Introducción

Biotecnología
• Definición
• Historia
• Procesos en la biotecnología alimentaria
• Etapas en el desarrollo de la biotecnología
• Aplicaciones de la biotecnología
• Areas biotecnológicas importantes
• Procesos biotecnológicos por fermentación
• Producción de aminoácidos, biopolímeros,
compuestos aromáticos y colorantes
• Hidrólisis para la obtención de glucosa y fructosa

Biotecnología
• Uso integrado de la bioquímica, microbiología y de las
ingenierías genética, bioquímica y de procesos para fabricar
productos a partir de microorganismos, cultivos celulares y
partes derivadas de ellos (Knorr, 1987).
• La biotecnología alimentaria puede definirse como el uso de
las tecnologías biológicas para la producción, transformación
o conservación de alimentos, o bien para la producción de
materias primas, aditivos y coadyuvantes empleados en la
industria alimentaria (García Garibay y col., 1993).
• Ha permitido el desarrollo de procesos con base en las
siguientes aplicaciones:
1. Los mecanismos de control de la expresión y regulación
genética en microorganismos y en células utilizadas.

2. Las leyes de la bioquímica y la fisicoquímica que regulan el
comportamiento de éstos entes biológicos y de sus moléculas.
3. La fisicoquímica y los fenómenos de transporte involucrados en
las operaciones de propagación, recuperación y utilización de los
organismos o partes de ellos.
Microbiología
Bioquímica
Ingeniería
Biología
molecular
Biotecnología
Universo
de la
Biotecnología

 Es una de las más antiguas industrias. La panificación, producción
de vino y cerveza se remontan al año 2400 a.c., en India (los
Vedas) con un producto similar al yogurt, y en los grabados de una
tumba Egipcia describiendo la panificación y fermentación
alcohólica.
 Posteriormente los estudios de Luis Pasteur ayudaron a
comprender los mecanismos de la fermentación en la producción
de cerveza, vino, vinagre, etc.
 Posteriormente se usó la papaína para la producción de la cerveza
siendo tal vez la primera patente con enzimas exógenas.
 A principios del siglo pasado (XX) empezaron a prepararse una
gran cantidad de productos por fermentación, tales como la
biomasa de microorganismos como alimento, el ácido cítrico, y la
invertasa de levadura para la hidrólisis del azúcar.
 Muchos alimentos y bebidas comunes se basan en fermentación
natural (queso y yoghurt), o en el uso de enzimas (jarabes
fructosados, aspartamo).

 El mayor impacto de la biotec. de alim. es la elaboración de materias
primas y aditivos alimentarios: edulcorantes no calóricos, jarabes
fructosados, aminoácidos, vitaminas, etc.
 En cuanto a las aplicaciones analíticas destacan las enzimas para la
determinación específica de algunos componentes, microorganismos para la
evaluación de la calidad nutricional de alimentos. También se han
desarrollado sondas de DNA ó de anticuerpos para la determinación rápida
de patógenos (Salmonella, Listeria) ó adulteraciones de proteína de origen
animal por una de origen vegetal.
 El mayor beneficio se ha dado en el sector farmacéutico y de salud, ya que
son productos de alto valor agregado que pagan el costo de la investigación
rápidamente.
 Los antibióticos produjeron avances en en la tecnología de fermentaciones,
microbiología industrial, mutaciones no específicas, control de expresión
genética.
 En los 70’s y 80’s la tecnología del DNA recombinante se ha usado para
producir proteínas de interés farmacéutico: insulina, hormona del
crecimiento, interferón, activador del plasminógeno.
 La industria de los alimentos se encuentra muy departamentalizada y no tiene
estructura de grupo, además el consumo de alimentos es masivo, con bajo
valor agregado.

1. Procesos de fermentación en alimentos
 Naturales o espontáneos (cultivos mixtos) : ensilado, cacao, café,
pozol
 Inoculados: vino, yogurt, tempeh (Rhizopus oligosporus)
2. Procesos de fermentación en medios de cultivo
 Producción de biomasa: proteína unicelular, levadura de pan, o de
cervecería
3. Procesos enzimáticos
 Elaboración de materias primas: jarabes fructosados, ácido
aspártico
 Procesos de transformación: malteado, coagulación de leche
 Aditivos
Procesos Involucrados en la Biotecnología
Alimentaria

4. Cultivo de células vegetales:
 Elaboración de materias primas: colorantes
 Micropropagación
Períodos de Desarrollo de la Biotecnología
Primera Generación: Etapa empírica o pre-Pasteur, donde se elaboran
vinagre, bebidas alcohólicas, productos lácteos, alimentos
fermentados tradicionales. No se tiene registro histórico.
Biotecnología Industrial: A partir de la segunda mitad del siglo XIX.
Se divide en 2 etapas:
I) Segunda generación o era de Pasteur: Entre 1865-1940;
desarrollo inicial de la microbiología y la bioquímica.
II) Tercera generación: Era de los antibióticos, entre 1940-1975,
surge la ingeniería bioquímica
Cuarta Generación o nueva Biotecnología: En la segunda mitad de la
década de los setenta, con la Ing. Genética, cultivo de tejidos,
anticuerpos monoclonales.

4. Biotecnología no-convencional: Procesos de fácil implementación,
de pequeña o mediana escala, tendientes a resolver problemas de
índole energético o ecológico.

Anticuerpos
IgG: 75% del total de Ig
Ab: Proteínas en forma de Y, localizadas en el suero sanguíneo,
producidas en respuesta a un antígeno específico (MW~ 150 kDa)
Inmunidad humoral: IgG (Ab), IgM, IgE (alergia),
IgD, IgA (secreciones como saliva, calostro, lágrimas)

(Fluorocromo)
Sistema biotina-avidina,
que puede ser usado
eficientemente en
inmunofluorescencia
indirecta (IF), Enzyme
linked immunosorbent
assay (ELISA) y radio-
inmunoensayos (RIA).
Fluoróforo: digoxigenina

ELISA competitiva para la detección de Salmonella. Al aumentar la
densidad de Salmonella, menos Ab estará disponible para enlazarse al Ag
recubriendo los pozos. Esto conduce a menos enlace del Ab de detección a
los Abs de los pozos y menor número de producto final (103
-105
cel/mL).

ELISA tipo sándwich para la detección de una toxina. Un au-
mento en el número de moléculas de toxina conducirá a un
aumento en la formación de producto final coloreado.

Procedimiento usado para aislar células de hibridoma produciendo
anticuerpos monoclonales. PEG= polietilén glicol; HAT=
hipoxantín aminopterina timidina.

Aplicaciones diagnósticas relevantes al procesamiento
y producción de alimentos
Citometría de Flujo
Partículas biológicas de interés se
colocan en suspensión. Se añade un
color fluorescente a la suspensión la
cual se hace fluir en un tubo que pasa
por una fuente de luz, usualmente un
rayo láser, una partícula a la vez. La λ
de la luz se elige para que el colorante
ligado a las partículas deseadas
fluoresca. Una computadora cuenta
y/o analiza las células o partículas que
pasan por el rayo láser y fluorescen,
las cuales pueden separarse de las
demás y recogerse en recipientes
separados. Algunas carácterísticas de
las partículas como tamaño y forma
no requieren usar colorantes, porque
tienen una dispersión de luz típica al
pasar por el rayo láser.

IMPACTO DEL DESARROLLO BIOTECNOLÓGICO EN EL
PROCESO DE DOS PRODUCTOS ALIMENTICIOS:
Queso Cerveza
Primera Uso empírico de BAL Uso empírico de levaduras
generación Uso empírico de quimosina Uso empírico de malteado
Segunda Aislamiento y uso de BAL Uso de cultivos puros de lev.
generación Extracción, purific. y carac- Naturaleza enzimática del
terización de la quimosina malteado
Uso de papaína para la
clarificación en frío

Queso Cerveza
Tercera Propagación masiva de Mejor control de la fermentación
Generac. BAL
Selección de cultivos Fermentación continua para
lácticos mejorados. producir cerveza.
Sustitución de quimo- Prod. y uso de amilasas microbianas
sina por proteasas mi- para sacarificación y de β-glucanasas
crobianas producidas termotolerantes.
en gran escala Uso de enzimas (glucosidasas ó amilasas)
para la producción de cervezas ligeras
Cuarta ADN recombinante para Ing. Genética para obtener levaduras
Generac. producir quimosina y amilolíticas y prod. de α-acetolactato
mejoramiento de BAL descarboxilasa para [diacetilo]<0.5 mg/L
Utilización óptima de Ing. Genética y cultivo de tejidos
enzimas y m.o. para la para mejoramiento de cebada
maduración acelerada. Procesos con m.o. y enzimas inmovili-
zadas.

