seguida de 3 oraciones o menos que capturan la sustancia del documento de manera concisa.

1. ANÁLISIS DE EMULSINA
EN ALMENDRAS
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2. ANÁLISIS DE EMULSINA EN ALMENDRAS
Las almendras dulces son muy nutritivas: más de la mitad de su peso corresponde a
grasas vegetales digeribles, tienen más proteínas que la carne de vaca y son ricas en
fósforo, calcio y vitaminas del grupo B. También poseen una enzima, la emulsina o
sinaptasa, que favorece la digestión. Desde el punto de vista medicinal, aumentan la
secreción de leche materna cuando ésta es escasa y tienen propiedades
antihelmínticas, esto es, favorecen la expulsión de lombrices intestinales. La leche
de almendra, que se obtiene triturando almendras secas y peladas y luego
mezclándolas con agua, se recomienda como sustituto de la leche de vaca y en
tratamientos de problemas cardiovasculares y diabetes. Las almendras amargas contienen
además amigdalina, un glucósido que por acción dela emulsina y en presencia de agua, produce
ácido cianhídrico. Este ácido, antiguamente llamado ácido prúsico, se combina con el potasio
para dar cianuro potásico, que es un veneno muy potente. Por suerte, las almendras
amargas, como su propio nombre indica, tienen mal sabor y son raros los casos de
envenenamiento involuntario por ingestión de esta variedad.
PROCEDIMIENTO
Extracción de la emulsina
Se pesan 10 g de polvo de almendras desengrasadas, se colocan en un matraz Erlenmeyer de
125 mL y se agregan 40 ml de ácido acético al 1 %; someter la mezcla a una agitación constante
durante 20 minutos, cuidando de sujetar el matraz con una pinza, para evitar que el movimiento
lo desplace. Se suspende la agitación y se filtra por gravedad, la solución filtrada se enfría en
baño de hielo, y se le añade poco a poco 25 mL de acetona. Mantenga la solución en el baño de
hielo durante 10 minutos (observar que la emulsina precipita como un sólido blanco), filtre por
gravedad.
Comprobación de la actividad enzimática
Tomar un poco de la emulsina que se encuentra en el papel filtro y colóquela en un vidrio de reloj
y deje secar. Ya seca, pesar 1 mg y colóquela en un frasco vial, agregar 2 ml de agua destilada,
agitar y agregar 1 mg del p-nitro fenil-β-D-glucósido, agite y observe los cambios y el tiempo en
que se producen.
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3. APLICACIÓN DEL MÉTODO DE
HPLC USANDO UN DETECTOR
DE FLUORESCENCIA
DETERMINACIÓN DE
AFLATOXINAS EN EL MANÍ
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1. OBJETIVO
DetectarycuantificarlapresenciadeaflatoxinasB1-B2- G1- G2 enalimentos.
2. CAMPO DEAPLICACIÓNYALCANCE
Elmétodoesaplicableaalimentos,especialmentesemillasy granos.
3. FUNDAMENTO
Se basaenlaextraccióndelatoxinaconacetonitrilo,purificacióna travésdecolumna
multifuncional,derivatizaciónconácidotrifluoracéticoycuantificaciónporHPLCcondetector
defluorescencia.
4. REFERENCIAS
4.1 Método49.2.19A“AOACOfficialMethod994.08AflatoxinsinCorn,Almonds,Brazil
nuts,Peanuts,andPistachionuts” MultifunctionalColumn(Mycosep)Method.
4.2 “Multifunctionalcolumncoupledwithliquidchromatographyprecolumnderivatizationfor
determination of aflatoxinsin corn, almond, brazil nuts, peanuts and pistachios:
collaborativestudy”RomerLabsInc.
5. TERMINOLOGÍA
5.1 Aflatoxinas:Metabolitostóxicosproducidospor hongos,consideradascancerígenasparael
hombreylosanimales.
