Técnicas histológicas: Procedimientos para obtener preparados histológicos
1. Lic. SUSI DAVOLIO- Cátedra
Histología- FM
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMÁN
FACULTAD DE MEDICINA
CÁTEDRA DE HISTOLOGÍA
TÉCNICAS
HISTOLÓGICAS
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Las Técnicas Histológicas abarcan diferentes
procedimientos a los cuales son sometidos
los tejidos para obtener preparados
histológicos, y poder estudiarlos por medio
de la microscopía óptica o electrónica.
Para la obtención de estos preparados, hay
que seguir un protocolo que incluye la
obtención de la muestra, su corte y montaje
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Técnica Histológica
DEFINICIÓN
Es un conjunto de pasos
a seguir para la
obtención de
preparados histológicos
aptos para su estudio
mediante el
microscopio,
posibilitando la
observación de
estructuras no visibles
al ojo humano.
PASOS
1-Obtención del material
2- Fijación
3- Deshidratación
4- Aclaración
5- Imbibición
6- Inclusión en parafina,
bloque y taco
7- Corte
8- Tinción
9- Montaje y observación
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1-Obtención del material
• Material de Biopsias
• Material obtenido de necropsias
• Animales de laboratorio
• Cultivos de tejidos
• Extendidos citológicos
5. Examen inmediato o in vivo:
a) En fresco: animales unicelulares
y células libres. Plasma
Sanguíneo, Albúmina, Humor
Acuoso, Líquido Amniótico,
Soluciones Fisiológicas, Orina.
b) Coloración vital: usando
soluciones de colorantes no
tóxicos (colorantes vitales),
coloración intravital o in vivo, y la
coloración supravital, donde
pueden colorearse células libres
o porciones de órganos.
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Examen mediato o
post-mortem:
Requiere de la muerte celular
y supone seguir una serie de
pasos: La Técnica histológica:
• Debe ser rápida.
• Hay que tener en cuenta las
características del órgano
(muy hidratado, contráctil,
colapsa, etc)
El Material se puede obtener de:
• Biopsia.
• Autopsia
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2- Fijación
La fijación es el proceso mediante el cual:
# Se evitan los procesos de putrefacción o lisis
# Se conservan las estructuras del tejido a
estudiar, lo más semejante posible al estado
vivo.
# Confiere a los tejidos una consistencia
adecuada para su ulterior sección o corte.
La fijación se realiza, sumergiendo el material
en un líquido fijador. En cualquier caso, la
fijación debe ser inmediata, ya que al
detenerse los procesos vitales o privarse de
circulación al tejido se produce una serie de
cambios post-mortem o autolíticos
(degradación por factores endógenos).
Fijación de la muestra.
8. Fundamentos de la fijación
• Evitar los procesos de lisis y putrefacción post- mortem.
• Evitar la proliferación bacteriana.
• Conservar las estructuras lo más parecido posible al
estado vivo.
• Preparar las estructuras para los tratamientos próximos
(inclusión, coloración, etc).
• La fijación detiene los procesos vitales pero en ciertas
condiciones mantiene las actividades de algunos
componentes moleculares, por ejemplo la actividad de
algunas enzimas.
• Insolubilizar sustancias solubles.
• Dar cierta solidez o dureza al tejido o material.
9. Se llaman fijadores a las sustancias químicas o a los agentes físicos
que se utilizan para fijar una muestra orgánica.
¿A que llamamos fijador?
Cualidades que debe tener un fijador
• Actuar con rapidez y detener los procesos autolíticos.
• Buen poder de penetración.
• Conservar lo mas fielmente la estructura del tejido.
• No interferir y facilitar los procesos posteriores.
• Endurecer el tejido y darle mayor consistencia.
• Insolubilizar los componentes de los tejidos.
• No producir estructuras artificiales.
10. Clasificación de los fijadores
Fijadores
Físicos
Calor
Desecación
(microorganismos)
Calor (Coagulan proteínas)
Frío
Se somete el preparado a
congelamiento con aire
líquido a -170°C.
Congelación y desecación
Fijadores
Químicos
(son líquidos)
Simples
Son soluciones de una sola
sustancia en diluciones
acuosas.
Compuestos
o mezclas
Combinación de varias
sustancias simples.
