1. TÉCNICAS DE LABORATORIOS UTILIZADOS EN EL ESTUDIO DE LA EMBRIOLOGÍA Presentado por: Ana gloria troestchrios 4-752-1423

2. EMBRIOLOGÍA Rama de la biología que se ocupa del estudio del desarrollo de los embriones animales. Su ámbito de investigación comprende el desarrollo del huevo fecundado y del embrión, y el crecimiento del feto.

5. MICROSCOPIA ELECTRÓNICA Un microscopio es, básicamente, un sistema óptico que transforma un objeto en una imagen, la cual amplifica detalles característicos del objeto. Con el microscopio de luz se resuelven detalles del orden del micrón, mientras que con el microscopio electrónico se alcanzan a resolver objetos del orden de los angstrom. Dentro de la familia de microscopios electrónicos, se encuentran el microscopio electrónico de transmisión (TEM) y el microscopio electrónico de barrido (SEM); El SEM provee información sobre morfología y características de la superficie, mientras que con el TEM permite observar la estructura interna y detalles ultra estructurales.

7. Estudio de fases y zonas cristalinas en polímeros.

8. Realización de estudios de histoquímica para identificar compuestos específicos.

9. Estudios de ultra estructuras de tejidos vegetales y animales.

10. Reconocimiento de virus.

11. Estudios de citoquímica.

14. Electrodepósitos

15. Adherencia fibra-matríz en polímeros.

16. Cambios morfológicos de materiales sometidos a tratamientos químicos.

17. Formas de cristalización de minerales.

18. Control de calidad de catalizadores industriales.

19. Morfología superficial interna de partículas poliméricas.

20. Morfología de tejidos u órgano animales y vegetales.

21. Estudio de moléculas

23. Realización de cortes Los tejidos encastrados en parafina o plástico son finamente rebanados (cortados) usando un dispositivo llamado microtomo. Hay dos tipos de microtomos más comunes: rotatorios y de deslizamiento. En los del último tipo, en bloque con la muestra permanece quieto y la cuchilla es deslizada contra el tejido durante la brazada de corte, rebanando secciones individuales, como contraste al microtomo de deslizamiento donde la cuchilla se mueve en relación a la muestra, el microtomo de rotación corta rebanadas de tejido moviendo el bloque del material encastrado contra la superfiice de una cuchilla fija. Los microtomos de rotación son comunes a los microscopios de luz y electrónico.

24. 1. Cortar bloques de parafina o de elástico que conetengan una muestra del tejido cada una. 2. Montar los bloques con el tejido en una matriz soporte, hecha de madera o metal, y recortar el bloque en una superficie rectangular o trapezoidal. 3. Montar y ajustar el bloque sobre el microtomo. 4. Preparar la cuchilla del microtomo (afila una cuchilla de acero o haz cuchillas de cristal). 5. Haz secciones individuales o seriadas. Temporalmente guarda cintas (por ejemplo en cajas de papel fotográfico). 6. Cortar cintas de parafina que cubran el 75% de la superficie del portaobjetos para permitir la expansión de la parafina. 7. Hacer flotar secciones individuales o cintas sobre agua (± 4% de formalina) en portaobjetos subbed (subbing no es necesario para cortes realizados en plástico. 8. Calentar a 42ºC menos de 15 min en una placa calefactora para relajar las tira de secciones; entonces quitar el líquido con una pipeta o absorbiéndolo con una toalla de papel doblada. 9. Secar overnight en un horno a 42ºC para asegurarse la adherencia al portaobjetos o en microondas durante 15-30 minutos a 42ºC.

27. Orientación

28. Rigidez

29. Temperatura

30. Humedad

32. Micrografía del embrión del cnidarioClytiahemisphaerica fijado durante la gastrulación en la que se aprecian las células (rojo), los núcleos (azul) y los cilios (verde)

33. Cualidades que debe tener un fijador 1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las células antes de que aparezcan los fenómenos agónicos o post - mortem (autolisis, desintegración, etc.) 2. Poseer alto poder de penetración para asegurar la fijación correcta hasta en las capas profundas de la pieza a fijar. 3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo. 4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observación ulterior (ejecución de cortes, colorantes, etc.) 5. Impedir la desaparición de los elementos solubles durante la fijación o después de ella. 6. No provocar o impedir la producción de estructuras artificiales. 7. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos.