5.2 LC/MSMS:Cromatografíalíquidaacopladaa detecciónpormasas-masas.
6. MATERIALES,INSUMOSYEQUIPOS
6.1 MATERIALESYEQUIPOS
6.1.1 EquipoHPLCcondetectordefluorescencia.
6.1.2 EspectrofotómetroUV-Visible.
6.1.3 ColumnasdecleanupMycoSep224deLaboratorioRomer(elkitconstadecolumna y
untubodeensayosilanizadode10mL)
6.1.4 Balanzadeprecisión0.01g
6.1.5 Bañotermoregulado60±2ºC
6.1.6 Blender/shaker/juguera
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6.1.7 Erlenmeyerámbarcontapade250mL
6.1.8 Vialesámbarde2mLparaautosampler.
6.1.9 PapelfiltroWhatmanNº4oequivalente.
6.1.10 Micropipetasde200y1000µL.
6.1.11 Matracesdeaforo10mLámbar.
6.2 REACTIVOS
6.2.1 EstándardeAflatoxinasB1-G1-B2-G2
6.2.2 Acetonitrilo,gradoHPLC
6.2.3 Benceno,p.a.
6.2.4 Soluciónderivatizadora:10mLdeácidotrifluoracético,5mLácidoacéticoglacial,
35mLdeaguadestilada
6.2.5 Soluciónstockdeaflatoxinasquecontenganlassiguientesconcentraciones:300ngde
B1,50ngdeB2,150ngdeG1y 50ng deG2pormL.Estassolucionessonpreparadas
enbenceno/acetonitrilo(98+2)apartirdeestándarescertificadosylaconcentración decada
estándar se puede verificar por espectrofotometría según método AOAC
970.44 ed.1995- 49p.3
6.2.6 FaseMóvil:90mLdeacetonitrilogradoHPLC,90mLdemetanolgradoHPLC,400
mLdeaguadesionizaday filtrada.
6.2.7 Soluciónextractante:acetonitrilo/agua(9+1)
7. DESARROLLO
ProfesionalJefedeLaboratoriodeToxinasMarinasyMicotoxinasesresponsabledesupervisar
análisiseinformarlosresultados.
TécnicoLaboratoriodeToxinasMarinasyMicotoxinasesresponsabledeefectuarlasdistintas
etapasdelprocedimientoanalítico
7.1 EXTRACCIÓN
7.1.1 Pesar50g de lamuestrapreviamentemolidaen unmatrazErlenmeyer(6.1.7).
7.1.2 Agregar100mLdelasoluciónextractante(6.2.7).
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7.1.3 Agitarporunahoraenshakeromezclaraaltavelocidadpor2minutosenjuguerao
Blender.
7.1.4 Filtraratravésdeunfiltroplegadoyrecolectarelfiltradoenmaterialámbar.
7.2 PURIFICACION
7.2.1 Pipetear3mLdelextractofiltradoaltubodelacolumnadecleanup(6.1.3).
7.2.2 Colocarlacolumnaenunamanoyeltubodeensayoenlaotra,lentamentepresionar
lacolumnadentrodeltubodeensayo,hastaobtener±0.5mLdeextractopurificado (se
recomienda no colocar los dedos sobre la parte superior del residuo de la columna).
Figura1:modode empleode lascolumnasMycoSep224
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7.3 DERIVATIZACIÓN
7.3.1 Transferir200 Ldelextractopurificadoalvial delautosampler.
7.3.2 Agregar700 Ldelasoluciónderivatizadora(6.2.4).
7.3.3 Agitary colocaren bañoa 60ºCpor8,5minutos.
7.3.4 EnfriaratemperaturaambienteyprocederalacuantificaciónporHPLC
7.4 PREPARACIONDELACURVADECALIBRACIÓN
7.4.1 Soluciones de trabajo (denominadas C1-C2-C3) de B1-G1-B2-G2. Preparar estas
solucionesa partirdelasoluciónstock(6.2.5).Tomarlosvolúmenesindicadosenla
tablaAenmatrazdeaforode10mLy evaporarconunasuavecorrientedenitrógeno,
aforarconacetonitrilo.
