The production of fuels of the second generation and third generation needs of new alternative substrate that they do not compete with the food. The xilosa is the most abundant second sugar on the Earth, to be able to take advantage of it there are needed robust microorganisms that could assimilate and produce metabolitos of interest as the ethanol.

1. “Second-generation bioethanol”
Transformation of promissory microorganisms for the
production of bioethanol on an industrial scale
Godfrey Idrobo Libreros
BSc, PhD. Sci. Biology Stu.

2. Utilización de microorganismos para la
producción de etanol a partir de azúcares
obtenidos de residuos de caña
Godfrey Idrobo Libreros, BSc. Biol. Genética, Ph.D
MADR

4. Programa:
Producción de etanol a partir de residuos de caña de
azúcar_(MADR2008D3210)
Proyecto 1: Hidrólisis de residuos de la caña de azúcar para la obtención
de azúcares simples como materia prima para la obtención de etanol
(2007D3718-346-07)
Proyecto 2: Utilización de microorganismos para la producción de etanol
a partir de azúcares obtenidos de residuos de caña
(MADR 2008D3210-3466)
MADR

5. Proyecto
Metodología - Marco lógico - Resultados Pruebas de fermentación
Alcohol producido será: (10-15 L)
Evaluado (Alcotest),
cuantificado
Toma de muestras (densímetro)
biológicas Pruebas de tolerancia a Et-OH
Formulación de medios de
Asimilen, Crezcan y Co-
cultivo-revisión bibliografía fermenten Xilosa-Ara-
Selección de microorganismos
Glucosa
Biomasa (peso seco,
absorbancia)
Macerado o triturado de Consumo de azúcar (HPLC) Fermentación en lote 30ºC
muestras molino Producción de alcohol (HPLC) Cinética de crecimiento C5 y
Cambio de pH C61
Diluciones 1:10 en H2O pep, Preparación inóculos frescos (Xilosa, ara, glucosa)
estéril, y Exudados directos
Prueba de Oxido-
Fermentación
Siembra en
medio de Incubación a (26- Purificación (re-
cultivo idóneo 27ºC) 28-37ºC asilamiento) Caracterización:
morfológica Gram. y

6. Metodología
Aislamiento
YEAmod2: Composición
por litro
P: 0.5 gramos
EL: 0.5 gramos
AA: 15 gramos
Xil y/o Ara: 5.0 gramos
Agua dd: 1 Litro

7. Frecuencia de bacterias, levaduras y hongos
aislados del muestreo en Bahía Málaga.
55.9 %
35.3 %
8.8 %

8. Cepas aisladas de Bahía
Málaga con capacidad de
crecimiento sobre azúcares
C5 y C6.
3/34 aislamientos
probados presentaron
crecimiento a partir de
xilosa y/o arabinosa o
glucosa.
+: crecimiento

9. Frecuencia de crecimiento en glucosa (C6), xilosa
y arabinosa (C5) de las cepas
aisladas de muestras colectadas en Bahía Málaga.
8.8 %

10. Aislamientos de sustratos vegetales

11. Crecimiento arabinosa Crecimiento xilosa
La utilización directa del medio selectivo permitió aislar un
total de 6 bacterias, 1 levadura y 2 hongos de los residuos
vegetales analizados.
De las cepas Amb 1 a 5 solamente presentó crecimiento en
xilosa y arabinosa fue la Amb1.

12. Resultados preeliminares de prueba OF
(Hugh & Leifson)

13. Contenido
• Introducción
• Antecedentes
• Metodología de clonación (Termófilos
Gram+)
• Producción de etanol
(Thermoanaerobacterium saccharolyticum )
• Perspectivas

14. Ford Modelo A 1896

16. Central
metabolic
isoprenoid pathways
pathways
and the
potential
fuel
molecules
derived
from them
fatty acid pathways
Trends in Biotechnology. 2008. 26 (7)