34. Fijadores Químicos Son los más utilizando; pueden ser fijadores simples, constituidos por una sola sustancia química, y fijadores compuestos o mezclas fijadores cuando varias sustancias intervienen en su constitución. 1. Fijadores Simples a) Formol al 10%, es el más usado. b) Alcohol etílico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microquímica. c) Alcohol metílico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre, médula ósea, ganglio, bazo, líquidos de punción, etc) d) Acido ósmico al 1 ó 2 %, e) Bicromato de potasio al 3 - 5%.

35. 2. Fijadores Compuestos En su composición intervienen un número variable de fijadores simples racionalmente elegidos con el fin de completar la acción de cada uno o atenuar sus defectos. a) Líquido de Fleming, mezcla cromo - osmio - acética. b) Líquido de Zenker, mezcla bicromato - sublimado - acética. c) Líquido de Helly, mezcla Zenker - formol d) Líquido de Bouin, mezcla picro - formos - acética. e) Líquido de Duboscq - Brasil, o Bouin alcohólico. Fijadores Físicos 1. Disecación 2. Calor Seco 3. Calor húmedo 4. Frío 5. Congelación y desecación.

36. HISTOQUÍMICA Técnica para localizar sustancias químicas específicas o sitios de actividad química en las estructuras morfológicas que se han perturbado lo mínimo posible. Por lo general se congela inmediatamente el tejido o embrión en nitrógeno líquido y se secciona con un micrótomo especial de baja temperatura que recibe el nombre de criostato. Se coloca el tejido en un portaobjetos de vidrio y se somete a una reacción química específica que conduce a la deposición de un producto coloreado en el sitio de la actividad enzimática o en el lugar en donde se concentran ciertas moléculas. Para llevar a cabo la observación histoquímica han de plantearse una serie de operaciones destinadas a la obtención de preparaciones de tejido, fijadas y susceptibles de ser apreciadas con nitidez al microscopio.

37. AUTORRADIOGRAFÍA Técnica que permite localizar un isótopo radiactivo, al interior de las células o tejidos, mediante técnicas semejantes a los que se utilizan en fotografía. Típicamente se coloca un embrión o parte de él en una solución que contiene un aminoácido radiactivamente marcado o un precursor de DNA o RNA. Después de un lapso dado, se extrae el embrión de la solución radiactiva y se secciona para analizarse en el microscopio, pero además de los procedimientos histológicos normales, las secciones de tejidos se cubren con una emulsión fotográfica, conservándose en la oscuridad durante varias semanas. Las emisiones radiactivas del isótopo, las cuales se han incorporado a las proteínas del embrión, impiden la emulsión durante el periodo de exposición. A continuación la emulsión se revela, de manera muy semejante a las películas fotográficas. Después se depositan gránulos de plata en la emulsión sobre las células que contienen átomos marcados para utilizarlos como guía, con objeto de localizar las estructuras marcadas en el microscopio.

38. 1º.-Inyección del producto radiactivo.2º.- Al transcurrir el tiempo aproximado de asimilación del producto, el animal se anestesia y perfunde con fijador, sólo cuando el producto con el isotopo no se soluble. Si el producto es soluble se sacrifica el animal por decapitación, rápidamente se extrae el órgano y se congela. 3º.-Incluir y cortar en parafina, resiana epoxi, o cortar por congelación.4º.-Colocar, en cuarto oscuro, sobre el portaobjetos con el corte, la película de fotografia, cuidando que la cara con la emulsión fotográfica quede en contacto con el corte.5.- Guardar en una caja oscura y colocar en frigorífico durante 7 dias, para empezar, al término de los cuales:6º.- Se saca, en cuarto oscuro, y se revela la película fotográfica como se hace habitualmente con los negativos en blanco y negro. Si la impresión ha sido buena, se procede a la coloración del corte, y si no ha sido buena, se coloca otra vez con otra película fotográfica sobre los portas y se deja impresionando en el frigorífico mas tiempo. Repitiendo la operación de nuevo.

