sinai Hospital –Toronto -

Cambios en la concentración de los participantes en una reacción
catalizada por una enzima en función del tiempo
A) Estado estacionario B) Estado pre-estacionario
Stryer, p. 201
E + S ES E + P
k1
k-1
k2
k-2
¡A una [E] definida!

Cambios en la concentración de los participantes en una reacción
catalizada por una enzima en función del tiempo
A) Estado estacionario B) Estado pre-estacionario
Stryer, p. 201
E + S ES E + P
k1
k-1
k2
¡A una [E] definida!

Vinit = k2 [ES]

[E] [S]

[E0] = [E] + [ES]

Vinit = k2 [ES]
[E0] = [E] + [ES] [E] = [E0] - [ES]

[E0][S] – [ES][S]
[ES]
= KM
[E0][S] [ES][S]
[ES] [ES]
– = KM

[E0][S] – [ES][S]
[ES]
= KM
[E0][S] [ES][S]
[ES] [ES]
– = KM
[E0][S]
[S]
[ES]
– = KM

[E0][S] – [ES][S]
[ES]
= KM
[E0][S] [ES][S]
[ES] [ES]
– = KM
[E0][S]
[S]
[ES]
– = KM
[E0][S]
[S]
[ES]
+
= KM

[E0][S] – [ES][S]
[ES]
= KM
[E0][S] [ES][S]
[ES] [ES]
– = KM
[E0][S]
[S]
[ES]
– = KM
[E0][S]
[S]
[ES]
+
= KM
[E0][S]
[S]
[ES]
+
KM
=

Vinit = k2 [ES] Vmax = k2 [E0]
[E0] = [E] + [ES] [E] = [E0] - [ES]

Vmax

V0 =
Vmax.[S]
KM + [S]

Determinación de la velocidad inicial (V0)
Se representa la cantidad de producto formado a distintas concentraciones de
sustrato en función del tiempo. La velocidad inicial (V0) para cada concentración
de sustrato se determina a partir de la pendiente de la curva al comienzo de la
reacción, cuando la reacción inversa es insignificante.
E + S ES E + P
k1
k-1 k-2
k2
En el inicio de la catálisis
se cumple que no existe aún
producto que pueda revertir
y por tanto
E + S ES E + P
k1
k-1
k2
Stryer, p. 201
Vo
3
Vo
4
Vo
2
Vo
1

V0 =
Vmax.[S]
KM + [S]
Stryer, p. 200
(1913)
Si [S] <<< KM
V0 =
Vmax
KM
. [S]
Vmax

V0 =
Vmax.[S]
KM + [S]
Si [S] >>> KM
V0 = Vmax
Stryer, p. 200
(1913)
Vmax

V0 =
Vmax.[S]
KM + [S]
Si [S] = KM
V0 =
Vmax
2
Stryer, p. 200
(1913)
Vmax

k1
k-1 k2
KM =
+

TEMA 6 : CINÉTICA ENZIMÁTICA
- Constantes cinéticas: significado de los valores de KM y Vmax
- El criterio kcat/KM
- Cinética de enzimas alostéricos
- Cálculo de parámetros cinéticos: KM y Vmáx
1 - Representación de Lineweaver-Burk
2 - Representación de Eadie-Hofstee

Significado del valor de KM
KM (constante de Michaelis) es una agrupación de
constantes y es independiente de la [S] y [E].
Es una medida de la estabilidad del complejo ES.
KM tiene unidades de concentración (M ; µM)
KM es una característica importante de la interacción E - S y, por tanto,
es característica de cada Enzima
El valor de KM es aquella concentración de [S] a la cual la mitad de los centros
activos están ocupados y, por tanto, la velocidad de reacción se hace la mitad de
su valor máximo
Stryer, p. 204
V0 =
Vmax.[S]
KM + [S]
k1
k-1 k2
KM =
+
2
Vmax
KM = [S]
V =
Este valor de KM es dependiente de las condiciones ambientales
tales como pH, temperatura y fuerza iónica
Si k-1 >>> k2 la disociación del complejo ES hacia E y S es mucho más rápida que
la formación de P y KM = KS (constante de disociación del complejo ES) = k-1/k1
KM es, en cierto modo, reflejo de la afinidad de E por el S cuando k-1 >>> k2
k1
k-1 k2
KM =
+
k1
k-1
KM =
k1
k-1
KS =
[ES]
[E] [S]
KM =
k1
k-1 k2
+
=