Uso industrial de enzimas: Quimosina (Renina)
• La quimosina bovina causa un
rompimiento específico de la kappa-
caseína, que estabiliza las micelas de
caseína. Reconoce la secuencia de
His98 a Lys111 y rompe el enlace
peptídico entre Fen105 y Met106 de
la cadena de kappa-caseína.
• Es una proteasa producida en el
cuarto estómago de la ternera, como
un precursor (pre-pro-quimosina).•
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• Después de una serie de proteólisis, la quimosina madura tiene un PM
de 35.6 kDa, y se clasifica como una proteasa aspártica o carboxil
proteasa.
• También ataca enlaces Phe-Val, Glu-Ala, Leu-Tyr, Tyr-Leu, Leu-Val,
Phe-Tyr
• pH óptimo de 3.5, aunque máxima estabilidad a pH 5.Experimenta
autólisis a pH 3.5 y se desnaturaliza a pH>6.

• Las proteasas de Mucor miehei, M. pusillus y
Endothia parasitica, tienen similar estructura y
especificidad.
• No obstante, estas proteasas no son adecuadas
para quesos madurados puesto que tienen un
rango diferente de actividades no específicas que
la quimosina y no producen los sabores correctos
en maduración prolongada.
• Las fuentes microbianas son más baratas y
tienen más estabilidad en su disponibilidad.
Además, los vegetarianos encuentran el uso de la
renina bovina inaceptable.
Uso industrial de enzimas: Quimosina
(Renina)

Uso industrial de enzimas: Quimosina recombinante
• Otra alternativa es clonar el gene bovino en una cepa productora
adecuada y producir la enzima por fermentación. Los huéspedes
posibles para su producción son:
• Escherichia coli. Es el organismo más frecuentemente usado en
clonación de genes. Desafortunadamente, las proteínas
recombinantes son frecuentemente sintetizadas
intracelularmente como cuerpos de inclusión, lo cual incrementa
considerablemente el costo del proceso. Además, E. coli no es
generalmente reconocida como segura para el consumo humano.
• Bacillus sp. Es no patogénico y se usan industrialmente para
producir amilasas. B. licheniformis produce la quimosina, pero
las secuencias señal no permitieron la secreción de la enzima al
medio de cultivo.

• Lactococcus lactis. Se usa en cultivos iniciadores, pero los
niveles de producción encontrados han sido muy bajos.
• Saccharomyces cerevisiae. Se han tenido dificultades para
obtener altos niveles de secreción en esta levadura.
• Kluyveromyces lactis. Se usa para producir β-galactosidasa, y
sus propiedades de fermentación son bien conocidas. La
quimosina pudo producirse en este huésped y se han obtenido
buenos niveles de secreción al medio de cultivo.
• El gen de quimosina se insertó en el cromosoma de K. lactis
y la levadura se crece por fermentación en lote alimentado.
Después de la fermentación, la levadura se destruye
añadiendo ácido benzoico y la quimosina se separa por
filtracion.
Uso industrial de enzimas: Quimosina
recombinante

Proceso de fermentación en cervecería

Proceso de fabricación de cerveza
Gushing: Espuma fuera de la botella. Ocurre cuando existen muchas
microburbujas y liberación excesiva e incrontrolada de CO2
Skunking: Cerveza dañada por luz (UV), por enlazamiento de iso-
humulonas con S (se pueden detectar partes por trillón).
DMS: (CH3)2S, proviene de SmetilMetionina, umbral:10-150 ppb

Tipos de Cerveza
• Los egipcios y mesopotámicos tenían en la cerveza un alimento
imprescindible.
• Se producían hasta ocho tipos diferentes de cerveza que en Egipto
era un monopolio económico en manos del faraón
• Los avances en la tecnología cervecera se afianzan en Baviera,
alrededor del año 1400, al descubrirse las ventajas de la
fermentación, no en superficie sino en la profundidad de la cuba
• Lager: Elaborada con cepas que crecen en el fondo del tanque: S.
cerevisiae. Fermentación a 6-12°C, por 8-14 d, después se almacena
por máximo 3 semanas a -1°C, antes de embotellar.
─ Es la que más se produce en Alemania, E.U., México, etc. Las lagers
de E.U. tienden a tener poco lúpulo comparado con las europeas, y
no son amargas. Con 40-90 kcal/100 ml y <6 % (v/v) alcohol
(legislación mexicana).

Tipos de cerveza
• Ale: Se hacen con cepas de superficie que crecen uniformemente
en todo el mosto, son S. cerevisiae o S. carlsbergensis. Crecen a
14-23°C por 5-7 d.
─ Es casi exclusiva de Inglaterra, y su periodo de añejamiento es de
solo 1-3 d. Tiene sabores más complejos que las lager por la T de
fermentación (sabor afrutado por ésteres, etc.). Las ales fuertes
tienen >5% de alcohol, stout, porter, pale ale, bitter, con colores de
amarillo a negro y sabores de ligeros a muy profundos y complejos
• Cervezas secas y ligeras. Pueden hacerse de ales o lagers, aunque
se usan más comúnmente las lagers. La ligera tiene sabor más
simple por menores niveles de carbohidratos no fermentescibles,
obteniéndose menos alcohol, y por tanto menos calorías (15-30
kcal/100 ml). Las cervezas secas tienen el mismo alcohol que las
convencionales, pero con diferente calidad sensorial con menos
sensación de llenado. Sin alcohol: <1 % (v/v)
• Cervezas sin alcohol: Evaporación: los componentes volátiles se
recuperan del vapor en forma de esencia por destilación
fraccionada. Rectificación al vacío: Separar CO2el cual se lava para
recuperar volátiles que se adicionan al destilado al vacío (~42°C).
Ósmosis inversa a P=5-7,5 MN/m2
. Métodos más primarios como
la simple detención del proceso de fermentación (malos sabores)

Lúpulo (Humulus lupulus)
• Confiere a la cerveza su sabor amargo característico
– Este fenómeno se debe a la isomerización de sus resinas
– Sus componentes amargos son la humulona, lupulona y sus
compuestos de transición, pero también tiene aceites esenciales
(humuleno, farneseno) y taninos.
• Son las flores de la planta femenina del lúpulo
– Se usa entre 0.4 y 4 g/L
– Es mejor usar extracto y resinas preisomerizadas
• Además, el lúpulo tiene otras funciones
– Props. antimicrobianas contra Gram(+)
– Mayor cuerpo de la cerveza

Haze forming materials
Yeast
Spoilage organisms
Oxalic acid
Cell wall
polysaccharides from
Barley
Starch
Proteins and
polyphenols

Fermentación primaria
• La fermentación es una parte crucial en el proceso de fabricación de
cerveza
• El proceso de glicólisis y fermentación fue elucidado primeramente
en S. cerevisiae
• Después de la cocción se elimina el lúpulo, se enfría el mosto y se
transfiere al biorreactor.
• Se agregan ~0.5 L de una suspensión de levadura por 100 L de mosto
para disminuir la fase lag.
• La fermentación es un proceso anaeróbico para generar energía a
través de la reducción de aceptores electrónicos orgánicos como la
G3P o acetaldehído.
• Altas conc. de glucosa y otros carbohidratos evitan la respiración de
S. cerevisiae, alterando la estructura mitocondrial, ocasionando que la
fermentación sea la ruta predominante de obtención de energía, aún
cuando exista abundante oxígeno, este fenómeno se denomina efecto
Crabtree.

Glucosa (180 g) →
2 EtOH (92 g) + CO2 (88)
Alcohol deshidrogenasa (Zn)
Piruvato descarboxilasa
(Mg2+
)

Fermentación secundaria
• Cuando todos los CHO fermentescibles se han convertido en EtOH, la
cerveza se transfiere a otro tanque, se enfría y se almacena, aún con la
presencia de las levaduras.
• El añejamiento varía de varios días a meses, donde la levadura es
capaz de ejercer un metabolismo limitado.
• Se dan otros cambios debido a reacciones químicas que mejoran el
sabor de la cerveza (ésteres: etil-, isoamil-, feniletil-; alcoholes,
ácidos etil octanoato y etil caprilato, dicetonas vecinales, comps. de
azufre [DMSO, (CH3)2S, DMS], acetaldehído, ác. grasos de cadena
corta)
• Cambio más importante: reducción en niveles de diacetilo (fuerte
sabor a mantequilla) indeseable en cerveza. El diacetilo se forma a
partir de α-acetolactato (intermediario en la biosíntesis de varios
aminoácidos) a través de un proceso no enzimático.
• El diacetilo se convierte lentamente a acetoína por la levadura. Las
cervecerías modernas carbonatan la cerveza antes de envasar (4-5 g
CO2 /L). Se agrega glucosa para producir CO2 en el producto final.