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Ejemplo de soluciones fijadoras:
Simples Mezclas o compuestas
•Formol
•Alcohol etílico
•Acido acético
•Ácido pícrico
•Tetroxido de osmio (ME)
•Glutaraldehido (ME)
• Formol tamponado
según Backer
• Formol tamponado
según Lillie
• Bouin Gendree
• Zenker
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Para la elección de un fijador se debe tener en cuenta:
A- Velocidad de
difusión
La velocidad de difusión es un fenómeno físico y la velocidad de
fijación es un fenómeno químico y equivale al tiempo y al tamaño de
la pieza al que se debe someter las piezas en el fijador.
Ejemplo: el formol difunde rápidamente pero fija lentamente, por lo
que las piezas pueden permanecer en el fijador mucho tiempo. El
glutaraldehído tiene velocidad de difusión lenta, pero fija muy rápido,
por lo tanto las piezas deberán ser de tamaño pequeño y
permanecerán poco tiempo en el fijador.
B- El coeficiente
de
endurecimiento
Los fijadores, endurecen los tejidos, esto es conveniente,
pero no deben sobrepasar el límite compatible con la
obtención de cortes.
C- Variaciones del
volúmen y
presión osmótica
Es necesario elegir un fijador cuya presión osmótica sea
cercana a la de la muestra, para evitar distorsiones de las
estructuras celulares.
D- Efecto
mordiente
Los organoides de las células no pueden teñirse, en este
caso hay fijadores que facilitan el proceso de tinción de esas
estructuras que, de otra forma, no se tiñen.
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3- Deshidratación
• Se elimina toda el agua
contenida en los tejidos, ya
que el agua impide la
difusión de la parafina al
interior del tejido.
• Consiste en pasar el
material fijado, por una serie
de alcoholes de
concentraciones crecientes
(50%, 70%, 80%, 96% y dos
baños en alcohol 100% o
absoluto).
Deshidratación en
alcoholes sucesivos
Sistema de preparación de
muestras de tejidos automático
para histología
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La duración de la
deshidratación está
condicionada por el tamaño
de las muestras y la
naturaleza del material.
Actualmente se utilizan
procesadores automáticos.
Deshidratación en
alcoholes sucesivos
Sistema de preparación de
muestras de tejidos automático
para histología
3- Deshidratación
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Consiste en someter el material ya deshidratado, a dos baños
consecutivos en solventes orgánicos como el xilol, toluol,
benceno, etc, con el objetivo de favorecer la difusión de la
parafina en el interior del tejido, ya que la misma es poco
soluble en el alcohol.
4- Aclaramiento o diafanización
Deshidratación y Aclaramiento
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• Es impregnar la pieza con
una sustancia que le
confiere dureza y permite
obtener cortes uniformes y
delgados.
• El objetivo de esto es
brindar posteriormente un
soporte sólido que permita
el corte del tejido en
delgadas capas.
5- Imbibición
Imbibición en parafina a 59-60ºC
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En la técnica corriente, se utiliza la
PARAFINA (insoluble en agua)
El material aclarado, es colocado en
un recipiente con parafina líquida,
la cual se mantendrá en ese
estado
dentro de una estufa a 56°- 58°C.
Se efectúan dos baños
consecutivos, uno de 12 horas y
otro de 4 horas de permanencia
del material dentro la parafina.
• Esto permitirá que la parafina
difunda dentro del tejido.
5- Imbibición en Parafina
Imbibición en
parafina a 59-
60ºC
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6- Inclusión en parafina, bloque y taco
El material ya embebido, se
coloca en el fondo de un
recipiente, y se llena el
mismo con parafina líquida
hasta el borde y se deja
solidificar a temperatura
ambiente. De esta manera
se forma un bloque, donde el
material se encuentra incluido
en un soporte de parafina.
El bloque, luego se pegará
sobre un taco de madera con
los datos correspondientes,
que servirán de registro del
material.
Barras de Leuckart
Pegado del bloque al taco de madera
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Tallado
Para eliminar exceso de parafina .
Se elimina la parafina con un cuchillo, dando al taco la forma
de una pirámide truncada, con el objeto de que no ofrezca
resistencia al ser cortado en el micrótomo.
