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1. OBJETIVO
DetectarycuantificarlapresenciadeaflatoxinasB1-B2- G1- G2 enalimentos.
2. CAMPO DEAPLICACIÓNYALCANCE
Elmétodoesaplicableaalimentos,especialmentesemillasy granos.
3. FUNDAMENTO
Se basaenlaextraccióndelatoxinaconacetonitrilo,purificacióna travésdecolumna
multifuncional,derivatizaciónconácidotrifluoracéticoycuantificaciónporHPLCcondetector
defluorescencia.
4. REFERENCIAS
4.1 Método49.2.19A“AOACOfficialMethod994.08AflatoxinsinCorn,Almonds,Brazil
nuts,Peanuts,andPistachionuts” MultifunctionalColumn(Mycosep)Method.
4.2 “Multifunctionalcolumncoupledwithliquidchromatographyprecolumnderivatizationfor
determination of aflatoxinsin corn, almond, brazil nuts, peanuts and pistachios:
collaborativestudy”RomerLabsInc.
5. TERMINOLOGÍA
5.1 Aflatoxinas:Metabolitostóxicosproducidospor hongos,consideradascancerígenasparael
hombreylosanimales.
5.2 LC/MSMS:Cromatografíalíquidaacopladaa detecciónpormasas-masas.
6. MATERIALES,INSUMOSYEQUIPOS
6.1 MATERIALESYEQUIPOS
6.1.1 EquipoHPLCcondetectordefluorescencia.
6.1.2 EspectrofotómetroUV-Visible.
6.1.3 ColumnasdecleanupMycoSep224deLaboratorioRomer(elkitconstadecolumna y
untubodeensayosilanizadode10mL)
6.1.4 Balanzadeprecisión0.01g
6.1.5 Bañotermoregulado60±2ºC
6.1.6 Blender/shaker/juguera
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6.1.7 Erlenmeyerámbarcontapade250mL
6.1.8 Vialesámbarde2mLparaautosampler.
6.1.9 PapelfiltroWhatmanNº4oequivalente.
6.1.10 Micropipetasde200y1000µL.
6.1.11 Matracesdeaforo10mLámbar.
6.2 REACTIVOS
6.2.1 EstándardeAflatoxinasB1-G1-B2-G2
6.2.2 Acetonitrilo,gradoHPLC
6.2.3 Benceno,p.a.
6.2.4 Soluciónderivatizadora:10mLdeácidotrifluoracético,5mLácidoacéticoglacial,
35mLdeaguadestilada
6.2.5 Soluciónstockdeaflatoxinasquecontenganlassiguientesconcentraciones:300ngde
B1,50ngdeB2,150ngdeG1y 50ng deG2pormL.Estassolucionessonpreparadas
enbenceno/acetonitrilo(98+2)apartirdeestándarescertificadosylaconcentración decada
estándar se puede verificar por espectrofotometría según método AOAC
970.44 ed.1995- 49p.3
6.2.6 FaseMóvil:90mLdeacetonitrilogradoHPLC,90mLdemetanolgradoHPLC,400
mLdeaguadesionizaday filtrada.
6.2.7 Soluciónextractante:acetonitrilo/agua(9+1)
7. DESARROLLO
ProfesionalJefedeLaboratoriodeToxinasMarinasyMicotoxinasesresponsabledesupervisar
análisiseinformarlosresultados.
TécnicoLaboratoriodeToxinasMarinasyMicotoxinasesresponsabledeefectuarlasdistintas
etapasdelprocedimientoanalítico
7.1 EXTRACCIÓN
7.1.1 Pesar50g de lamuestrapreviamentemolidaen unmatrazErlenmeyer(6.1.7).
7.1.2 Agregar100mLdelasoluciónextractante(6.2.7).
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7.1.3 Agitarporunahoraenshakeromezclaraaltavelocidadpor2minutosenjuguerao
Blender.
7.1.4 Filtraratravésdeunfiltroplegadoyrecolectarelfiltradoenmaterialámbar.
7.2 PURIFICACION
7.2.1 Pipetear3mLdelextractofiltradoaltubodelacolumnadecleanup(6.1.3).
7.2.2 Colocarlacolumnaenunamanoyeltubodeensayoenlaotra,lentamentepresionar
lacolumnadentrodeltubodeensayo,hastaobtener±0.5mLdeextractopurificado (se
recomienda no colocar los dedos sobre la parte superior del residuo de la columna).