[diacetilo]<0.5 mg/L, para no detectar sabor
α-acetolactato Acetoína
Diacetilo

N: ayuda a espumar,por polipéptidos
amfipáticos (10-50 ppm), suprime
carácter amargo.
O2: envejecimiento, turbidez
EtOH: puede inhibir espumado

A favor En contra
Polipéptidos Lípidos
Iso α-ácidos Detergentes
Me2+
Etanol
N2
Aspectos de la espuma de cerveza
• Formación (nucleación, moldeado)
• Estabilidad (retención de cabeza)
• “Lacing” (pegado, adhesión)
• Textura, blancura, etc
Proteínas responsables
del espumado
Hipótesis del polipéptido discreto
Hip. De los polipéptidos amfipáticos generalizados

Mejoras biotecnológicas de la
cerveza: Represión catabólica
• La glucosa es la mejor fuente de carbono para las levaduras
porque puede pasar directamente a la ruta fermentativa
• La glucosa es preferencialmente fermentada por las
levaduras y se usan otros carbohidratos cuando se termina la
glucosa, siendo entonces sujetos a represión catabólica (RC)
• Esto resulta en una disminución indeseable en la velocidad
de producción de etanol que a lo largo de un año provoca
pérdidas significativas en la producción de la cervecería
• En levadura, la RC también se ha llamado señalización de la
glucosa. Cuando se termina la glucosa, se inactivan los
genes necesarios para su utilización y se activan aquellos
involucrados en la entrada y uso de otros azúcares, como
maltosa, ocurriendo un cambio diáuxico.

Represión catabólica en levaduras
• En levaduras los niveles de adenosín monofosfato cíclico
(cAMP), aumentan cuando la glucosa está presente; esto
bloquea la transcripción de genes que codifican para
proteínas involucradas en la toma y uso de maltosa y otros
azúcares, aunque el mecanismo de esta regulación no está
claro todavía.
• Como los mecanismos de la RC en levadura no están
claros no se pueden alterar los genes para modificar la RC.
• Se ha intentado eliminar la RC en algunas cepas de
levadura de cervecería exponiéndolas a un mutágeno
(sustancia que causa cambios aleatorios en la secuencia del
DNA), y luego a 2-desoxiglucosa, un análogo de glucosa,
que no puede usarse como fuente de C (y energía) por las
levaduras

Represión catabólica en levaduras
• Células con RC “normal de las cepas silvestres” no pueden
usar fuentes alternativas de C debido al efecto inhibitorio
de la 2-desoxiglucosa.
• Uno de los muchos mutantes puede desarrollar una RC
alterada, por mutación de un gen responsable de codificar
una proteína reguladora clave en la expresión genética.
• Tal mutante podría ser capaz de usar otros carbohidratos, a
pesar de la presencia de 2-desoxiglucosa.
• Esta estrategia se ha usado exitosamente para producir
levaduras mutantes que pueden usar glucosa, maltosa y
maltotriosa simultáneamente, evitando la fase lag que
normalmente ocurre a medida que declinan los niveles de
glucosa.
• Recientemente los genes mig1 y mig2 se han descubierto
como los responsables de la represión catabólica

Uso de una estrategia de mutagénesis para aislar
cepas de levadura con RC alterada
Exponer la levadura al mutágeno
Mutaciones aleatorias en el genoma de la levadura
Exponer las levaduras a 2-desoxiglucosa
La RC previene el uso
de otros carbohidratos
Levaduras con RC alterada pueden
usar otros carbohidratos
Mueren las levaduras
silvestres
Sobreviven las levaduras
mutantes
Exponer la levadura al mutágeno
Mutaciones aleatorias en el genoma de la levadura
Exponer las levaduras a 2-desoxiglucosa
La RC previene el uso
de otros carbohidratos
Levaduras con RC alterada pueden
usar otros carbohidratos
Mueren las levaduras
silvestres
Sobreviven las levaduras
mutantes

Mejoras en los procesos
industriales
• S. cerevisiae utilizada en la industria cervecera flocula al
presentarse una falta de nitrógeno, oxígeno o carbono. La
floculación está controlada por una proteina de pared celular con
su N-terminal hacia el medio y esta se une a glucoproteínas
(manosa)
• Introducción de β-glucanasa para facilitar el filtrado de la
cerveza (β-glucanos son muy viscosos)
• Disminución del tiempo de fermentación por deleción de
mecanismo de control de expresión de invertasa y maltasa (mig1,
mig2), a causa de un incremento en el consumo de maltosa y un
decremento en el tiempo de adaptación cuando se agota la
glucosa.

Biotecnología: Cinco áreas tecnológicas
principales
 DNA recombinante (rDNA). Inserción de DNA a un
nuevo sistema, donde se clona y se expresa.
 Tecnología enzimática. Se usa la capacidad catalítica de
las enzimas en solución o inmovilizadas.
 Cultivo de tejidos de plantas. Cultivo in vitro de células de
plantas para obtener sustancias o biotransformaciones
requeridas.

 Técnicas de células fusionadas. Fusión de dos células diferentes,
produciendo híbridos con características de ambos padres.
 Ingeniería del procesamiento y tecnología de fermentaciones.
Usos de la Biotecnología en el procesamiento de alimentos
1. Diseño de microorganismos que transformen biomasa no
comestible en alimento para consumo humano o alimentación
animal.
2. Uso de sistemas biológicos para ayudar al procesamiento de
alimentos ya sea actuando directamente sobre el alimento o
suministrando materiales que puedan añadirse al alimento
(aditivos)
3. Procesos innovadores en la tecnología de alimentos: eliminación
de ácido erúcico del aceite de canola. www.alltech.com/es

Categoría de Procesos
1. Producción de células microbianas: levadura, vacunas, insecticidas
microbianos.
2. Producción de metabolitos: alcohol, ácidos orgánicos, antibióticos,
aminoácidos, vitaminas y enzimas.
3. Bioconversión de sustratos, no utilizados para crecimiento:
hormonas esteroides: Progesterona →11-hidroxiprogesterona por
Rhizopus nigricans, luego por síntesis química: cortisona y otros
tres esteroides (800 tons/año).
4. Bioconversión de sustratos, usados para crecimiento pero con
objeto principal de cambiar su estado físico: aguas residuales
5. Alimentos fermentados: yoghurt, queso, ensilado, salami, etc.
6. Cultivo de células de plantas y animales usando técnicas
microbiológicas.
a) Células animales. Anticuerpos monoclonales
b) Células de plantas

Procesos Biotecnológicos
Selección del organismo
Genética Aplicada
(mutación, recombinación, manipulación de genes)
Biorreactor
(Células microbianas, de plantas
o animales; enzimas)
Calor
Eliminación
de gases
Esterilización
Procesos de recuperación
(rompimiento de pared celular, separación S-L,
concentración, cromatografía, cristalización)
Producto final
(enzimas, antibióticos, aminoácidos)
Elim. de
sólidos Elim.
biomasa

Transformación Genética de Cultivos

Usos Potenciales de Plantas Transgénicas de Relevancia
para Consumidores y la Industria de Alimentos.

Cultivos recombinantes liberados en
EUA entre 1994 y 2000
(lino)

http://whybiotech.com/mexico.asp?id=2701; Council for Biotechnology Information, (2004)
"Plant Biotechnology: Current and Potential Impact for Improving Pest Management
in U.S. Agriculture, An Analysis of 40 Case Studies," National Center for Food and
Agricultural Policy, June 2002, <www.ncfap.org/40CaseStudies.htm>.
Rendimiento del algodón Bt en México
•Cutivos de OGM como canola,
maíz, algodón y soya
representarion más del 99% de
cultivos de OGM a nivel
mundial en 2001. En 2001 en
EUA únicamente éstos 4
cultivos más papaya y
calabacita transgénicos
produjeron un extra de 4
millardos de lb de alimento y
fibra, y aumentaron el ingreso
de granjas en $1.5 millardos y
redujeron el uso de plaguicidas
en 46 millones de lb.

