Este documento presenta información sobre los avances recientes en el conocimiento de los péptidos naturales antimicrobianos. En primer lugar, describe los diferentes grupos de péptidos antimicrobianos según su estructura, origen y actividad antimicrobiana. Luego, resume investigaciones recientes sobre nuevos péptidos como la dermcidina y su secreción por glándulas sudoríparas. Por último, resume los objetivos y metodología propuesta en un proyecto de investigación para aislar, purificar y caracterizar péptidos antimicrobianos de la piel
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Respuesta Inmune Innata
1. Avances Recientes en el
Conocimiento
PÉPTIDOS NATURALES
ANTIMICROBIANOS
Escudo esencial de la
Respuesta Inmune Innata
7 de Febrero de 2007
2. Burnet & Medawar
Janeway / Swchartz
& Jenkins
Bretscher & Cohn Matzinger
Lafferty & Cunninham
The Danger Model: A Renewed Sense of Self. Polly Matzinger. Science. 296: 301-305. 2002.
3. Immunity and the Invertebrates. Gregory Beck and Gail S. Habicht. Scientific American November 1996.
4. INMUNIDAD INNATA
¿Respuesta Primitiva?
Ha Tenido Más Tiempo Para Evolucionar
Respuesta Inducible, Rápida y Vigorosa
Refinada, Compleja,
Más Importante Para la Sobreviviencia
La Vida Es Posible Sin RIA
Pero No Es Posible Sin La RII
The Toll-Like Receptors as the Primary Sensors of the Immune System. Bruce Beutler. The Immunologist 8/6 2000.
5. The Danger Model: A Renewed Sense of Self. Polly Matzinger. Science. 296: 301-305. 2002.
7. Capa 1 Capa 2
Intertegumento (epitelio queratinizado) Peptidos Antimicrobianos
Granulocito
Monocito
kuppfer
Hospedero
Histiocito
NK
Microglia
Capa 3
Células Defensivas Especializadas
The Toll-Like Receptors as the Prymary Sensors of The Immune System. Bruce Beutler. The Immunologist. 8/6. 123-130. 2000
11. Science. 291. 1544-1547. 2001..
Induction of Direct Antimicrobial Activity
Through Mammalian Toll-Like Receptors
Sybille Thoma-Uszynski,1* Steffen Stenger,2* Osamu Takeuchi,3 Maria Teresa Ochoa,1 Matthias Engele,2 Peter A. Sieling,1 Peter F.
Barnes,4 Martin Röllinghoff,2 Pal L. Bölcskei,5 Manfred Wagner,5 Shizuo Akira,3 Michael V. Norgard,6 John T. Belisle,7 Paul J.
Godowski,8 Barry R. Bloom,9 Robert L. Modlin1
Transcription of genes encoding antimicrobial proteins (1-3)
Transcription of genes that regulate the adaptive response,
including cytokines and costimulatory molecules (4-10)
1. B. Lemaitre, E. Nicolas, L. Michaut, J. M. Reichhart, J. A. Hoffmann, Cell 86, 973 (1996) .
2. B. Lemaitre, J. M. Reichhart, J. A. Hoffmann, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14614 (1997) .
3. J. A. Hoffmann, F. C. Kafatos, C. A. Janeway, R. A. B. Ezekowitz, Science 284, 1313 (1999).
4. R. Medzhitov, P. Preston-Hurlburt, C. A. Janeway, Nature 388, 394 (1997).
5. R. B. Yang, et al., Nature 395, 284 (1998) .
6. C. J. Kirschning, H. Wesche, T. M. Ayres, M. Rothe, J. Exp. Med. 188, 2091 (1998)
7. A. Poltorak, et al., Science 282, 2085 (1998).
8. H. D. Brightbill, et al., Science 285, 732 (1999) .
9. A. O. Aliprantis, et al., Science 285, 736 (1999).
10. D. M. Underhill, et al., Nature 401, 811 (1999)
13. PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS
GRUPO I
lineales, helicoidales, sin Cis, con o sin bisagra
NOMBRE ORIGEN ESTRUCTURA GEN ACT. ANTIMICROBIANA
Cecropinas I, A, B, D, P1 Drosophila 35-39 AA, 2 hélices anfipáticas Genes de cecropina, Bact. G- : S. typhimurium,
controlados por el factor de Acinetobacter calcoaceticus, P.
Cerdo Residuos conservados: Trp, aeruginosa.
Bombyx Lis y Argl transcripción Cif
Bact. G+: Bacillus megaterium.