TABLAA:Preparacióndelassolucionesestándardetrabajo
Sol.estándar Latomarde B1 B2 G1 G2
soluciónstock gnome* ng/mL* ng/mL* ng/mL*
C1 270 8.1 1.35 4.05 1.35
C2 180 5.4 0.9 2.7 0.9
C3 90 2.7 0.45 1.35 0.45
*Concentraciónde lassolucionesexpresadasenng/mLdesoluciónderivatizada
7.4.2 Tomar200 Ldecadaunadeestassolucionesyprocedercomolasmuestrasapartir de(7.3)
7.5 CONDICIONESCROMATOGRÁFICAS
Columna:LiChroCART250, RP-18,5 m
Flujo:0.8 mL/min.
Excitación:360
nmEmisión:440nm
Temperaturacolumna:40ºCV
ol.inyectado:50 L
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7.6 CALCULOS
AxV
g/Kg(ppb)=-------------------- p
Donde:
A:concentraciónentregadaporelequipo,enng/mL
V:volumendelasoluciónextractanteagregada,enmL
p:pesode lamuestra,engramos
Estafórmulaesaplicablecuandosecumplenlasinstruccionesestablecidasenel
procedimiento,considerandoquelasmuestrasylosestándaressetratande lamisma
formayseinyectanlosmismosvolúmenes.
Límitededetecciónparacadaaflatoxina:0.25 g/Kg
Límitedetecciónaflatoxinastotales:1.0 g/Kg
Límitedecuantificaciónparacadaaflatoxina:1.0 g/Kg
Límitedecuantificaciónaflatoxinastotales:2.64 g/Kg
7.7 CONFIRMACIÓN
Enelcasodedeterminarqueunamuestracontieneunacantidaddeaflatoxinassuperiora la
permitidaporel ReglamentoSanitariodealimentos (5ppbdeaflatoxinastotales)se deberá
confirmarsupresenciasiesposiblepormediodeLC/MSMS.
7.7.1 CromatógrafoLíquido:
- Temperaturadelhornodecolumna:45ºC
- Temperaturadelamuestra:12ºC
-Flujo:0.250mL/min
- Volumendeinyección:20uL
- Tiempodeanálisis:10min.
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-Fasemóvil:
Acuosa: 5mMacetatode amonio,0.1%de ácidofórmico,enrasarconaguaHPLC.
Orgánica:5mMacetatode amonio,0.1%deácidofórmico,25mLdeH2OHPLC,enrasarcon
ACNa 250mL.
-Gradiente:
Tiempo(min) A% B%
0,0 95 5
0,1 95 5
0,8 0 100
1,8 0 100
3,0 95 5
8,0 95 5
7.7.2 Espectrómetrodemasas:
Elmétodotienelossiguientesparámetrosfuentedeiones:
Tipodescan: MRM
ESI: Positivo
CUR: 40.00
CAD: 6.00
IS(Volt): 5000.00
GS1: 30.00
GS2: 30.00
Temp(ºC): 500.00
Interface: ON
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7.7.3 MétododeMasas:
Semonitorizan2canalesotransicionesparacadacompuesto.Enlasiguientetablaseincluyen
eldwell(dwelltimeen segundos),DP,EP,CEP,CEyCXP.