Figura1:modode empleode lascolumnasMycoSep224
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7.3 DERIVATIZACIÓN
7.3.1 Transferir200 Ldelextractopurificadoalvial delautosampler.
7.3.2 Agregar700 Ldelasoluciónderivatizadora(6.2.4).
7.3.3 Agitary colocaren bañoa 60ºCpor8,5minutos.
7.3.4 EnfriaratemperaturaambienteyprocederalacuantificaciónporHPLC
7.4 PREPARACIONDELACURVADECALIBRACIÓN
7.4.1 Soluciones de trabajo (denominadas C1-C2-C3) de B1-G1-B2-G2. Preparar estas
solucionesa partirdelasoluciónstock(6.2.5).Tomarlosvolúmenesindicadosenla
tablaAenmatrazdeaforode10mLy evaporarconunasuavecorrientedenitrógeno,
aforarconacetonitrilo.
TABLAA:Preparacióndelassolucionesestándardetrabajo
Sol.estándar Latomarde B1 B2 G1 G2
soluciónstock gnome* ng/mL* ng/mL* ng/mL*
C1 270 8.1 1.35 4.05 1.35
C2 180 5.4 0.9 2.7 0.9
C3 90 2.7 0.45 1.35 0.45
*Concentraciónde lassolucionesexpresadasenng/mLdesoluciónderivatizada
7.4.2 Tomar200 Ldecadaunadeestassolucionesyprocedercomolasmuestrasapartir de(7.3)
7.5 CONDICIONESCROMATOGRÁFICAS
Columna:LiChroCART250, RP-18,5 m
Flujo:0.8 mL/min.
Excitación:360 nm
Emisión:440nm
Temperaturacolumna:40ºCV
ol.inyectado:50 L
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7.6 CALCULOS
AxV
g/Kg(ppb)=-------------------- p
Donde:
A:concentraciónentregadaporelequipo,enng/mL
V:volumendelasoluciónextractanteagregada,enmL
p:pesode lamuestra,engramos
Estafórmulaesaplicablecuandosecumplenlasinstruccionesestablecidasenel
procedimiento,considerandoquelasmuestrasylosestándaressetratande lamisma
formayseinyectanlosmismosvolúmenes.
Límitededetecciónparacadaaflatoxina:0.25 g/Kg
Límitedetecciónaflatoxinastotales:1.0 g/Kg
Límitedecuantificaciónparacadaaflatoxina:1.0 g/Kg
Límitedecuantificaciónaflatoxinastotales:2.64 g/Kg
7.7 CONFIRMACIÓN
Enelcasodedeterminarqueunamuestracontieneunacantidaddeaflatoxinassuperiora la
permitidaporel ReglamentoSanitariodealimentos (5ppbdeaflatoxinastotales)se deberá
confirmarsupresenciasiesposiblepormediodeLC/MSMS.
7.7.1 CromatógrafoLíquido:
- Temperaturadelhornodecolumna:45ºC
- Temperaturadelamuestra:12ºC
-Flujo:0.250mL/min
- Volumendeinyección:20uL
- Tiempodeanálisis:10min.
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-Fasemóvil:
Acuosa: 5mMacetatode amonio,0.1%de ácidofórmico,enrasarconaguaHPLC.
Orgánica:5mMacetatode amonio,0.1%deácidofórmico,25mLdeH2OHPLC,enrasarcon
ACNa 250mL.
-Gradiente:
Tiempo(min) A% B%
0,0 95 5
0,1 95 5
0,8 0 100
1,8 0 100
3,0 95 5
8,0 95 5
7.7.2 Espectrómetrodemasas:
Elmétodotienelossiguientesparámetrosfuentedeiones:
Tipodescan: MRM
ESI: Positivo
CUR: 40.00
CAD: 6.00
IS(Volt): 5000.00
GS1: 30.00
GS2: 30.00
Temp(ºC): 500.00
Interface: ON
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7.7.3 MétododeMasas:
Semonitorizan2canalesotransicionesparacadacompuesto.Enlasiguientetablaseincluyen
eldwell(dwelltimeen segundos),DP,EP,CEP,CEyCXP.
Métododemasas
Transición Dwell DP EP CEP CE CXP Compuesto
331/313 200 50 8 16 35 6 AflatoxinaG2
331/245 200 50 8 16 44 6 AflatoxinaG2
329/311 200 60 9 14 31 2 AflatoxinaG1
329/243 200 60 9 14 38 4 AflatoxinaG1
313/285 200 60 8 21 32 2 AflatoxinaB1
313/269 200 60 8 21 43 2 AflatoxinaB1
315/287 200 60 8 17 37 2 AflatoxinaB2
315/259 200 60 8 17 41 2 AflatoxinaB2
8. REGISTRO
8.1 Registropreparacióndemezclasdesolucionesestándares
8.2 Registrodecromatogramas
8.3 Registrodecontroldecromatogramas
9. ANEXOS
NoAplica
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