17. Nature reviews Microbiology 2009 (7) 715-23

18. Nature 2008 454: 841-45

19. Science 2007 315, 804-07

20. 25%-85% w/w hemicellulose: xylose
is the second much abundant sugar in
nature after D-glucose
Waites et. al 2005
Approximately 6–8 tons of dried leaves called trash is produced from one
hectare of sugarcane crop (Singh et al. 2008)
40%- celulosa (40-60% BNDES y CGEE 2008)
25% hemicelulosa (20-40% BNDES y CGEE 2008)
18-20% lignina (10-25% BNDES y CGEE 2008)

21. Saccharomyces cerevisiae más común
Zymomonas mobilis homo fermentador etanol
Escherichia coli silvestre etanol + ácidos orgánicos
A well-known problem in S. cerevisiae is that xylose transport into the cell is
inhibited by glucose, since xylose and glucose compete for the same
transport systems (Kilian et. al 1988, Meinander et al. 1997)

23. 1. Producción de enzimas
sacarolíticas (celulasas y
hemicelulasas)
2. Hidrólisis de los polisacáridos
presentes en la biomasa
pretratada, es decir las rutas
metabólicas para poder
realizar dicha hidrólisis
3. Fermentación alcohólica de
hexosas (glucosa)
4. Fermentación de pentosas
Xilosa y Arabinosa
Nature reviews Microbiology 2007 5 248-50

26. Metodology
Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh-, ack- pta-, ack-
pta- L-ldh-(Shaw et al. 2008)
Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh- (Desai et al. 2004) 18
Gene Cloning and Plasmid Construction (Desai et al. 2004) 18
Transformation of T. saccharolyticum (Mai et al. 1997, Klapath et al. 1996 ,Tyurin et. al 2005)14-16
Media Composition and Strain Storage (Baskaran et al. 1995) 25
Fermentation Conditions
Analytical Methods (Lu et al. 2006) 28
Enzymatic Assays (Shaw et al. 2008b) 12

27. Transformation of T. saccharolyticum (Mai et al. 1997, Tyurin et. al 2005)14-16
EcoRI/PstI
EcoRI/PstI
EcoRI/PstI
EcoRI
EcoRI
EcoRI
lambda HindIII.
pIKM1
pIMP1
pIKM1
pIKM1 pIKM1
E. coli transformed
Thermoanaerobacterium
pIKM1: pKD102 cut  EcoRI/PstI and 1.5 Kpb band
(gene aph3 kanr)  isolate (agarose gel 1%)  ligated
EcoRI/PstI cut  pIMP1
Ori Gram-negative ColEH1,
Gram-positive pIM1 (ORF2),
Selectable markers Ampicillin (ampr),
Macrolide Lincosamide Streptogramin (MLS)
Kanamycin (kanr) resistance

28. Transformation of T. saccharolyticum (Mai et al. 1997, Tyurin et. al 2005)14-16
Immediately before electroporation.

29. Transformation of T. saccharolyticum (Mai et al. 1997, Klapath et al. 1996,
Tyurin et. al 2005)14-16

30. Transformation of T. saccharolyticum (Mai et al. 1997, Klapath et al. 1996,
Tyurin et. al 2005)14-16
Electropermeabilization
•24Mhz
•10kV
•Oscillations are correlated with
high-frequency transformation

31. Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh- and Gene
Cloning and Plasmid Construction (Desai et al. 2004) 18
Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh-, ack- pta-, ack- pta- L-ldh-(Shaw et al. 2008)
Thermoanaerobacterium saccharolyticum JW/SL-
YS485 (Provided by Wiegel).
25% glicerol + 75% medio  N2
Culture recovered
DMS61 broth, 0.5 g cysteina/l, Transformatión
MYE mineral, YEA 2g/l, Xyl or Glu 5 g/l  caracterization
Selectión 50-400µg kanamycin/ ml
Cloning of L-lactate dehydrogenase
Conserved regions from:
C acetobutylicum, KPGETR, NPVDIL,
Bacillus megaterius GEHGD, KGATYY
Bacillus sterothermophilus
Degenerated primers were designed  CODEHOP program
Genomic DNA Thermoanaerobacterium saccharolyticum
Ldh fragment (Sau3AI) cloned  DNA library  secuenced
 GenBank AN: JW/SL-Y485-AY278026

33. Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh- and Gene
Cloning and Plasmid Construction (Desai et al. 2004) 18
Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh-, ack- pta-, ack- pta- L-ldh-(Shaw et al. 2008)
Knockout vector construction
pSGD8: pUC18 pIKM1
Amplification: primers degenerate
Ldh (up and down): 1.0 kb and 0.43 Kb
A-tailed  TOPO pCR2.1  pSGD8
KmR: kanamycin R, ApR: bla penicillin R, ldh fragments.

34. Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh- and Gene
Cloning and Plasmid Construction (Desai et al. 2004) 18
Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh-, ack- pta-, ack- pta- L-ldh-(Shaw et al. 2008)
W pIMM1 TD1
Primers

35. Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh- and Gene
Cloning and Plasmid Construction (Desai et al. 2004) 18
Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh-, ack- pta-, ack- pta- L-ldh-(Shaw et al. 2008)
Glucose
X : OD
□ : Ethanol
 : Substrate
• : Lactate
∆ : Acetate
Xylose
Wild TD1 (ldh-)

36. Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh-,
ack- pta-, ack- pta- L-ldh-(Shaw et al. 2008)
L-ldh- L-lactate dehydrogenase
ack- acetate kinase
pta- phosphate
acetyltransferase
X

37. Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh-,
ack- pta-, ack- pta- L-ldh-(Shaw et al. 2008)
L-ldh-
ack- pta-
ack- pta- L-ldh- (Lk1)

38. Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh-,
ack- pta-, ack- pta- L-ldh-(Shaw et al. 2008)
1.2- and 0.6-kb regions 5´ and 3´ of K1, K2 Kanamycin promoter region
the pta and ack genes were amplified E1, E2 adenine methylase gene conferring erythromycin
resistance

39. Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh-,
ack- pta-, ack- pta- L-ldh-(Shaw et al. 2008)
pta and ack homology regions
thermostable S.
faecalis kanamycin
resistance cassette
Knockout vector construction
pSGD9: pUC18
Amplification: primers degenerate
pta and ack (up and down): 1.2 kb and 0.6
Kb
A-tailed  TOPO pCR2.1  pSGD8
KmR: kanamycin R, ApR: bla penicillin R, ldh fragments.

40. Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh-,
ack- pta-, ack- pta- L-ldh-(Shaw et al. 2008)
Fermentaciones en Batch cepa silvestre, L-ldh, Fermentaciones en continuo ALK1 y ALK2
pta/ack, y ALK1
Bioreactor de 2 L, Vt:0.5L, Applikon Instruments
En tubos bajo anaerobiosis (Ngas 5% v/v) 20–70 g/l xilosa
4 g/l xilosa, 10 g/l extracto de levadura
2.5 g/l extracto de levadura, 5 g/l triptona.
10 g/l buffer MES (pH 6.2). Temperatura: 55°C
Temperatura: 55°C (Sin agitación) pH: buffer del medio MTC
Anaerobiosis: 30-60 min. Ngas, Resazurin
Recuperación de CO2 : contenedor con agua
Fermentaciones en Batch ALK2
Bioreactor de 3 L, Vt:1L, Sartorius
12 g/l xilosa,
5 g/l extracto de levadura,
pH 5.5, 200 rpm
Temperatura: 55°C

41. Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh-,
ack- pta-, ack- pta- L-ldh-(Shaw et al. 2008)
*Peso seco,  etanol, ● xilosa, □ ácido acético, ◊ ácido láctico

42. Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh-,
ack- pta-, ack- pta- L-ldh-(Shaw et al. 2008)
Xylose,
glucose
Mannose
galactose
Ethanol
Dry weight
(*).

43. Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh-,
ack- pta-, ack- pta- L-ldh-(Shaw et al. 2008)

44. Thermoanaerobacterium saccharolyticum L-ldh-,
ack- pta-, ack- pta- L-ldh-(Shaw et al. 2008)

45. Perspective
• Transition  first  second generation biofuel: wild-type 
genetically engineered variants with superior catabolic
properties and homoethanologenic production phenotypes.
• Research strategy in thermophiles  by a lack of the same
degree of knowledge (Colombia)
• Construction of nonnatural metabolism that allows the
biosynthesis, for the first time, of an array of alcohols not readily
produced by microorganisms (Higher-chain alcohol)