Métododemasas
Transición Dwell DP EP CEP CE CXP Compuesto
331/313 200 50 8 16 35 6 AflatoxinaG2
331/245 200 50 8 16 44 6 AflatoxinaG2
329/311 200 60 9 14 31 2 AflatoxinaG1
329/243 200 60 9 14 38 4 AflatoxinaG1
313/285 200 60 8 21 32 2 AflatoxinaB1
313/269 200 60 8 21 43 2 AflatoxinaB1
315/287 200 60 8 17 37 2 AflatoxinaB2
315/259 200 60 8 17 41 2 AflatoxinaB2
8. REGISTRO
8.1 Registropreparacióndemezclasdesolucionesestándares
8.2 Registrodecromatogramas
8.3 Registrodecontroldecromatogramas
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11. REGULACIÓNYCONTROL
Lasaflatoxinasseconsideran contaminantesinevitablesdealgunos alimentosdeorigen
vegetalydelospiensos,inclusodondesehanseguidolasbuenasprácticas deelaboración.
Loslímitesmáximosaceptadosporlasdiversasregulacionesfluctúanenunrangoqueva desde 4ppb,enelcaso
delaUniónEuropeaparaaflatoxinastotalesennueces,hastaun valor5vecesmayorpara los
alimentosengeneralenlanormaquerigeenEstadosUnidosde Norteamérica.
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12. DETERMINACIÓN DE
HUMEDAD EN GRANOS
SECOS
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13. CONTENIDO DE HUMEDAD DE LOS GRANOS
• Los granos están constituidos por una substancia sólida, denominada materia seca, y por cierta
cantidad de agua. La materia seca está formada por las proteínas, los carbohidratos, las grasas, las
vitaminas y las cenizas. El agua existente en la estructura orgánica de los granos se presenta bajo
distintas formas, pero para fines prácticos se consideran dos tipos de agua: el agua libre que se
retira fácilmente por medio de calor, y el agua que retiene la materia sólida y que sólo se libera por
la acción de altas temperaturas, lo que puede originar la volatilización y descomposición de las
substancias orgánicas y, por lo tanto, la destrucción del producto.
• El contenido de humedad de los granos se expresa, por lo general, como porcentaje del peso total
del grano (base húmeda):
• PA = peso del agua
PT = peso del agua + peso de la materia seca (peso total del grano)
• Métodos para determinar el contenido de humedad
• La determinación del contenido de humedad de los granos debe realizarse en todas sus etapas de
manejo desde la cosecha hasta la salida del almacenamiento. La medición de humedad debe ser
exacta, ya que el contenido de humedad de los granos es muy importante para mantener la
calidad del producto almacenado. Esta determinación presenta también una gran importancia
desde el punto de vista comercial, ya que el precio varía en función de la humedad del grano.
• Existen varios métodos para determinar el contenido de humedad de los granos, que se clasifican
básicamente en dos grupos: directos e indirectos.
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14. • a) Métodosdirectos
• Se consideran los métodos básicos, siendo los principales los métodos de la estufa, la destilación y
los rayos infrarrojos.
• Método de la estufa. Para determinar la humedad de los granos se somete una muestra de granos
de peso conocido al secado y se calcula el porcentaje de humedad a través del peso que se pierde
durante el secado. Para obtener el porcentaje de humedad se divide la pérdida de peso de la
muestra entre el peso original de ella y el resultado se multiplica por 100:
• Pi = peso de la muestra antes del secado
Pf = peso de la muestra después del secado
Estufa para determinar el contenido de humedad
• Con relación a la temperatura y tiempo de secado de las muestras existen diversos métodos cuyas
referencias se encuentran en la bibliografía especializada. Los métodos se diferencian, sobre todo,
en lo que concierne a la temperatura de la estufa, al período de secado y al estado físico de la
muestra (granos enteros o molidos).
• En el Brasil, el método oficial del Ministerio de Agricultura para la determinación de humedad en
las semillas se basa en las Reglas Internacionales aprobadas por el ISTA (International
SeedTestingAssociation). En este método se recomienda el secado de algunos granos a 103 °C ±
2°C por un período de 17 horas, o a una temperatura de 130°C ± 3°C por un período de cuatro
horas para el caso del maíz, dos horas para los demás cereales y una hora para otros granos. Las
reglas internacionales especifican cuáles granos deben molerse. Para todas las especies de
semillas, este Reglamento recomienda también el método de la estufa a 105°C ± 3°C por un
período de 24 horas, sin moler el grano.