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7- Corte
Para cortar el material
histológico, se utilizan los
micrótomos. Estos son
dispositivos mecánicos
que enfrentan el taco con el
material a la cuchilla, de tal modo
que se produce un avance
regular y controlado, para
obtener cortes
finos y uniformes, generalmente
de 3 a 8 micras una micra es la
milésima parte de 1 mm, es decir
1= 10-3 mm o 10-6 m.
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TIPOS DE MICRÓTOMOS
Micrótomos para parafina
Micrótomo de congelación
Crióstato
Micrótomos para parafina:
a- El micrótomo de
deslizamiento,
que presenta cuchilla móvil y
platina fija
b- El micrótomo de rotación o
tipo
Minot, que presenta cuchilla fija y
platina móvil. Micrótomo tipo Minot
Micrótomo de
deslizamiento
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Micrótomo de congelación.
Micrótomo de congelación: Presenta
una platina fija y una cuchilla móvil,
además de un sistema de congelación
del material, mediante un tubo con CO2,
que llega al micrótomo por una
manguera hasta la platina. Esta técnica
es muy útil para el diagnóstico durante
el acto quirúrgico, permitiéndole al
cirujano tomar decisiones rápidas.
Crióstato: Consta de un micrótomo tipo
Minot incluido dentro de una cámara de
congelación. El volante o manivela que
controla la realización del corte
permanece en el exterior, mientras que
la cuchilla y el mecanismo de avance
están situados dentro de la cámara fría
(normalmente -20°C).
Crióstato.
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Correlación Clínica:
Biopsias por congelación
Sirven para:
• Evaluar de inmediato la
pieza obtenida durante el
acto quirúrgico lo que
determinará la conducta a
seguir.
• Identificar hallazgos
intraoperatorios inesperados
• Evaluación de márgenes
de la resección quirúrgica.
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Biopsias por congelación
Para realizar una biopsia por congelación se
siguen tres pasos principales:
• Congelación del tejido. Se congelan
muestras de tejido de tamaño pequeño
mediante el uso de dióxido de carbono sólido o
mediante inmersión en un líquido frío
(isopentano) a una temperatura de –50 °C.
• Corte del tejido congelado. El corte suele
realizarse dentro de un criostato. Dado que el
tejido está congelado, se puede cortar en
rebanadas muy finas (5 nm a 10 mm).
• Tinción de los cortes. Las tinciones de uso
más frecuente para las biopsias por
congelación son H&E, el azul de metileno y
tinción de PAS.
•Todo el proceso puede tardar 10 minutos y el
resultado se comunica al cirujano
inmediatamente.
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Tipos
8- Tinción o Coloración
Cuando se observan al microscopio, los
preparados frescos o los post-mortem, solo se
diferencian los elementos que poseen distintos
índices de refracción, mientras que los elementos
con índice de refracción semejante, se verán
iguales, lo que puede confundir al observador.
Por lo tanto, para poder ver los distintos tipos de
células y reconocer su organización y su relación
con sustancias y fibras extracelulares, es
necesario el uso de colorantes.
26. Lic. SUSI DAVOLIO- Cátedra
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Definición de colorante
Colorante es toda sustancia capaz de ceder
su coloración a otros cuerpos
En los colorantes hay grupos químicos que le confieren
color (grupos cromóforos) y otros que reaccionan con los
componentes del tejido y células, fijando el color a estas
estructuras. Estos grupos pueden ser: básicos (grupo
amino) o ácidos (grupo carboxilo).
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1-Colorantes naturales: cuando son obtenidos de organismos vivos, los
que pueden ser de :
a) animales: carmín.
b) vegetales: hematoxilina, orceína.
2-Colorantes artificiales o sintéticos (colorantes de anilina):
a) ácidos: poseen una carga global negativa (aniónicos), reaccionan con
los componentes catiónicos de las células. Son los colorantes
citoplasmáticos. Ejemplo: eosina, fucsina ácida.
b) básicos: poseen una carga global positiva (catiónicos), reaccionan con
los componentes aniónicos de las células. Son los colorantes nucleares.
Ejemplo: fucsina básica, azul de Toluidina, azul de Metileno.
c) neutros: son colorantes que presentan sus sales ácidas y básicas
coloreadas. Tienen la ppropiedad de colorear juntas o separadamente
diversas estructuras. Ejemplo: Giemsa, rojo neutro, safranina.
d) indiferentes: son insolubles en agua, pero se solubilizan en alcohol o
en grasas. No forman sales. Ejemplo: rojo escarlata, Sudanes.