Factores que conducen a la hostilidad del consumidor
hacia alimentos conteniendo plantas transgénicas
Dañará el ambiente?
¿Es seguro para comer?
¿Cómo me
beneficia?
La nueva tecnología
es riesgosa
Preocupa-
ciones del
consumi-
dor
Rechazo del consumidor
de alimentos conteniendo
plantas transgénicas

Compuestos indeseables en cultivos comestibles,
naturaleza química y presencia o ausencia de líneas
transgénicas con niveles reducidos de cada compuesto

Procesos biotecnológicos por fermentación
• Leches fermentadas
– Grupo I. Lactococcus y leuconostoc. Acidez baja ó moderada: Jocoque,
buttermilk
- Grupo II. Lactobacillus. Acidez moderada/alta: Leche búlgara, yakult,
leche acidófila
- Grupo III. Lactobacillus, Streptococcus. Acidez moderada/ alta. Yoghurt,
Bioghurt, Brano
– Grupo IV. Bacterias lácticas y levaduras. Acidez y alcohol: Kefir,
Koumis, “Búlgaros”
• Suero
- Producción de ácidos orgánicos (propiónico, acético, láctico), etanol,
β-galactosidasa
- Medio de cultivo: Proteína unicelular (Kluyveromyces marxianus)
- Levadura para panificación (S. cerevisiae), después de hacer
disponible los azúcares (hidrólisis de lactosa)
- Bebidas (Rivella, Gefilus)

Composición del suero lácteo
Dubach, 1988.
Base húmeda
DBO: 30-50 g/L

Producción mundial de suero lácteo
FAO, 2001

Usos del suero lácteo
Cámara de productos alimenticios
elaborados con leche, 1985
Producción de 1.15 millones de tons
(1984), y 85% más para 1995.
Productos lácteos
(WPC, WPI)
Hidrolizados proteicos
Panadería
Confitería
Ac. Láctico
Enzimas: inulinasa, lactasa
a partir de K. lactis, o
pectinasa y lactasa.
Alimentación humana
Jarabes de suero
Proteína unicelular (C. utilis,
K. marxianus)

Programas de investigación sobre propiedades
nutracéuticas de productos lácteos
• Inhibidores de la enzima convertidora de
angiotensina-I (ACE)((Dism. la presión arterial)
• Glicomacropéptido (64 aa)
• Prebióticos, probióticos y simbióticos
• β-lactoglobulina como acarreador y fijador de retinol
• Péptidos bioactivos liberados de las estructuras
nativas de la caseína (casomorfinas, fosfopéptidos)
• Proteínas biológicamente activas (lactoferrina y sus
péptidos)

Productos fermentados de leche
como alimentos funcionales
• Probióticos
– Microorganismos benéficos
• Prebióticos
– Incrementan el crecimiento de probióticos
• Simbióticos
– probióticos y prebióticos juntos

Hidrolizados de proteína
de leche
• Farmacéutico – dietas de formulación
definida, nutrición enteral, nutrición
parenteral
• Alimentos infantiles – hipoalergénicos, no
alergénicos, bajo peso al nacer,
fenilcetonuria
• Fortificación Nutricional - calcio bebidas
enriquecidas, bebidas isotónicas para
atletas.

Péptidos derivados de la leche bovina
con propiedades inmunoregulatorias
Adapted from Gill & Rutherfurd, 1998

Algunos nutracéuticos podrían ser más
adecuadamente clasificados como
fármacos
Vaca Hiper-
inmunizada
Tratamiento
térmico
Inmunización
Bacteria
Vaca
Transgénica
Ingenería
genética
• Inmunoglobulinas
basadas en Leche y
calostro (MCBI’s)
• Componentes
antibacteriales no
específicos
Tratamiento de
enfermedades
digestivas.
Manufactura
Posible
actividad
anticariogénica

Anti-allergy properties of fermented foods: an important
immunoregulatory mechanism of lactic acid bacteria?
M. L. Cross, L. M. Stevenson and H. S. Gill
Milk and Health Research Centre, Institute of Food, Nutrition and Human Health, Massey University, Palmerston North, New Zealand
International Immunopharmacology
Volume 1, Issue 5, May 2001, Pages 891-901
Abstract
Clinical reports have suggested that dietary consumption of fermented foods, such as yogurt, can alleviate some of the
symptoms of atopy and might also reduce the development of allergies, possibly via a mechanism of immune
regulation. Controlled studies have indicated that consumption of fermented milk cultures containing lactic
acid bacteria (LAB) can enhance production of Type I and Type II interferons at the systemic level. In animal
models, LAB have been shown to promote interferon expression, and to reduce allergen-stimulated production
of IL-4 and IL-5 in some cases. Recent results have shown that LAB are potent inducers of pro-interferon
monokines (IL-12 and IL-18), and that cytokine secretion is stimulated by the interaction of Gram-positive cell
wall components with surface receptors of mononuclear phagocytes, via NF-κB and STAT signalling
pathways. However, it is clear that the extent and quality of LAB-induced immunoregulation is strain-
dependent. This review discusses the clinical and laboratory evidence for anti-allergy properties of fermented
foods, and proposes a model for the mechanism by which some well-defined strains of immunoregulatory LAB
might down-regulate a Th2 allergic phenotype.

PM= 14.2 kDa y es muy parecida a la proteína
humana. 74% de sus aminoácidos son
idénticos, y un 6% extra tiene un alto grado de
similitud químca.
La alfa-LA bovina consiste de 123 aas y cerca
del 10% de la proteína bovina está glicosilada.
Tiene 4 enlaces disulfuro, Cys6-Cys120, Cys28-
Cys111, Cys61-Cys77, and Cys73-Cys91. Dos puentes
(Cys6-Cys120) y (Cys28-Cys111) están en el
dominio-a, el tercero (Cys61-Cys77) está en el
dominio-b. El cuarto (Cys73-Cys91) conecta la
hélice-C del dominio-a con una hélice-310 en
el dominio-b. No tiene tiol libre y es una
metaloproteína que enlaza Ca, en donde el Ca
estabiliza la estructura.
α-lactalbumina Bovina

• Embutidos fermentados
Los microorganismos reducen la humedad, contribuyen a la
estabilidad y proporcionan sabores y aromas característicos.
M.O.: BAL, Corynebacterium sp., Debaromyces sp.,
Penicillium expansum, P. nalgioviensis.
Pueden ser secos y semisecos, de carne (principalmente
cerdo) picada que por acción microbiana llegan a un pH≤ 5.3,
y eliminada 25-50% de humedad (secos) ó 15% (semisecos).
- Ahumados/curados (semisecos): Thuringer (alemán). 18-48 h
de maduración a 35-40°C, cocción a 105°C; 50% humedad
- Secos. Salami (italianos). 18-48 h de maduración a 28-32°C;
30-69 d de secado a 10-22°C; 35-40% humedad
- Ahumados. Boloña (embutido de Líbano, Penn.). Sólo de res.
10 d en salmuera a 4°C, uso de KNO3; ahumado a 68°C por
4-8 d. 50% humedad.

Clasificación de bebidas alcohólicas según el
sustrato de donde proceden
Sustrato No destiladas
(3.5-14% alcohol)
Destiladas
(35-55% alcohol)
Fortificada
(~20% alcohol)
FRUTAS
Uva Vino, champaña,
vino espumoso
Brandy, coñac,
armañac, pisco
grappa
Jerez, oporto,
vermouth,
moscatel, madeira
Manzana Sidra, sidra
espumosa
Calvados
Pera Perry
Cereza Kirsch
Otras Vinos de frutas:
capulín, ciruela, gua-
yaba, pitahaya, etc.

Sustrato No destiladas Destiladas
Cereales
Cebada Cerveza Whisky
Maíz Tesgüino Bourbon, whisky de
maíz de Tennessee
Varios
(incluyendo papa)
Vodka, ginebra, akvavit
Arroz Cerveza africana
Caña
Melazas ó jugo Ron, aguardiente,
cachaza, pinga,
charanda
Agaves Pulque (A. atrovirens) Tequila (A. tequilana Weber),
mezcal (A. angustifolia)
Miel Vino de miel
Clasificación de bebidas alcohólicas (Cont.)

¿Qué es el mezcal?
NOM-070-SCFI-1994 Bebidas alcohólicas
• Es aquel producto que se obtiene de la destilación y rectificación de
mostos preparados directa y originalmente con los azúcares de las
cabezas maduras de los Agaves, previamente hidrolizadas o cocidas y
sometidas a fermentación alcohólica con levaduras, cultivadas o no.
• El Mezcal 100% agave puede ser joven, reposado o añejo y susceptible de
ser abocado.
• Este debe ser producido en la “Región del Mezcal” en México. Durango,
Zacatecas, San Luis Potosí, Guerrero y Oaxaca.