• Rayos infrarrojos. En este método, la humedad de los granos se determina también secando una
muestra de peso conocido y calculando el porcentaje de humedad a través de la perdida de peso.
La muestra se muele y se coloca sobre el plato de una balanza, exponiéndola a los rayos infrarrojos
por un determinado tiempo, según la especie de grano. La diferencia entre el peso inicial y el final
corresponde al agua que fue eliminada. Este proceso requiere de cinco a treinta minutos por cada
determinación, según la especie de grano).
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15. Equipo de rayos infrarojos para determinación de humedad
• Método por destilación. Este proceso (método de "Brown Duvel") se basa en la eliminación del
agua de los granos (molidos o enteros) por medio del calentamiento del material que se encuentra
cubierto por un liquido cuya temperatura de ebullición es superior a la del agua. El vapor de agua
procedente de los granos se condensa y se mide en una probeta graduada.
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16. Determinación de la humedad por destilación. Método de "Brown Duval".
Temperatura del aceite según el producto
• La cantidad de agua que se mide en la probeta corresponde a la humedad expresada en
porcentaje. Se recomienda guardar el equipo limpio y seco. El aceite puede ser usado
nuevamente para otras determinaciones de humedad, pero es necesario colarlo. Ejemplo:
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17. si la cantidad de agua en la probeta es de 12,5 ml esto quiere decir que la humedad es
igual al 12,5 por ciento.
• b) Métodosindirectos
• Son los más usados en la práctica e incluyen, sobre todo, los métodos eléctricos. Los
aparatos eléctricos tienen que ser calibrados con los métodos directos.
• Equipos eléctricos. Algunas propiedades físicas de los granos dependen en gran medida
del contenido de humedad. Basado en este principio se construyeron diversos tipos de
determinadores de humedad, los cuales se calibran con uno de los métodos directos
(estufas, etc.). El método electrice es utilizado frecuentemente para determinar la
humedad de los productos vegetales en razón de la rapidez de su operación, fácil manejo,
lectura directa y otras características importantes. Los aparatos eléctricos son de gran
utilidad durante el almacenamiento de los granos porque, periódicamente y con gran
facilidad, se puede determinar su contenido de humedad.
• Medidor de humedad modelo "Universal". Los aparatos modelo "universal" ofrecen
resultados aceptables de aplicación práctica para contenidos de humedad del 8 al 22 por
ciento. Su fácil manejo, solidez, facilidad de operación y mantenimiento mínimo, justifican
su amplia utilización. Sin embargo, deben tenerse algunas precauciones: cuando los
granos están secos en la superficie pero húmedos en la parte interna, el aparato registrará
un contenido de humedad demasiado bajo. Por otra parte, si las superficies de los granos
están húmedas debido al rocío, la lluvia o las condensaciones, el determinador registrará
un contenido de humedad demasiado alto. Su utilización para medir la humedad durante
la operación de secado puede producir resultados que no corresponden a la verdadera
humedad del grano.
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18. Medidor de humedad modelo "Universal".
• Determinador de humedad del tipo capacidad dieléctrica. Los aparatos de este tipo
pueden presentar algunas ventajas con respecto a los que están basados en la resistencia
eléctrica. Están menos sujetos a los errores que resultan de una mala distribución del
contenido de humedad en los granos y son más exactos cuando los granos tienen una
humedad muy alta o muy baja
Medidor de humedad del tipo "capacidad dieléctrica".
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19. BIBLIOGRAFÍA
 Método49.2.19A“AOACOfficialMethod994.08AflatoxinsinCorn,Almonds,Brazil
nuts,Peanuts,andPistachionuts” MultifunctionalColumn(Mycosep)Method.
 http://es.scribd.com/doc/17151664/3-OBTENCION-DE-EMULSINA
 http://www.fao.org/docrep/X5027S/x5027S02.htm
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