40. HIBRIDACIÓN IN SITU La técnica de hibridaciónin situ está basada en la capacidad que poseen los ácidos nucleicos para hibridarse entre sí, es decir, la existencia de determinada secuencia de ADN o ARN, que resulta complementaria con otra secuencia. Su utilidad reside en la capacidad de poder demostrar mediante la utilización de una sonda (formada por una secuencia de ADN previamente conocida) marcada con un isótopo radiactivo, la presencia de determinada secuencia de ADN o ARN complementaria, en la muestra a estudiar. Lo que se produce mediante la utilización de esta técnica es: La hibridación (unión), de la sonda marcada, con la secuencia a buscar (en el caso de estar presente en la muestra) y posteriormente mediante técnicas específicas (autoradiografía o inmunohistoquímica), la transformación de la secuencia en algo visible

42. MICROCIRUGIAS Técnica quirúrgica que se realiza con la ayuda de lentes de aumento (lupas o microscopios operatorios), para el manejo preciso de tejidos y restaurar lo mejor posible la anatomía funcional de los órganos de la reproducción. La microcirugía se utiliza en vez de, o como complemento de la reproducción asistida. nuestro objetivo, un bebé. Si esto no funciona utilizar alternativas aceptables. Una variante de microcirugía es la micromanipulación de gametos y embriones como ICSI (inyección del espermatozoide dentro del óvulo). La microcirugía también se puede realizar por vía endoscópica en casos seleccionados, esto además del instrumental adecuado requiere un entrenamiento especial. Debemos recalcar que con indicaciones específicas la utilización de la microcirugía permite excelentes resultados en infertilidad, sin embargo, si existen otros factores asociados las posibilidades de éxito disminuyen y en estos casos se requiere reproducción asistida.

43. Microdisección Mediante Captura con Láser Un método que se está utilizando para minimizar el daño celular y capturar los patrones de proteínas precisos en las células cancerosas y normales es la microdisección mediante captura con láser (LCM, por sus iniciales en inglés). Los investigadores utilizan un haz de láser de baja energía y una película especial de transferencia para llevar una célula deseada fuera de la sección de tejido, dejando todas las células no deseadas. Ellos pueden entonces recolectar todas las proteínas que estaban presentes en las células seleccionadas, mapear el patrón de proteínas y almacenar la información en una base de datos de computadora (ordenador). La microdisección mediante captura con láser ofrece varias ventajas para el estudio de proteínas.

45. RASTREO Se han utilizado muchos tipos de marcadores para rastrear los movimientos de las células en el embrión en crecimiento. Los tipos de tintes que pueden aplicarse a las células vivientes sin dañarlas, como el sulfato azul de Nilo y el rojo neutro, reciben el nombre de colorantes vitales. Los cambios de posición de las células tratadas con estos colorantes pueden seguirse durante el transcurso de un periodo extenso de crecimiento, antes que el colorante se torne tan difuso que resulte imposible su identificación. La marcación también puede llevarse a cabo al colocar en pequeños grupos de células partículas de carbón fisiológicamente inerte, finamente dividido, como las de carbón de sangre. Los resultados de experimentos en los que participan las marcaciones de carbón se utilizarán cuando se hable de los movimientos celulares en la vecindad de la línea primitiva del polluelo.

46. Una innovación reciente en las técnicas de rastreo consiste en inyectar a las células diminutas cantidades de peroxidasa de rábano picante (PRP), enzima distribuida por toda la célula y cuya presencia puede mostrarse por varias reacciones. Cuando se divide una célula que tiene PRP inyectada, la enzima se distribuye en las células hijas. Puesto que persiste en la progenie celular, la PRP se ha tornado en una importante herramienta para mapear linajes celulares. La peroxidasa de rábano picante pueden inyectarse en una de las células del embrión temprano, al cual se le permite desarrollarse por algún tiempo parea después seccionarse.