Materia prima utilizada para producción de
Mezcal en México
Otras especies del genero agave excepto A. tequilana.
Agave salmiana
Agave angustifolia haw
Agave potatorum
Agave scabra
Agave weberi
SLP
ZACOAX
GUE
OAX
GUE
SON
DUR
ZAC
GUE

Mezcal
5. Destilación
y Almacenamiento
4. Fermentación
3. Molienda2. Cocción1. “Jima”
Proceso de elaboración del Mezcal

Alimentos y bebidas fermentados tradicionales
• Alimentos fermentados por hongos. Productos de origen indonesio
como el tempeh (soya fermentada por Rhizopus oligosporus) , y
oncom (cacahuate fermentado por neurospora sp.).
• Alimentos fermentados por bacterias. Generalmente BAL, género
Bacillus.
- Verduras fermentadas. Col (sauerkraut), rábano, pepinos, etc.,
fermentados en salmuera
- Pescados fermentados. Salsas y pastas de pescado usadas como
condimento en el sureste asiático. Kecap de Indonesia, patis de
Filipinas.
- Granos fermentados. Fermentación por B. subtilis de soya para
producir natto (producto viscoso de olor y sabor penetrante) en
Japón.
- Productos de maíz. En África se fermenta una masa de maíz
dando el kenkey. La fermentación dura 3 d y se ha identificado a
Corynebacterium sp., Aerobacter cloacae y Lb. plantarum

Alimentos y bebidas fermentados tradicionales
- Productos de arroz. El idli es un pan hindú a base de arroz y frijol
negro. Se produce ácido y gas por fermentación natural con L.
mesenteroides y S. faecalis.
- Productos de yuca. El gari es yuca fermentada por 3-4 d, se fríe y se
mezcla con agua, azúcar, especias
• Alimentos fermentados por mezcla de hongos y levaduras
el ragi de origen chino se usa como inóculo en varias fermentaciones
asiáticas. Se hace fermentando harina de arroz y Mucor, Rhizopus,
Candida y Saccharomyces le confieren sabor dulce, un poco ácido y
alcohólico
• Alimentos fermentados por hongos, seguido de una mezcla de
bacterias y levaduras
Se usa como inóculo el tane koji que es un polvo verde-amarillento
conteniendo esporas de A. oryzae y A. soyae, para la primera
fermentación de la salsa de soya. La segunda fermentación se hace
con bacterias y levaduras. Otro producto similar es el miso y sake

Algunos alimentos mexicanos fermentados
Nombre Descripción Estados donde se
consume
Alimentos de maíz
Atole Bebida no embriagante (BNE)
preparada con masa de maíz, ó de
tortillas y mazorcas
SLP, Ver, Hgo, Pue,
Gro, DF,Tlax, Mich,
Jal, Oax.
Atole agrio BNE de masa de maíz negro y
fermentado por 4-5 d
SLP, Ver, Hgo, Pue,
Gro, DF,Tlax, Mich,
Jal, Oax.
Charagua BE a base pulque con almíbar, chi-
le ancho y hojas de maíz tostado.
Se calienta y luego se fermenta.
SLP, Ver, Hgo, Pue,
Gro, DF,Tlax, Mich,
Jal, Oax.
Pozol BNE ácida. Masa de maíz nixtama-
lizado fermentada envuelta en
hojas de plátano; diluido con agua
Tab, Chis, Yuc, Oax,
Ver, Gro, QR.

Algunos alimentos mexicanos fermentados (Cont.)
Nombre Descripción Estados donde se
consume
Alimentos de
frutas
Colonche
Bebida dulce, gaseosa, ligero olor
butiráceo, y bajo contenido alcohólico.
Fermentación de jugo de tunas
Chih, Son, SLP,
Zac, Dgo
Tepache Bebida dulce refrescante. Se obtiene de
la fermentación de jugo y pulpa de piña,
naranja, guayaba, arrallanes
De consumo
general en el país
Chicha Bebida alcohólica elaborada de piña,
agua de cebada y masa de maíz prieto.
Se fermenta por 4 d y se añade dulce,
clavo y canela
Tejuino Bebida alcohólica obtenida por infusión
del jugo de tunas con cáscara de frutos

Métodos para el estudio de comunidades microbianas en
alimentos fermentados
Clonación
ARDRA=Análisis de Restricción de DNA Ribosomal Amplificado
AFLP= Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados
RAPD= Análisis de DNA polimórfico amplificado al azar
RFLP=Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción
Denaturing gradient gel electrophoresis (Urea 6M, Formamida)
Temperature Gradient Gel Electrophoresis

ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) consiste en amplificar el gen
16S rRNA seguido de una separación de digeridos con diferentes enzimas de restricción.
Estos patrones de restricción combinados resultan en perfiles ARDRA que permiten
diferenciar entre la mayoría de las especies. Por ej. los patrones de restricción obtenidos con
respectivamente CfoI, AluI, MboI, RsaI y MspI numerados respectivamente 1,1,1, 2 and 3
rinden en combinación el perfil ARDRA 11123 que es característico de A. baumannii. El
proceso completo de extracción de DNA (a partir de un cultivo puro), amplificación del 16S
rDNA, restricción, digestión y electroforesis en agarosa toma un día (hasta 30 cepas).
Figure 1. Patrones de restricción obtenido después de digestion con enzimas de restricción CfoI,
AluI, MboI, RsaI and MspI para 16S rDNA amplificado de diferentes especies de Acinetobacter.

Genomic species
Pattern with enzyme Strains
Reference strainCfoI AluI MboI RsaI MspI (N)
1 (A. calcoaceticus) 2 2 1 1 3 7 ATCC 23055T
3 2 1 1 3 1 RUH 583
2 (A. baumannii) 1 1 1 2 3 27 ATCC 17904
1 1 1 2 1 33 ATCC 19606T
1 1 1 2 1+3 4 LMD 82.54
Perfiles ARDRA de cepas de Acinetobacter previamente
identificadas a especies genómicas por el uso de
hibridación DNA-DNA.
Los patrones se muestran en la Fig. anterior.

AFLP
I paso: digerir DNA genómico con una enzima de restricción que corte
frecuentemente (MseI, 4 pb secuencia de reconocimiento) y otra que corte
menos fecuentemente (EcoRI, 6 pb secuencia de reconocimiento).
Los fragmentos resultantes se ligan a moléculas adaptadoreas extremo-
específicas.
Se realiza una amplificación preselectiva por PCR usando primers
complementarios a c/u de los adaptadores, excepto por la presencia de una
base adicional en el extremo 3‘, seleccionada por el usuario. Ocurre
amplificación de solo 1/16 de los fragmentos de EcoRI-MseI.
En un segundo PCR "selectivo", se usan los productos del primer PCR como
plantillas, conteniendo los primers dos bases adicionales, seleccionadas por el
usuario. Los “primers” para los adaptadores específicos de EcoRI están
etiquetados por fluorescencia o radioactividad.
El perfil electroforético revela un patrón (huella digital) de fragmentos
representando cerca de 1/4000 de los fragmentos de EcoRI-MseI.
Primer preselectivo EcoRI GCCTAAGCCGAATTCg
Adaptador -------------------------------|
Primer selectivo EcoRI GCCTAAGCCGAATTCgtc
Adaptador --------------------------------|

AFLP
Comparado con RAPD, se requieren menos “primers” para realizar
escrutinios de todos los sitios posibles.
El procedimiento de AFLP típicamente detecta más polimorfismos
por reacción que los análisis por RFLP o RAPD.
El análisis AFLP es especialmente útil para el escrutinio de
individuos que se retrocruzan (backcross).
AFLP's, pueden ser marcadores codominantes, como los RFLP's. La
codominancia resulta cuando el polimorfismo se debe a secuencias
dentro de la región ampliada. Pero debido al No. de bandas
observadas al mismo tiempo, se requiere evidencia adicional para
determinar que un grupo de bandas resulta de diferentes alelos en el
mismo locus.
Si el polimorfismo se debe a la presencia/ausencia de un sitio de
unión al primer, la relación es dominancia. El alelo que no tiene
unión al primer no será detectado como una banda.

RAPD
La complejidad del DNA nuclear eucariótico es suficientemente alta para que
aleatoriamente existan pares de sitios complementarios a octa- o decanucleótidos de
una tira en la orientación correcta y relativamente cercanos unos de otros para que
puedan ser amplificados por PCR.
Con algunos decanucleótidos escogidos al azar no se amplifica secuencia alguna.
Con otros, productos de la misma longitud se generan a partir de DNAs de
diferentes individuos. Con algunos otros, se dan patrones de bandeo (ver figura)
diferentes para cada individuo de una población.
La bandas variables son comúnente llamadas DNA polimórfico amplificado al azar
(RAPD). Tres de las bandas de la figura son bandas RAPD.
RAPDs exhiben polimorfismo y pueden usarse como marcadores genéticos
RAPDs son dominantes en el sentido de que la presencia de una banda RAPD
no distingue entre estados hetero- y homozigotos.