Clasificación de los colorantes
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Concepto de Acidofilia y Basofilia
La célula, es una estructura heterogénea compuesta por
diferentes organoides, tales como núcleo, mitocondrias,
ribosomas, retículo endoplásmico rugoso, etc, todos ellos
con una composición química definida.
La variabilidad en la apetencia tintorial por parte de las
células, estará determinada por la predominancia de
determinados organoides o componentes químicos, lo que
influirá en el pH interno que dicha célula presente.
29. Lic. SUSI DAVOLIO- Cátedra
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ACIDOFILIA
Los colorantes ácidos o aniónicos, tienen carga eléctrica negativa. A
estos también se les conoce como colorantes citoplasmáticos, pues
tiñen al grupo químico, cargado eléctricamente, localizado en un
extremo de la cadena de aminoácidos que integran las proteínas
citoplasmáticas.
Las sustancias que atraen eléctricamente a los colorantes
ácidos se denominan “acidófilas” y químicamente están
constituidas por componentes básicos o alcalinos .
Ejemplos de colorantes ácidos: la eosina, la fucsina ácida, el ácido
pícrico, el naranja G, la safranina, el azul de anilina, etc.
En las células con una gran actividad energética, como las células
musculares que presentan un alto contenido en mitocondrias, REL,
proteínas básicas, membranas celulares, el citoplasma de estas
células, se tiñen con un colorante ácido, por lo tanto será acidófilo.
30. Lic. SUSI DAVOLIO- Cátedra
Histología- FM
BASOFILIA
Los colorantes básicos o catiónicos poseen una carga eléctrica
positiva. Se les denomina también colorantes nucleares, pues tienen
afinidad por estructuras celulares ácidas.
Las sustancias teñidas por colorantes básicos se denominan
“basófilos” y están constituidas por componentes ácidos.
Ejemplos de colorantes básicos: la hematoxilina, el rojo nuclear, el azul de
metileno, la tionina, el azul de toluidina, la fucsina básica.
Los núcleos de las células vivas, presentan un alto contenido de ácidos
nucleicos (ADN, ARN), lo que les confiere un pH ácido, por lo tanto
tendrán afinidad por un colorante básico, de modo que los núcleos
serán siempre basófilos, y el citoplasma celular será basófilo, cuando
haya un predominio de organelas ácidas (ej: RER, ribosomas,
proteínas ácidas).
32. Lic. SUSI DAVOLIO- Cátedra
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TÉCNICA GENERAL
DE LA COLORACIÓN
Los pasos para proceder a
la obtención del preparado
terminado son los
siguientes:
•Desparafinización
•Hidratación
•Coloración.
•Deshidratación
•Aclaración
•Montaje o colocación
•del cubreobjetos
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Epitelio de Vejiga
Urinaria Epitelio del Estómago
Tricrómica de
Mallory
37. Lic. SUSI DAVOLIO- Cátedra
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TECNICA COLORANTE pH Elementos que tiñe COLOR
Hematoxilina-
Eosina
Hematoxilina Básico Núcleos, citoplasmas basófilos Violeta
Eosina Ácido Citoplasmas acidófilos, fibras
colágenas, fibras musculares y
eritrocitos
Rosa pálido a rosa
intenso
Tricrómica de
Van Gieson
Hematoxilina
Férrica
Básico Núcleos, citoplasmas basófilos Pardo oscuro a negro
Fucsina ácida Acido + Fibras colágenas Rojo fucsia
Acido pícrico Acido ++ Eritrocitos, citoplasmas acidófilos,
fibras musculares
Amarillo a amarillo
verdoso
Tricrómica de
Gallego
Fucsina de Ziehl Básico Núcleos, citoplasmas basófilos,
gránulos de las células cebadas
Rojo fucsia
Índigo carmín Acido + Fibras colágenas Azul verdoso
Acido pícrico Acido ++ Eritrocitos, citoplasmas acidófilos,
fibras musculares
Amarillo a amarillo
verdoso
Tricrómica de
Mallory
AZAN
Azocarmín G Básico Núcleos, citoplasmas basófilos Rojo
Azul de anilina Acido+ Fibras colágenas, mucopolisacáridos
ácidos
Azul
Orange G Ácido ++ Eritrocitos, citoplasmas acidófilos,
fibras musculares
Naranja intenso a
naranja
amarillento
Tetracrómica de
Goldner
Hematoxilina férrica Básica Núcleos, citoplasmas básófilos Pardo oscuro a negro
Verde luz Acido + Fibras colágenas Verde
Orange G Acido ++ Eritrocitos Naranja
Punzó-fucsina ácida Acido +++ Fibras musculares, citoplasmas
acidófilos
Rojo fucsia
38. Técnicas Especiales
“Es más importante saber lo que el método permite
observar que conocer su funcionamiento”
39. •Los procedimientos histoquímicos y citoquímicos pueden tener su
fundamento en:
•La unión específica de un colorante
•Uso de anticuerpos marcados con un colorante fluorescente con un
componente celular en particular
• Actividad enzimática inherente de un elemento constitutivo de la célula.