Cecropia No tóxico a hongos y otros
eucariontes
Sarcophaga
Andropinas Drosophila péptidos de doble hélice con ligado al cluster de Antibacteriana y hemolítica
32 residuos cecropina
Ceratotoxinas Cerratitis capitata similar a cecropina y toxina Antibacteriana y hemolítica
melittina del veneno de abeja
Seminalplasmina Semen de toro 47 residuos. Péptido FALL-39 FALL-39 Hemolítica. E. coli
expresado en médula ósea y
testículos
Magaininas Piel y estómago de 23 residuos G+ y G – Protozoarios
PGLa Xenopus y Hongos
Bombinina H3-H5 Especies de Bombina y 27-34 residuos. Antibacteriana, hemolítica
Rana D-isoleucina. No forma hélice
anftipáticasí.
Dermaseptina Phyllomedusa sauvagii 34 residuos. Forma alfa hélice Fungicida
anfipática
14. PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS
GRUPO II
lineales, sin Cis, con o sin alta proporción de ciertos residuos
NOMBRE ORIGEN ESTRUCTURA ACT. ANTIMICROBIANA
Apidecinas Miel de abeja 18 residuos de longitud Inducida por infecciones
Abaecina 34 residuos, prolina 29% bacterianas en la abeja.
Hymenoptaecina 93 residuos, glicina 18% Contra Gram -
Defensina 51 residuos, 6 medias cistinas
Drosocina Drosophila 19 residuos, ricos en prolina
Bac 5 Neutrófilos de bovino 43-59 residuos, prolina 45- Gram -
Bac 7 Precursores fam. catelicidina 49% y 24-29 % arginina
PR-39 Intestino porcino, síntesis en 39 residuos, rico en prolina y Gram - al bloquear la síntesis
médula ósea arginina de DNA
Indolicidina Neutrófilos de bovino 13 residuos y 5 son Triftofano. E. coli, S. aureus
Coleoptericina Escarabajo 7-8 kDa, glicina 12%, prolina
Holotricina 2 10%
Atacinas y gloverinas Insectos Proteínas 14-20 kDa. Ricos en Afectan células en crecimiento.
prolina y glicina Bloqueo de transcripción omp
en superificie bacteriana
15. PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS
GRUPO III
antibacterianos, con un puente disulfuro
NOMBRE ORIGEN ESTRUCTURA ACT. ANTIMICROBIANA
Bactenecina Neutrófilos bovinos 12 residuos, 4 son E. coli, S. aureus,
arginina toxicidad vs células
neuronales y gliales
Brevinina 1 Piel de rana: 7 residuos forman una asa Antibióticos potentes
Brevinina 2 Rana japonesa en el extremo C y una cola Brevinina 2: hemolítico
Brevinina 1E larga fuerte
Brevinina 2E Rana europea
Esculentina Rana esculenta 7 residuos forman una asa E. coli, S. aureus, P.
en el extremo C y una cola aeruginosa, hongos
larga
Ranalexina Rana Similar a polimixina G+yG-
20 aa
16. PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS
GRUPO IV
con dos o más puentes disulfuro, con Cis, estructura en hoja beta
NOMBRE ORIGEN ESTRUCTURA ALMACENAMIENTO y GEN ACT. ANTIMICROBIANA
LIBERACIÓN
Defensinas PMN de conejo, fagocitos de 3 puentes S-S-, 29-34 aa, En gránulos Cromosoma 8 Citotóxica, lítica, antibact.
mamíferos y humanos, células ricos en cisteina y arginina en humanos y G+ y G-. Fungicida por
de Paneth (criptidinas) de (no Lisina). Preproteínas ratones concentración de
ratones de 95 residuos cationes divalentes
α defensinas Fagocitos de humano, conejo, 6 cistrinas unidas En gránulos- fusión con
rata y cobayos, tráquea bovina fagosomas de contenido
(TAP) microbiano
β defensinas Neutrófilos de bovino 38 – 42 residuos.En hoja Se inactiva con iones
Células epiteliales β. Familia de 13 diferentes en moco traqueal –
Células Paneth-ratón defensinas fibrosis quística
Defensinas de Phormia sarcophaga, no Semejante a α defensinas Inducidas como
insectos contenidos en fagocitos respuesta a infecc.
bacteriana. Gram +
No fungicidas
Galanicinas Neutrófilos de pollos Semejante a β defensinas
NK lisina Intestino porcino 78 residuos. Similares a Algunas bacterias,
proteína 519 y NK65 en antitumoral, no lisa
humano. eritrocitos.
Amibaporos E. hystolytica lisis baterias.
17. PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS
GRUPO V
antibacterianos, derivados de grandes polipéptidos con otras funciones
NOMBRE ORIGEN ESTRUCTURA GEN ACTIVIDAD
GIP (polipéptido gástrico Lineales, sin cisteina.
inhibitorio) Hormona de 42 residuos,
familia secretina/glucagon
DBI Cerebro humano y bovino Lineales, sin cisteina. Desplaza el inhibidor de
Secuencia idéntica a la unión al diazepam del
proteína de unión al acil- receptor GABA en cerebro
CoA en hígado de rata.