su valor máximo
Stryer, p. 204
V0 =
Vmax.[S]
KM + [S]
k1
k-1 k2
KM =
+
2
Vmax
KM = [S]
V =
-1 k2
k1
k-1
KM =
k1
k-1
KS =
=

su valor máximo
Stryer, p. 204
V0 =
Vmax.[S]
KM + [S]
k1
k-1 k2
KM =
+
2
Vmax
KM = [S]
V =

su valor máximo
Stryer, p. 204
V0 =
Vmax.[S]
KM + [S]
k1
k-1 k2
KM =
+
2
Vmax
KM = [S]
V =
[ES]
[E] [S]
KM =
k1
k-1 k2
+
=

Stryer, p. 204

Significado del valor de Vmax
Stryer, p. 205
La velocidad máxima (Vmax) revela el número de recambio de un enzima o
nº de turnover = k2 = kcat (conociendo la concentración de centros activos)
k2 = kcat = número de moléculas de S convertidas en P por unidad de tiempo por
una molécula de E cuando está totalmente saturado por el S
(kcat)
k1
k-1 k2
KM =
+
V0 =
Vmax.[S]
KM + [S]
Vmax = k2 . [E0]
Vmax
=
k2
[E0]
k2 = kcat: tiene unidades de s-1
kcat =

Significado del valor de Vmax
Stryer, p. 205
La velocidad máxima (Vmax) revela el número de recambio de un enzima o
nº de turnover = k2 = kcat (conociendo la concentración de centros activos)
k2 = kcat = número de moléculas de S convertidas en P por unidad de tiempo por
una molécula de E cuando está totalmente saturado por el S
(kcat) V0 =
Vmax.[S]
KM + [S]
Vmax = k2 . [E0]
Vmax
=
k2
[E0]
k2 = kcat: tiene unidades de s-1
kcat =

McKee, p.170; Stryer, p. 206; Lehninger, p. 263
-6
-5
-4
4
2
3

El criterio kcat/KM
Stryer, p. 205
Si [S] >>> KM
V0 = Vmax = k2 . [E0] V0 = (Velocidad de catálisis) kcat = k2 = Vmax /[E0]
El enzima está totalmente saturado por el sustrato y, por tanto,
Si [S] <<< KM
No están ocupados la mayor parte de los centros activos
y, por tanto,
V0 <<< kcat [E] ~ [E0]
y
V0 = [E0] [S]
kcat
KM
“cte de especificidad” : mide la preferencia o eficacia
del E por diferentes sustratos
Es de 2º orden y tiene unidades de s-1 M-1
V0 =
Vmax.[S]
KM + [S]
Vmax = k2 . [E0]
Vmax
=
kcat = k2
[E0]

El criterio kcat/KM
Stryer, p. 205
Si [S] >>> KM
Si [S] <<< KM
y, por tanto,
V0 <<< kcat [E] ~ [E0]
y
V0 = [E0] [S]
kcat
KM
V0 =
Vmax.[S]
KM + [S]
Vmax = k2 . [E0]
Vmax
=
kcat = k2
[E0]
kcat . [E0]

El criterio kcat/KM
Stryer, p. 205
Si [S] >>> KM
Habitualmente los enzimas no están saturados de sustrato y en condiciones
fisiológicas la razón [S]/KM está comprendida entre > 0.01 y 1.0 <
Si [S] <<< KM
y, por tanto,
V0 <<< kcat [E] ~ [E0]
y
V0 = [E0] [S]
kcat
KM
V0 =
Vmax.[S]
KM + [S]
Vmax = k2 . [E0]
Vmax
=
kcat = k2
[E0]
kcat . [E0]