Las técnicas más usadas son:
A- Reacción para demostrar la presencia de mucopolisacáridos
B- Coloración para fibras elásticas
C- Coloración para lípidos
C- Técnicas para localizar enzimas
D- Reacciones para localizar sustancias inorgánicas.
E- Impregnaciones metálicas
TÉCNICAS CITOQUÍMICAS E
HISTOQUÍMICAS
40. A- Reacción para demostrar la
presencia de mucopolisacáridos
➢Reacción de PAS (ácido peryódico-
Schiff):
Las sustancias coloreadas con PAS,
son moléculas con gran contenido de
carbohidratos, tales como el glucógeno,
mucopolisacáridos neutros,
glucoproteínas y sialomucinas.
➢Reacción de Azul de Alcian (Alcian
Blue):
se usa a diferentes pH y caracteriza a
los distintos mucopolisacáridos
ácidos, tiñéndolos de color azul.
41. B- Coloración para fibras elásticas:
para detectar selectivamente las fibras
elásticas, se utiliza la técnica de
orceína.
C- Coloración para lípidos:
la técnica más usada para lípidos es la
de los Sudanes, debido a que son
liposolubles
42. D- Técnicas para localizar enzimas:
Sirven para visualizar sitios donde
existe alguna actividad enzimática, de
modo que no se observa una enzima
coloreada, sino el producto de
reacción coloreado que resultó de la
actividad catalítica de la enzima
estudiada (Ej: Fosfatasa ácida y
alcalina, ATPasa, esterasas, y, junto a
inmunocitoquímica, la peroxidasa.)
E- Reacciones para localizar
sustancias inorgánicas:
Las más usadas son:
Azul de Prusia: para localizar
elementos que contienen hierro o
depósitos de hierro dándole una
coloración azul brillante.
Von Kossa: para detectar calcio,
dándole una coloración negra.
43. F- Impregnaciones Metálicas:
Los metales más usados son la plata
(impregnaciones argénticas), el oro
(impregnaciones áuricas) y el osmio
(impregnaciones ósmicas).
Las Impregnaciones argénticas reaccionan
con el tejido y le otorga una coloración en la
gama del marrón con un fondo amarillento.
Si luego de la impregnación se someten los
cortes a un baño de cloruro de oro, se
Produce un cambio en la coloración de
Fondo que pasará a un color sepia (rosado).
Este paso se conoce como virado en oro.
Hay diferentes tipos de impregnaciones
Argénticas, tales como: Técnica de Golgi-
Hortega-Laviña,
Doble impregnación argéntica de Del Río
Hortega,
Técnica de Cajal, etc.
45. Microcopio electrónico de
transmisión (MET):
Posee un tubo emisor de electrones
que luego de atravesar la muestra, se
concentran y proyectan sobre una
pantalla fluorescente, donde se efectúa
el estudio.
Este mecanismo permite observar la
ultraestructura de las organelas
celulares, a grandes aumentos (30.000
a 1.000.000 de aumento) las que no se
visualizan con el microscopio óptico.
El límite de resolución del MET es 2 a
10 Å (Å= 10-10 m).
Ej: Patologías glomerulares, membranas
basales, mesangio
46. Imagen con MET de una célula donde se observa lisosomas, núcleo con cromatina
laxa y otras organelas en el citoplasma, también se observan pseudópodos.