32-86 residuos
3910 Lineales, sin cisteina. Antibacteriana
KRFAE Secuencia presente en G-
preproencefalina A
Lactoferricinas* Leche materna 3.1 kDa
23. CONACyT / SIMORELOS
Convocatoria 2000
Proyecto No 20000302014
Aislamiento y Purificación de Péptidos Naturales Antimicrobianos de
la Piel de la Rana Catesbeiana
Para su Aplicación Como Nuevos Antibióticos en el Tratamiento de
Enfermedades Infecciosas Bacterianas y Micóticas
DIRECTOR: DR. ALFONSO E ISLAS RODRÍGUEZ
24. OBJETIVO GENERAL
Aislar, purificar y probar péptidos naturales antimicrobianos
de la piel de la Rana catesbeiana y utilizarlos como nuevos
antibióticos.
25. PEPTIDOS NATURALES ANTIMICROBIANOS
TEJIDO AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN
LPLC
BIOENSAYOS
In vitro, In Vivo
CARACTERIZACIÓN
PAGE SDS
IEF, E2D, MASAS
WESTERN BLOT
SECUENCIA
IEF, E2D
Y SINTESIS
26. PEPTIDOS NATURALES ANTIMICROBIANOS
TEJIDO 2 pieles (40 g.) trozos pequeños
10 volúmenes
60% Acetonitrilo N2 líquido, trituración
1% TFA
39% H20 bidestilada
Agitar Centrifugar a 13000 rpm Liofilizar
4°C x 24 hrs 4°C x 30 min sobrenadante
27. PEPTIDOS NATURALES ANTIMICROBIANOS
Resuspender 10 ml de TFA 0.1% Centrifugar
liofilizado 1X104 rpm 2 min
Sobrenadante
Bradford
LPLC
Colecta 150 fracciones
Medir D. O. 280 nm Liofilizar
28. PEPTIDOS NATURALES ANTIMICROBIANOS
Bioensayos in vitro
Incubar cepas Resuspender fracción
Caldo de soya tripticasa (ST) 4 ml Tris-SAF (neutralizar)
18 hrs a 37°C
Esterilizar
Dilución 1:10
Caldo de ST Placa de 96 pozos Diluciones
seriadas
Medir D.O. 620 nm Controles
Incubar 2 hrs. 37 °C Bacitracina, SAF
Calcular UFC
1X103 UFC x pozo Plaquear Incubar 4 hrs
Conteo de UFC
29. PEPTIDOS NATURALES ANTIMICROBIANOS
Determinación de UFC
Incubar cepas
Caldo de ST
24 hrs a 37°C
Dilución 1:1000
Caldo de ST
Medir D.O. 620 nm
cada 15 min, plaquear
30. PEPTIDOS NATURALES ANTIMICROBIANOS
CARACTERIZACIÓN
PAGE- SDS
Preparación muestras Preparar gel
(Desnaturalizar) poliacrilamida
Cargar muestras y marcadores
Corrimiento 100V
Tinción Azul Coomassie
Ag NO3
31. PEPTIDOS NATURALES ANTIMICROBIANOS
WESTERN BLOT
PAGE-SDS Transferencia Bloquear
sin teñir Membrana Nitrocelulosa Membrana
0.4 ampers toda la noche ASB 3%
Ac Secundario Ac primario
Anti-rabbit/HRP rabbit Anti-HDEFA1
Agregar TMB Desarrollo color
32. Figure 4-45. Two-dimensional polyacrylamide-gel electrophoresis. All the proteins in an E. coli
bacterial cell are separated in this gel, in which each spot corresponds to a different polypeptide chain.
The proteins were first separated according to their isoelectric points by isoelectric focusing from left
to right. They were then further fractionated according to their molecular weights by electrophoresis
from top to bottom in the presence of SDS. Note that different proteins are present invery different
amounts. The bacteria were fed with a mixture of radioisotope-labeled amino acids so that all of their
proteins were radioactive and could be readily detected by auto-radiography (see p. 180). (Courtesy of
Patrick O'Farrell.)