Stryer, p. 205
El criterio kcat/KM

-6
-5
-4
4
2
3
1 7

k1
k-1 k2
KM =
+
El criterio kcat/KM
V0 = [S] [E0]
kcat
KM
¿ Límites del valor de esta cte kcat/KM ?
kcat
KM
kcat
k1
k-1 kcat
+
kcat
kcat
k-1 +
k1
= = < k1
E + S ES E + P
k1
k-1
k2
Si kcat >>> k-1 el valor de kcat / KM se aproxima a k1
Stryer, p. 206
Así, el límite más alto del valor de kcat / KM
lo establece k1,
o, lo que es lo mismo, velocidad de formación del complejo ES

k1
k-1 k2
KM =
+
El criterio kcat/KM
V0 = [S] [E0]
kcat
KM
kcat
KM
kcat
k1
k-1 kcat
+
kcat
kcat
k-1 +
k1
= = < k1
E + S ES E + P
k1
k-1
k2
kcat
kcat
Stryer, p. 206
Así, el límite más alto del valor de kcat / KM
lo establece k1,
o, lo que es lo mismo, velocidad de formación del complejo ES

k1
k-1 k2
KM =
+
El criterio kcat/KM
V0 = [S] [E0]
kcat
KM
kcat
KM
kcat
kcat
k1
= = < k1
E + S ES E + P
k1
k-1
k2
kcat
kcat
Stryer, p. 206

k1
k-1 k2
KM =
+
El criterio kcat/KM
V0 = [S] [E0]
kcat
KM
kcat
KM
k1
= =
E + S ES E + P
k1
k-1
k2
kcat
kcat
Stryer, p. 206

La velocidad de formación del complejo ES no puede superar la
velocidad de encuentro del E y el S, controlada por la difusión,
que alcanza valores máximos de 108 a 109 s-1 M-1

La velocidad de formación del complejo ES no puede superar la
velocidad de encuentro del E y el S, controlada por la difusión,
que alcanza valores máximos de 108 a 109 s-1 M-1
Los seres vivos superan el límite de control de la difusión para las enzimas
organizándose éstas en complejos multienzimáticos
Los enzimas con valor de kcat/KM cercano a los valores de difusión
se dicen han alcanzado la perfección cinética

Stryer, p. 200

Ecuación de Linewaever-Burk

y = a x + b
Representación de Lineweaver-Burk
La representación gráfica de los inversos de las velocidades iniciales frente a los inversos
de las concentraciones de sustrato permite calcular la KM y Vmax de una reacción enzimática
V0 =
Vmax.[S]
KM + [S]
=
KM
V0
1
Vmax [S] Vmax
1 1
+
.
Mathews, 426; McKee, p.185; Stryer, p. 206; Lehninger, p. 269
(X)
(Y)

Representación de Eadie-Hofstee
La representación gráfica de las velocidades iniciales frente a la razón velocidades iniciales/
concentraciones de sustrato permite calcular la KM y Vmax de una reacción enzimática
=
KM
v0
1
Vmax [S] Vmax
1 1
+
.
y = a x + b
= KM Vmax
[S]
.
v0
v0
- +
Multiplicando por v0
. Vmax
Mathews, 426; McKee, p.185; Stryer, p. 206; Lehninger, p. 269
(X)
(Y)

Los enzimas alostéricos no siguen la cinética de Michaelis y Menten
Enzimas alostéricos
Enzimas
Cinética hiperbólica
de Michaelis-Menten Cinética sigmoidal
La curva de unión al sustrato se parece a la curva de unión de oxígeno a la hemoglobina.
La mayoría de los enzimas alostéricos son proteínas con varias subunidades o protómeros.
La unión del sustrato a un protómero en un enzimas alostérico afecta a las propiedades
de unión de los protómeros adyacentes.

E1
A P
E2
E2
E2 E2
Q
B C D E
A F
G
H
I
M N O
P
K
J
L
E1 E2 E3 E4 E5
EP1
EJ1
EJ2
EL1
EB1
EB2
EB3
EC1
EC2
EC3

- El modelo de Michaelis y Menten explica las propiedades cinéticas de muchos E
- KM es característica de cada E, tiene unidades de concentración (M, µM) y es
independiente de la [E]
- Vmax es el valor máximo al que puede tender la velocidad de una reacción
(a una [E] determinada)
- El valor de KM es el valor de la [S] a la cual la 1/2 de los centros activos del E
están ocupados
Resumen

• La actividad enzimática es expresada normalmente por la velocidad inicial (V0)
de la reacción que está siendo catalizada.
• La actividad enzimática puede expresarse en katales (kat):
• La actividad enzimática total se refiere al nº de unidades enzimáticas (UE)
existentes en una muestra, mientras que:
1 UE = 1 µmol min-1 = 16.67 nanokat
Las unidades de V0 son µmol min-1 = unidades enzimáticas (UE).
• La actividad específica se refiere al nº de UE / mg de proteína
Medida de la actividad enzimática

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