47. USO DE MARCADORES GENÉTICOS Son útiles en los estudios de desarrollo, generalmente como rastreadores. De particular valor han sido las cepas de ratones que han desarrollado diferencias isoenzimáticas en la forma de ciertas enzimas. La identificación mediante técnicas electroforéticas de isoenzimas específicas ha mostrado ser de utilidad como un método rastreador.

48. TÉCNICAS DE CULTIVO Una de las formas más interesantes de estudiar el desarrollo embrionario estriba en cultivar componentes de embriones, y hasta embriones completos, en un medio artificial. El material embrionario se coloca en platos o tubos de vidrio o plástico y se rodea con un medio de cultivo artificial, diseñado para semejarse en la mayor medida posible al medio que circunda al material en su sitio normal embrionario. El medio de cultivo ideal se define químicamente en su totalidad; sin embargo, con frecuencia es necesario añadir factores biológicos indefinidos como suero, y hasta extractos de embriones completos, para proveer los factores de crecimiento necesarios. Existe cada vez mayor conocimiento que la naturaleza del sustrato que se coloca en las células, sea el plástico del plato o el material adicional de matriz extracelular, es una determinante considerable para el éxito del cultivo.

49. TÉCNICA DE RADIACIÓN Se han utilizado varias formas de radiación en los estudios embriológicos, principalmente para causar algún daño en partes del embrión. Para realizar ciertos experimentos, se enfocan rayos X en pequeñas regiones del embrión con objeto de obtener un área circunscrita de lesión al tejido, así como para inactivar un grupo de células. En ocasiones se utilizan rayos ultravioleta para el mismo fin, pese a que carezcan del poder de penetración profunda de los rayos X. Los rayos láser han resultado ser una valiosa herramienta para producir lesiones localizadas agudas en el embrión. Es tal su precisión que pueden destruir pequeñas regiones de cromosomas individuales.

50. LA CLONACIÓN Proceso por el que se consiguen copias idénticas de un organismo, célula o molécula ya desarrollado de forma asexual.

52. ECOGRAFÍA DE EMBRIONES La ecografía, ultrasonografía o ecosonografía es un procedimiento de imagenología que emplea los ecos de una emisión de ultrasonidos dirigida sobre un cuerpo u objeto como fuente de datos para formar una imagen de los órganos o masas internas con fines de diagnóstico. Un pequeño instrumento "similar a un micrófono" llamado transductor emite ondas de ultrasonidos. Estas ondas sonoras de alta frecuencia se transmiten hacia el área del cuerpo bajo estudio, y se recibe su eco. El transductor recoge el eco de las ondas sonoras y una computadora convierte este eco en una imagen que aparece en la pantalla.

54. LA AMNIOCENTESIS Prueba prenatal común que consiste en extraer una pequeña muestra del líquido amniótico que rodea al feto para examinarlo. Se utiliza para diagnosticar, o con mucha mayor frecuencia, descartar la presencia de ciertos defectos congénitos y trastornos genéticos. La amniocentesis es la prueba prenatal más común utilizada para diagnosticar defectos congénitos cromosómicos y genéticos. Existe otra prueba prenatal, llamada muestra del villuscoriónico, que permite diagnosticar la mayoría de los defectos congénitos detectables mediante una amniocentesis. La muestra del villuscoriónico se practica en una etapa anterior del embarazo (generalmente entre las semanas 10 y 12) en comparación con la amniocentesis (que suele realizarse entre las semanas 15 y 20), pero puede conllevar un riesgo ligeramente mayor de aborto espontáneo que la amniocentesis.

55. El líquido amniótico y las células cutáneas del feto que flotan en él se someten a análisis. Las células se separan del líquido amniótico y se cultivan en un laboratorio durante 10 a 12 días. A continuación, se analizan las células para detectar anomalías cromosómicas o defectos congénitos genéticos. Por lo general, los resultados se obtienen dentro de las dos semanas.