NÚCLEO
PSEUDOPODOS
LISOSOMAS
47. Microvellosidades en la superficie
celular epitelial
Retículo endoplásmico rugoso
Cloroplasto en celula vegetal Mitocondria
48. Microscopio electrónico de barrido
(MEB):
Permite observar la superficie de
especímenes gruesos y de organismos
enteros, que no podrían ser estudiados con
el MET. En este caso el haz de electrones
no atraviesa la muestra sino que realiza un
barrido por toda la superficie del material en
estudio, el cual emite electrones que son
captados por un detector e integrados a
una pantalla de un monitor de TV,
resultando una imagen tridimensional con
alto grado de resolución. El límite de
resolución del MEB es 10 nm (nm = 10-9 m).
49. Imagen con MEB de un epitelio ciliado en el que se observan las cilias que
tapizan la superficie apical del mismo .
52. Inmunocitoquímica
Inmunofluorescencia
La especificidad de la reacción entre el antígeno y el anticuerpo es el
fundamento de la inmunocitoquímica
los anticuerpos pueden purificarse de la sangre y conjugarse (asociarse) con un
colorante fluorescente.
La fluoresceína, el colorante más utilizado, absorbe la luz ultravioleta y emite
luz verde. Los anticuerpos conjugados con fluoresceína se pueden aplicar a
cortes de tejidos congelados o fijados levemente en portaobjetos de vidrio para
localizar un antígeno en células y tejidos. La reacción del anticuerpo con el
antígeno puede entonces examinarse y fotografiarse con un microscopio de
fluorescencia.
En la inmunocitoquímica se utilizan dos tipos de anticuerpos:
anticuerpos policlonales producidos por animales inmunizados y
anticuerpos monoclonales producidos por líneas celulares inmortalizadas
(duplicación continua).
53. • Tejido sin fijación.
• Usa coloración
fluorescentes
degradable.
• Debe registrarse
microfotográficamente.
• Forma un trípode
diagnóstico para las
enfermedades
glomerulares junto a
biopsia con coloraciones
especiales y ME.
Inmunofluorescencia Renal
54. Inmunomarcación
• Es una técnica de histología, biología celular y molecular
que se en el uso de anticuerpos para detectar una proteína
específica en una muestra
• Los anticuerpos pueden ser monoclonares o policlonares
unidos a una enzima (peroxidasa) que se une al antígeno.
• Se visualiza con microscopía óptica mediante la coloración
del núcleo o citoplasma celular.
Uso
Para diagnosticar enfermedades como el cáncer.
También para distinguir entre diferentes tipos de cáncer.
Identificar origen de tejidos indiferenciados.
55. Polarización
Los constituyentes de las células y de los tejidos
que poseen estructura cristalina -o fibrosa-
presentan una fuerte orientación de sus
componentes moleculares.
Si se hace incidir un rayo de luz polarizada sobre
un objeto que posea esas características de
orientación de sus componentes moleculares, la
luz polarizada actúa como si se dividiera en dos
rayos polarizados, en planos perpendiculares
entre sí, y esos dos rayos poseen diferente
velocidad.
Se dice que dichos objetos son "birrefringentes a
la luz polarizada", es decir cuando se examinan
con un microscopio dotado con filtros de luz
adecuados (un filtro analizador y un filtro
polarizador) dichos objetos brillan, bajo la luz del
microscopio.
Luz Polarizada
Coloración Rojo Congo
56. • Ejemplos:
Epitelial: Citoqueratinas 7 y
20
Mesenquimático: Vimentina,
Desmina.
Linfoide: Antígeno común
linfocitario.
SNC: S100
HMB 45: Melanoma
Positivo para
Citoqueratina 7
Positivo para
Vimentina
Positivo para
Antígeno común
leucocitario
57. Imagen de lesión endometrial
con HE y Proteína PTEN reactiva Lesión serosa endometrial con HE y
p53 reactiva
58. Patología Molecular
• Permite conocer el
mecanismo por el cual
se origina una
neoplasia.
• Aporta información de
valor pronóstico y
sobre la respuesta
terapéutica.
• Ej.: Técnica de
Hibridación in situ
(HIS), microarrays,
PCR.
Imagen 1: PCR
Imagen 2: Placas de Microarrays