46. INFORME TÉCNICO POR ETAPA
Clave de Registro / CLAVE: AVANCE–C2005 86
PROTOCOLO
Ultima ronda de prototipos y pruebas finales para la
producción de Péptidos Naturales Antimicrobianos de la piel
de la Rana catesbeiana, para su aplicación como nuevos
antibióticos en el tratamiento de enfermedades infecciosas
bacterianas y micóticas
Informe Etapa 1
Periodo del 1 de Junio al 30 de Septiembre de 2006
Responsable Técnico del proyecto: Dr. Alfonso Enrique Islas Rodríguez
Sujeto de Apoyo (Institución o Empresa) Laboratorios LAVET SA de CV
48. Ranamicina vs. S. epidermidis
08/Feb/05
35
30
25
20
UFC
15
10
5
0
-5 1 2
256 128 3
64 4
32 5
16 68 7
4 8
2 T-PBS SOL11 12 13
9 10 BC AF
Concentración de proteínas totales en la Ranamicina
(µg/ ml) y Controles
Controles: T-PBS (Tris-PBS), SOL (bacteria sola), BC (Bacitracina), AF
(Ácido Fucídico).
49. Ranamicina vs. S. aureus
35
08/Feb/05
30
25
20
UFC
15
10
5
0
1
256 128 64 32 16 8 4 2 T-PBS SOL BC AF
-5
Concentración de proteínas totales en la Ranamicina
y Controles
(µg/ ml)
S. aureus es resistente a meticilina. Controles: T-PBS (Tris-PBS), SOL
(bacteria sola), BC (Bacitracina), AF (Ácido Fucídico).
56. N0, corresponde a ausencia de mastitis, N1 subclínica tipo 1, N2 subclínica tipo 2, N3 subclínica tipo 3, L clínica leve,
Lc clínica leve crónica, M clínica moderada, Mc clínica moderada crónica, S clínica severa, Sc clínica severa crónic
60. 1.- Gel de Policrilamida al 15 % realizado el 24 de Agosto de 2006.- Se puede observar; en el carril 1
marcadores de peso molecular, en los carriles 2 y 3 muestra de ranamicina (PS) elaborada el 19 de Julio de 2006,
cariles 4 y 5 PS del 19 de Junio, 6 y 7 ranamicina del 1 de Marzo de 2006.
61. 2.- Gel de Policrilamida al 18 % realizado el 25 de Septiembre de 2006.- Se puede observar; en el carril 1
marcadores de peso molecular en los carriles 2, 3 muestra de ranamicina (PS) elaborada el 23 de Enero de 2006,
cariles 4 y 5, PS del 17 de Febrero, 6 y 7 ranamicina del 29 de Mayo de 2006., carriles 8 y 9 del 6 de Junio y carril
10 PS del 19 de Julio de 2006.
62. Ciclodextrinas
Nanotubo
Forma Farmaceutica Estable:
Ungüento
Crema
Gotas
63.
64.
65. NOMBRE DE COMPAÑÍA NOMBRE DEL PEPTIDO ENFERMEDAD A TRATAR Y
DESARROLLO CLÍNICO
Magainin Pharmaceuticals Inc (PA, USA) Pexiganan Ulceras infectadas de pie diabético (fase
III, uso local) .
Micrologix Biotech Inc. (Vancouver, Canada) MBI-594AN Acné (fase III, uso local ), terminada.
MBI-226 Sepsis causada por catéteres (fase III, uso
local) .
Intrabiotics (Mountain View, CA, USA) Iseganan Mucositis (fase II, uso topico-oral (fallido)
(IB-367; protegerina)
Intrabiotics (Mountain View, CA, USA) Iseganan Infecciones pulmonares en fibrosis
Quística (fase II, uso local inhalativo).
(IB-367; protegerina)
Xoma Corp. (Berkeley, CA, USA) Neuprex Meningitis (fase III, uso sistémico) .
Demegen (Pittsburg, PA, USA) P-113 (análogo de histatina) Candidiasis oral, mucositis (fase II, uso
oral)
D2AD21 Heridas de quemaduras, heridas infectadas
(fase I uso local) .
Cubist Pharmaceutical (Lexington, MA, USA) Daptomicina Sepsis (fase III)
AM (Pharma, Bilthoven, Holanda) Lactoferricina-B Antimicótico (fase preclínica, uso
sistémico)
Entomed (Illkirch, Francia) Heliomicina Antibacteriano (fase preclínica, uso
sistémco)
Trimeris (Durham, NC, USA) Enfuvirtide Antiviral (HIV) (fase III completada)
66.
67. PEPTIDOS NATURALES ANTIMICROBIANOS
DR. ALFONSO E ISLAS RODRÍGUEZ
DRA. ROSARIO HUIZAR LÓPEZ
BIOLOGO RODOLFO VILLARRUEL FRANCO
BIOLOGA LUZ ALEJANDRA GARCÍA MADRID
BIOLOGA YERUSA MIROSLAVA MERCADO GARCÍA
BIOLOGO TEXCA MENDEZ
PASANTE ALFONSO EDGARDO ISLAS FIGUEROA
ESTUDIANTE JESÚS GUERRERO RODRÍGUEZ
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA