1. PROTOCOLO DE CULTIVO MONOSPORICO
Materiales:
-Hongo al que queremos replicar
-Cajas de Petri
-Agar PDA
-Asa de punta
-Asa de vidrio triangular
-Pipeta de 1ml
-Pipeteador
-Mechero
Proceso:
- Primero se prepara el medio PDA para la cantidad de cajas necesarias
- Para mayor protección se mete a la autoclave el agar, las cajas de pretri
necesarias, el asa de punta, con la pipeta y el agua que se utilizara para el
proceso.
- Se sirve el medio de cultivo y se espera aprox 10 min para que este solidifique.
- Con el asa de punta raspamos la superficie del hongo al que queremos replicar
para que en este queden pegaras algunas conidias.
- Para sembrar estas conidias, ponemos el asa sobre la caja de petri y con agua
estéril lo goteamos, haciendo que las conidias caigan en la caja de petri con agar.
- Con el asa de triangulo previamente remojada en alcohol y flameada se frota
todo el medio hasta que este adsorba el agua y con ella las conidias.
- Sellamos las cajas de pretri con papel chicle y esperamos aprox 8 días para el
desarrollo total del hongo

2. PROTOCOLO DE AISLAMIENTO
Materiales:
-hongos
-cajas de Petri
-asas chuzo
-alcohol
-mechero
-papel chicle
-agar PDA
- se esteriliza el material en el autoclave durante 45 minutos
-luego se entra a la cabina de flujo laminar y previamente desinfectados
-de la caja de Petri se va a sacar un trozo del hongo y lo pasaremos a l otra con el
agar PDA
-desinfectaremos el asa con el alcohol y el mechero
-realizaremos lo misma acción con los hongos
-al finalizar se marcan las cajas y se sellan bien con el papel chicle

3. PROTOCOLO DE PURIFICACIÓN
Materiales:
-Hongos aislados
-cajas de Petri
-asas bacterianas chuzo
-alcohol
-mechero
-papel chicle
-agar PDA
-se esterilizan los materiales con el autoclave durante 45 minutos
-luego se entra a la cabina de flujo laminar previamente desinfectados
-de los hongos aislados se toma un trozo y al pasarlo a la otra caja de Petri se
traslada el asa con el (mechero y alcohol) hacia la siguiente caja de Petri y se
coloca en el centro de ella

4. PROTOCOLO DE MICROSCOPIA
Materiales:
-azul de lacto fenol
-asa de chuzo
-porta objeto
-cubre objeto
-hongos
-mechero
-guantes
-microscopio Alcohol
-se coge el porta objetos se le echa una gota de azul de lacto fenol
-con el asa previamente esterilizada se coge un trozo del hongo y se esparce en el
portaobjetos
-se le coloca el cubre objetos sobre esta muestra y se retira el exceso de azul
- se observa en el microscopio y se determina las características de ella

5. PROTOCOLO DE SIEMBRA
Materiales:
-papel chicle
-pinzas
-cajas de Petri
-agar PDA
-hipoclorito de sodio
-bisturí
-muestras
- se esteriliza el material en el autoclave durante 25 minutos
-Previamente esterilizados se entra a la cabina de flujo laminar para realizar el
debido proceso el cual consta de cortar con el bisturí trozos de hojas tallos y
vainas tanto bueno como malo para poder sembrar estos tejidos se les hace un
proceso de desinfección (Anexo 1)
-Se colocan de a 5 partes de cada muestra (hoja, tallo vaina, grano) en cada caja
de pretri
-Se marcan las cajas de pretri y se cella con papel chicle

6. PROTOCOLO DE DESINFECCIÓN
Materiales:
-Alcohol
-Hipoclorito de sodio
-Agua deshionisada estéril
-Pinzas
-Papel
-Tejidos del cultivo de frijol
-Cajas de Petri
-Medio de cultivo (PDA)
-Se esterilizan las cajas de Petri y el medio de cultivo en el autoclave
- se cogen los tejidos del cultivo de frijol los cuales son:
Hojas
Tallos
Vainas
Luego se sumergen en hipoclorito de sodio duran te un minuto esto se hará para
quitar los hongos superficiales y solo queden los hongos que de verdad estén
afectando al cultivo, luego se sumergen en agua deshionisada estéril para quitar
los reactivos y no vaya a afectar al medio de cultivo y después se vuelve a
sumergir en agua deshionisada para rectificar que si se hallan eliminado los
reactivos más adelante, se dejan secar estos tejidos en el papel para que absorba
el agua y quede totalmente seco para poder sembrar en el medio de cultivo (PDA)
-se disuelve el agar en las cajas de Petri para poder sembrar
- se siembran los tejidos de frijol a los cuales se les hizo el proceso de
desinfección se siembran cuatro tejidos (hojas, tallos y vainas) por cada caja de
Petri que son aproximadamente 20 cajas. Se espera aproximadamente ocho días
para que crezca algún microorganismo

7. PROTOCOLO DE DILUCIONES SERIADAS
Materiales:
-Micro pipeta 1
-Tubos de ensayo 12
-Gentamicina 2
-Asa de vidrio 1
-Cajas de Petri 14
-Schott 3
-Agar PDA 5.46 g
-Agar SDX 9.1g
-Mechero 1
-Vortex 1
-Agua desionizada estéril 9mlpor cada tubo
-Puntas estériles
*Se coge la tierra (10g por cada muestra), se mezcla con el agua desionizada
estéril y se agita manualmente.
*Se adiciona el antibiótico Gentamicina 0.14 ml (3 gotas) por cada 140 ml. Luego
se vierte el agar en las cajas de Petri.
*Adicionalmente se hará las diluciones seriadas, luego de la solución madre con
una micro pipeta se toma 1 ml y se pasa al primer tubo 10-1, se mezcla en el
vortex por 60 segundos ,después se toma de ese tubo(10-1) 1 ml y se repite el
mismo proceso hasta llegar a 10-4.
*Después, se toma 1 ml de las últimas diluciones 10-3 y 10-4 para pasarlos a la
caja de Petri, se esparce en ella con el asa de vidrio (previamente flameado)
*Se encuba a temperatura ambiente (25 a 27°c), se espera aproximadamente 5
días para ver si ha crecido algún microorganismo y observar el crecimiento.