Tecnología Enzimática
• El mercado mundial para las enzimas de interés industrial se ha
estimado en US $ 625 millones (1989) y $ 2 millardos (2004), siendo
Novozymes (55%) y Danisco (30%, Dinamarca) los principales
productores, con un ritmo de crecimiento de 2-3% anual.
• En México el mercado estimado es de US $17 millones.
• En 1985 se produjeron 80 000 tons de productos enzimáticos,
equivalentes a 4 000 tons de proteína activa.
• La mayoría de las enzimas producidas encuentran aplicación en la
industria de los alimentos: la industria alimentaria ocupa el 62 % (con
la tercera parte usada en panificación), la textil el 5 % y la industria
de los detergentes el 33 %.
• En la industria alimentaria las enzimas se utilizan principalmente para
el procesamiento del almidón, en seguida para la elaboración de
quesos, jugos, repostería, jarabes fructosados.

Distribución del mercado mundial de las enzimas
Rao y col., 1998

Selected Industrial Enzyme Companies
AB Enzyme www.abenzymes.com
Bio-Cat www.bio-cat.com
Danisco Dinamarca www.danisco.com
Diversa Corp. www.diversa.com
DSM Food Specialties USA www.dsm.com
Enzyme Development Corp. www.enzymedevelopment.com
Genencor Internationala
www.genencor.com
National Enzyme Co. www.nationalenzymecompany.com
Novozymesb
www.novozymes.com
a
Second largest manufacturer
b
First largest manufacturer

Enzimas en la industria
Kaneka ha encontrado una formiato
deshidrogenasa robusta para el
reciclaje de cofactores en procesos
de oxidación-reducción.
Dowpharma ha usado su tecnología
de expresión Pfenex para producir
grandes cantidades de enzimas.

Uso Industrial de enzimas: Panificación
• En panificación, las amilasas, celulasas y
proteasas ayudan a procesar el pan y la
masa para mejorar las calidades de:
textura, volumen, estabilidad y estructura
de la miga.
• La harina de trigo contiene <1% de
azúcares fermentescibles, Los principales
carbohidratos son almidón y pentosanos.
• La harina contiene ~5-7% del almidón
dañado el cual es susceptible de ataque
enzimático. Las α- y β-amilasas actúan
sobre ésta fracción de almidón
produciendo maltosa.
• La harina quebrada y molida generalmente
tiene poca α-amilasa y se añade
comúnmente a la harina, usualmente como
una preparación fúngica.
Una dextrinización excesiva produce una
miga con textura suave, pegajosa en la
hogaza terminada. La α-amilasa también es
efectiva para retrasar el envejecimiento del
pan.

Uso Industrial de enzimas: Panificación
• La harina de trigo contiene también ~
2.5-3% de pentosanos, tal como
arabinoxilanos que representan cerca
de un cuarto de la absorción de agua
de la masa. Los pentosanos insolubles
deprimen el volumen de la hogaza y
hace una estructura de la miga mas
abierta. Existe actualmente mucho
interés en usar xilanasa en
panificación para reducir el contenido
de pentosano insoluble.
• Las proteasas (de A. oryzae) se
añaden a menudo para relajar la masa,
resultando en mayor mobilidad y
extensibilidad. Esto es probablemente
debido a efectos en las fracciones de
gluten o gliadina de las proteínas. Una
accción excesiva de las proteasas
causa pegajosidad en la masa.

Uso Industrial de Enzimes: Panificación
• Otra adición común a los sistemas
de masa es la lipoxigenasa.
• Esta enzima oxida los ácidos
grasos cis, cis-polienoicos a
hydroperó-xidos, oxidando
conjuntamente los grupos -SH de
las proteínas a grupos -S-S-,
aumentando la resistencia de la
fracción del gluten en las proteínas
de la masa.
• También actúa ésta enzima como
blanqueador ya que decolora los
carotenoides de la harina.
• La enzima es usualmente añadida
en forma de harina de soya
desgrasada.
Soybean lipoxygenase

Uso Industrial de enzimas: Lipasas en la Industria Láctea
• Se usan principalment en la IL para la mejora del
sabor y en la maduración de quesos.
• Los ácidos grasos libres dan el sabor y aroma
característricos de los quesos: liberación de
ácidos grasos de cadena corta (C4 y C6) dando
sabores fuertes y ác. grasos de cadena media
(C12 y C14) dan origen a sabores a jabón.
• Los ác. grasos pueden ser biotransformados
por la población microbiana del queso,
conduciendo a la formación de compuestos de
sabor como acetoacetato, beta-ceto ácidos, metil
cetonas, ésteres y lactonas.
• Tradicionalmente lipasas animales se han
usado en los quesos, con cada especie resultando
en un perfil de sabor característico.
Recientemente, se han introducido lipasas
microbianas de Mucor miehei, Aspergillus niger,
y A. oryzae.
Queso Lipasa
Romano cabrito/cordero pre-
gástrico
Feta Mucor miehei
Mozzzarella Ternera/cabrito pre-
gástrico
Parmesano
Provolone
Cheddar A. niger
Manchego A. oryzae
Azul

Uso Industrial de enzimes: varios
• Las pectinases ayudan a romper las paredes ceulares
de las plantas, permitiendo más eficiente extracción de
jugos para bebidas de fruta y vino, y mejorar el
proceso de clarificación.
• Una gran variedad de enzimas especializadas se han
usado para diferentes productos. P. ej. pueden usarse
proteasas específicas para hidrolizar compuestos
alergénicos en soya o leche, permitiéndoles un uso
seguro como aditivos alimentarios.
• Las enzimas son también valiosas en la producción de
sabores y fragancias para mejorar la calidad de los
alimentos.

Enzimas y microorganismos con potencial en
la industria de alimentos
Termolisina
(B. thermoproteolyticus)
Síntesis de aspartamo
Pululanasa ácida
(B. acidopullulyticus)
Sacarificación de almidón
Fructosil transferasa
(B. subtilis)
Nuevos disacáridos
α-amilasa ácida
(B. stearothermophilus)
Producción de jarabes de
maltosa
Ligninasas
(Arthrobacter sp.)
Degradación de cáscara de
cacahuate
Varias
(Irpex lacteus, Formitopsis pincola)
Generación de aroma en
quesos

Producción industrial de aminoácidos
• La producción microbiológica de aminoácidos se basa en la
conversión de diferentes fuentes de carbono, tales como
melaza, glucosa, hidrolizados de almidón, azúcar, etc. Pero no
en todos los casos se usa la fermentación comercialmente.
Método Ejemplo
Fermentación (glucosa/melazas) Acido L-glutámico, L-lisina
Enzimático (preparación de Ac. L-aspártico de ac.
fumárico
precursores) L-alanina de ác. L-aspártico
Síntesis química DL-metionina
Extracción L-cisteína de pelo humano y
de equino

Aplicación de técnicas modernas de biotecnología
para la producción de aminoácidos
Metodología Aminoácido
Cultivo continuo L-lisina
Cultivo continuo en cepa transformada L-triptofano
genéticamente
Ingeniería genética L-treonina, L-fenilalanina
Células inmovilizadas/sistema continuo L-serina
Nueva cepa, sustrato barato, L-fenilalanina
ingeniería genética
Se han usado técnicas de ADN recombinante eficientemente en
Brevibacterium flavum (Lys) y Corynebacterium glutamicum (Glu),
con el fin de tener cepas mutantes, con características regulatorias
deseadas e hiperproductoras de aminoácidos.

Aminoácidos usados en la industria alimentaria
Aminoácido Prod. mundial/
año (tons)1984
Usos Utilidad
L-Glu (GMS) ~1 millón
(2004)
Varios Reforzar sabor, ablandador
de carne
L-Asp y Ala 5,000 (Q) Jugo de frutas Enriquecer el sabor
Gli 6,000 (síntesis
química, Q)
Alim. Endulzados
Nutrición humana
Mejorar sabor, punto de
inicio en síntesis orgánica
L-Cys 700
(Extracción)
Pan, jugos de
frutas
Mejorar la calidad;
Antioxidante
L-Try + L-His 400 Varios, leche en
polvo
Antioxidante, aditivo
nutritivo
L-Lys 70,000 Pan (Japón), Alim.
animal
Aditivo nutritivo
L-Met
DL-Met
150 enzimática
120,000 (Q)
Prods. de soya;
Alim. animal.
Aditivo nutritivo, uso en
hepatitis (terapéutico)
Valor de mercado estimado (2004): $ US 3.5 billones; Ajinomoto (30%), ADM y BASF. 52%
alimentos, 30% alim. animal, 18% especialidades químicas y farmacéuticas).

Produccción de aminoácidos por enzimas
inmovilizadas
Acetil D,L-aminoácido L-aminoácido
Aminoacilasa
Racemización
DL-R-CHCOOH + H2O
NHCOR’
L-R-CHCOOH + R’COOH +
NH2
D-R-CHCOOH
NHCOR’
Acil-D-aminoácido
 Tanabe (Japón) en 1969 desarrolló un proceso continuo
utilizando aminoacilasa de A. oryzae inmovilizada en DEAE-
Sephadex.
 Con reactores de 1 m3
se obtienen 200-250 kg de aa/día.
 Se producen por este método L-Ala, L-Met, L-Phen, L-Trp, L-
Val (5—20 ton/mes).

Aumento de la productividad de Aminoácidos
• La fig. siguiente muestra las rutas bioquímicas y los mecanismos
regulatorios de metabolitos producidos por m.o. y métodos de
promoción de sobreproducción de los metabolitos
• Para tener una sobreproducción, el aa debe excretarse de la célula, la
cual deberá seleccionarse de entre otras con cambios en sus
mecanismos de control
• Para el ácido glutámico (GLU), la velocidad de crecimiento de las
bacterias (Brevibacterium lactofermentum ó Corynebacterium
glutamicum), aumenta por la adición de biotina al medio. Pero esto
reduce la permeabilidad de la membrana para GLU disminuyendo
su síntesis y acumulación.
• La adición de penicilina ó ác. grasos saturados (C16, C18) al cultivo
restaura la permeabilidad de la membrana, resultando altos
rendimientos y acumulación de GLU

Métodos típicos para promover la sobreproducción de metabolitos
Puntos de Control
Aceleración
Desregulación
ó limitación
Símbolos
S: Sustrato
A y B: Interme-
diario
C: Subproducto
P: Producto
E: Enzima
Producción
Inhibición ó
represión
Función
1: Activación ó
crecimiento celular
2: Aceleración de
la exc. de producto
3: Elim. de la inhib
por retroaliment. y
represión
4: Enriquecimiento
de la activ. enzim.
5: Reduc. de la ac.
enz. que conduce a
subproductos

Aspartato Glucosa
Aspartil fosfato
Aspartato cinasa
Aspartato semi-aldehido
Mutante no tiene homoserina
deshidrogenasa
Homoserina
Metionina Treonina
Dihidropicolinato
Diaminopimelato
Lisina
Ruta y control de la producción de Lis en mutantes
auxotróficos de C. glutamicum
Penicillin yields raised from 0.15 to 7 g/L by spontaneous or induced mutations
auxótrofo cuando sólo
es capaz de proliferar en
un medio de cultivo si a
éste se ha añadido
alguna sustancia
específica, que el tipo
silvestre, llamado
protótrofo no requiere,
porque es capaz de
sintetizarla.
Oxaloacetato

Aminoácidos producidos por cepas mutantes
• La producción de L-LIS se obtiene de cepas productoras de
L-GLU donde la primera enzima de la ruta biosintética
(Aspartato cinasa; AC) se regula por unos cuantos
metabolitos tales como TRE y LIS a través de una inhibición
por retroalimentación concertada (el efecto de los
moduladores es más que aditivo).
• Se han obtenido mutantes regulatorios de C. glutamicum
donde la AC es resistente a la inhibición por LIS, y la
enzima homoserina deshidrogenasa se ha eliminado
genéticamente, por lo cual no se produce TRE ni MET.
• Suministrando bajos niveles de TRE se han producido
industrialmente 170 g/L de LIS y 0.54 mol LIS/mol glucosa
• Producción anual de LYS: 300,000 tons ($ US 600 millones)

Principales polisacáridos microbianos de interés comercial
Polisacárido Fuente Composición
Xantana Xanthomonas
campestris
Unidad estructural: glucosa, manosa, ác.
glucurónico (2:2:1), PM~2x106
Da. Se
produce a pH>5.0, 28°C, en quimiostato
con conds. limitadas de N
Dextrana Leuconostoc
mesenteroides
Glucosa con enlace α-1-6, ramific. 1-
3, 1-4 (5%). nSacarosa
nfructosa+dextrana PM:0.5-
1x106
Da.
Alginato Azotobacter
vinelandi
Pseudomonas
aeruginosa
Ácido gulurónico y manurónico
conectados por enlaces α-1-4 y β-1-4.
Sustituyentes acetil. 50-100,000
residuos.
Curdlano Alcaligenes
faecalis
Glucano con enlaces β-1-3
Dextránsacarasa

Xanthomonas campestris
inoculum (<0.2%)
Microbiological media
a) 1-5% carbohydrates
(glucose, sucrose, corn starch
hydrolyzates, etc.)
b) 0.05-0.1 % nitrogen
(yeast extract, peptone,
ammonium nitrate or urea)
c) Salts (0.27% NH4Cl, 0.5%
K2HPO4, 0.01% MgSO4•7H2O,
0.09% NH4NO3, etc.
Aerobic batch fermentation
(Fed & continuous culture
systems are also patented)
48 h, pH 7.0
Xanthan recovery (25-30 g/L)
(Precipitation, with isopropanol or methanol. This step also kills the culture)
Drying (vacuum or spray) and grinding
Xanthan
(12% moisture; 9-10% ash)
Fermentation process for the production of microbial xanthan

Flow diagram of the production process of microbial alginate

Principales aplicaciones de los alginatos
Área de
aplicación
Función Ejemplos
Industria de
bebidas y
alimentos
Estabilizante
Espesante
Gelificante
Estabilización de espumas
Suspensión de frutas, espesante
de salsas
Reconstitución de alimentos
Industria
farmacéutica
Estabilizante
Gelificante
Emulsiones para cosméticos
Impresiones dentales, fibras y
películas, cubiertas para tabletas.
Otros usos Espesante Tintas para impresión, inmovili-
zación de células y enzimas

Biopolímeros producidos por microorganimos con
potencial aplicación industrial
Biopolímero Características
Celulosa bacteriana Película extracelular compuesta de
(Acetobacter xylinum) microfibras de celulosa
Gelana Polímero extracelular compuesto de glucosa y
(Pseudomona elodea) rahmnosa. Geles termoreversibles. Producido
por Kelco (EUA)
PS-10 (Kelco, EUA) Polímeros de glucosa, manosa, fructosa, ác.
(Erwinia tahitica) glucurónico. Sustitutos de hidroxi-etilcelulosa
en pinturas
Emulsana Lipopolisacárido que funciona como
(Acinetobacter emulsificante
calcoaceticus)

Compuestos Aromáticos y Sabores
• La legislación trata de limitar el uso de sabores y aromas artificiales
en alimentos y bebidas.
• Aumento en el rechazo del público de alimentos (ingredientes)
química o sintéticamente producidos.
• Sabores naturales encuentran uso más amplio en alimentos; de
plantas (a menudo en cantidades pequeñas o en forma enlazada), o de
origen microbiano.
• Sabores microbianos puede venir de biosíntesis (síntesis de novo, de
células en crecimiento o de su metabolismo secundario; bajos
rendimientos) o de biotransformaciones (modificaciones específicas o
interconversiones de estructuras químicas; mayores rendimientos y
mas económicas).
• Los microorganismos o enzimas pueden producir ya sea sistemas de
sabores complejos multicomponentes o compuestos individuales de
sabor.
• El etil-butilato microbiano (sabor a frutas): $ 180/kg, sintético: $ 4/kg
(Hercules, Inc.)

Compuestos aromáticos producidos por microorganismos
Microorganismo Aroma Compuestos
Ceratocystis
moniliformis
Afrutado: plátano,
durazno, pera, rosa
3-metil butiril acetato, γ- y
δ-decalactona, geraniol,
citronelol, nerol, linalol,
geranil acetato
Mycoacia uda Afrutado: almendras,
pasto
p-metilacetofenona, p-
tolil-1-etanol
Penicillium
decumbens
Pino, rosa, manzana,
hongo
3-octenona, 1-octen-3-ol,
β-feniletanol, nerodiol
Sporobolomyces
odorus
Durazno
Trametes odorata Afrutado: miel, rosa,
anís
Metil fenil acetato, gera-
niol, nerol, citronelol
Trichoderma viride Coco 6-pentil-2-pirona

Vanillin
• Principal flavor component of vanilla, which is widely
used in flavor formulations. US $ 2,500/kg flavor solids.
• Extracted form pulped wood (vines), and also via microbial
biotransformation (also considered natural)
• Produced from eugenol or isoeugenol by Serratia, Klebsiella
or Enterobacer, with a yield of 3.8 g/L.
• Can also be obtained form callus cells of Vanilla fragrans or
V. phaeantha. Higher yields may be obtained by immobilized
culture systems with continuous removal of flavor
components; passing them through activated charcoal and
eluting with 50% ethanol. COO
OCH
3
OH
Eugenol Ferulic acid Vanillic acid Vanillin
O
O
R
O
O
R
δ-lactone γ-lactone
O
β-ionone (off flavor in oxi-
dized freeze-dried carrots)
CHO

Flavor enhancers: production of 5’ nucleotides
by enzymatic hydrolysis of RNA
Yeast (C. utilis, S. cerevisiae)
-Extraction by hot alkaline saline (5-20% NaCl, 8 h, 100°C)
-Precipitation by HCl or ethanol
-dry
RNA (70-90 %
purity) -Exonuclease P1 (Penicillium citrinum) or
-Streptomyces aureus mutant [5’ nucleotidase & phosphatase (-)]
-pH 5, 4 h, 65°C
5’GMP/5’AMP/5’CMP/5’ UMP mixture
-Remove CMP/UMP by adsorption on activated charcoal
-Elute adsorbed AMP/GMP with methanol/ammonia
5’AMP/5’GMP mixture
- Deamination of AMP by adenyl deaminase (A. oryzae)
IMP/GMP mixture
-purification by anion exchange chromatograpy
5’ IMP + 5’ GMP (1.5-3 %)

Monosodium Glutamate (MSG)
• Fermentation of glucose and sucrose as carbon and energy
sources by C. glutamicum.
• C. glutamicum accumulates α-ketoglutaric acid (AGA)
because it is uncapable of performing a complete TCA cycle.
• AGA is directed towards the production of glutamic acid
• Biotin limiting conditions leads to more production of GLU
• Limiting biotin reduces phospholipid synthesis and
membrane permeability, but it is restored by adding 0.65
mL/mL of oleic acid (18:1).
• Using Brevibacterium divaricatum, 50-60% of the C source is
converted to GLU, at pH 7.8, 38°C, in a fed batch process,
after 30-35 h, with a yield of 100 g/L.

Síntesis de Aminoácidos y ciclo de Krebs

Flavor enhancers
• 5’ GMP + 5’ IMP: their maximum influence in savory
flavor is on fish and vegetable proteins. Less effect on
meats, cereals, milk, eggs.
• MSG: Most profound influence on: meat, followed by fish,
vegetables, cereals, egg, milk.
• UMAMI compounds have a most pronounced effect on
chicken, and weaker enhancement on beef, turkey and
pork
• Savory ingredients market: $ US 1 billion/year. HVP,
Autolyzed yeast extract, soya bean sauce, MSG, I+G.

Clasificación de los colorantes
I. Naturales
1.- Orgánicos
a) Vegetales: Antocianinas, betalaínas, carotenoides,
flavonoides, clorofila, otros
b) Animales: Acido carmínico (de grana cochinilla), ácido
kermésico (obtenido de las hembras fecundadas de los insectos Kermes ilicis
L. y Kermes vermilio Planchón, parásitos de la encina (Quercus ilex L.) y de la
coscoja (Quercus coccifera L.), respectivamente), otros
2.- Inorgánicos
a) Minerales: Azul ultravioleta, dióxido de titanio,
negro carbón
II. Sintéticos
1.- Orgánicos: Azoicos, antraquinonas, difenilmetano, otros

Pigmentos alimenticios de origen natural
Componente Fuente
Tetrapyrroles
Clorofilas Vegetales verdes, de hoja
Grupos Hemo Carnes
Carotenoides
Caroteno Zanahorias (β-caroteno), tomates (licopeno),
Xantofilas Chiles del género Capsicum (capsantina),
salmon (astaxantina), zempasúchitl (luteína)
Benzopiranos
Antocianinas Uvas (enocianina), bayas, manzanas
Flavonas y flavanonas Nueces, piel de cebolla, té
Betalaínas
Betacianina Betabel
Betaxantinas Betabel
Pigmentos derivados de Procesos
Caramelo Miel, jarabes, refresco de cola, licores
Melanoides Jarabes

Producción de monascina por diferentes técnicas
Cepa Condiciones de cultivo
Cultivo Sumergido
Monascus anka Polvo de arroz 3%; MgSO4•7H2O 0.1%,
KNO30.15%, KH2PO4 0.25%, 96 h a 30°C
M. kaolinus S-11 Idem, 72 h a 35°C
M. anka V-204 Polvo de arroz 5%, Glutamato monosódico
0.15%, MgSO4•7H2O 0.1%, KH2PO4
0.25%, 144 h a 30°C
Cultivo sólido
M. anka Polvo de arroz 168 h, 30-40°C
M. anka Harina de pan, 192 h, 32°C
M. kaoliang R 10847 Harina de Mantou 144 h, 32°C

Historia de los procesos de hidrólisis para la obtención de glucosa
Epoca Materia prima
(almidón 30-45% materia seca)
Hasta 1950’s Acidificación (HCl, pH 1.5). Hidrólisis (T=150°C).
ED= función del tiempo de hidrólisis.
Con 45 min: ED =90 con 86% glucosa
Hasta 1960’s Acidificación (HCl, pH 1.5). Hidrólisis (5-10’ T=150°C;
ED= 12-20). Reacción con amiloglucosidasa (pH=4-4.5,
T=60°C, 48-100 h. J. gluc: ED=96-98 (92-96% glucosa)
Entre 1960’s y 70’s Licuefacción con α-amilasa (pH5.5-7.0, T=70-90°C),
ED=20-30. Sacarificación con amiloglucosidasa (pH=4-
4.5; T=60°C, 48-100 h). J. de gluc: ED=96-98 (92-96%
glucosa.
Después de 70’s Licuefacción α-amilasa termorresistente (6’ a 105°C, 2 h
a 95°C), ED=8-12. Sacarificación con amiloglucosidasa
(pH=4-4.5; T=60°C, 48-100 h). J de gluc: ED=96-98
(92-96% glucosa)

Almidón
H2O
Enzimas
(10%)
CaCl2
Bomba de desplaza-
miento positivo
Enzima
(90%)
atmósfera
Cocedor jet
(140°C, 30 s)
Vapor
90-95°C, 2 h
ED = 8-15
Sistema de licuefacción con α-amilasa
termorresistente

Process flowchart
for dextrose production
Glucoamilasa de A. niger o
Rhizopus. El proceso puede ser por
lotes o continuo.
El rendimiento de glucosa de una
suspensión de almidón (32-35 %
p/p ) es 95-96%.
El rendimiento puede aumentarse
por sacarificación a 10-12 % (p/p)
de sólidos y usando pululanasa,
resultando en aumentos del 0.5-1%
En 1998: dextrosa anhidra $
1.12/kg; dextrosa monohidrato $
0.51/kg; jarabe de maíz $ 0.21 /kg
(50-55% solids)

Jarabe de maíz de alta fructosa (HFCS)
• La conversión enzimática de glucosa a fructosa se reportó en 1957 y fue
patentada en 1960 por la compañía CPC (USA)
• Un desarrollo Japonés usando GI de Streptomyces logró la primera
producción comercial de HFCS en 1967 en USA (por lotes).
• Los problemas que evitaban su competencia con sacarosa y azúcar invertido
incluyeron
- Alto costo de la enzima
- Formación de productos coloreados
- Producción de azúcar no metabolizable (D-psicosa)
- Inhibición enzimática por minerales (Ca2+
)
• La GI inmovilizada re-utilizable permitió una producción continua en 1972
• Este fue el primer uso a escala industrial de enzimas inmovilizadas, cuyas
características son (40-50 %w/w) :
- Reducción significativa de costos de producción
- Costos competitivos con la producción de sacarosa

(30-40% dry solid;
pH 6-6.5)
α-amylase
Ca2+
(100-200 ppm) DE=94-98; 31% TS
60°C, pH 7.0, de-aerationMg2+
activator
Separation
C treatment
(87% glucose, 5% F)
70-85% TS
Resina fuertemente
ácida cationica, Ca2+
,
retrasa fructosa y no
retiene DP>3-4

HFCS
 La producción anual global de HFCS es 10 millones de tons,
en base seca (1999).
 Para esto se utilizan 1500 tons de GI inmovilizada (GII;
1999)
 Los mayores productores de GII son Genencor (Danisco) y
Novo.
 La GII de Genencor se produce por adsorción de la enzima
purificada en resinas de intercambio iónico, reticulada con
polietilénimina y glutaraldehído, y granulada por extrusión.
 La productividad es de 12-15 tons de HFCS (bs)/kg GII, con
t½=1900-3600 h.
 La GII de Novo (Sweetzyme T) se prepara por reticulación de
células de Streptomyces murinus con glutaraldehído, seguido
de extrusión
 Se usa en biorreactores de 1.5 m(d)x5 m(h) a 60-65°C, pH
7.5-8.5 (1 h reacción; 0.5 tons/día) para producir jarabe con
42% de fructosa, que por fraccionamiento se convierte a 55%
de fructosa.

Catalizadores formulados con Glucosa Isomerasa
Compañía Actividad
(IGIU/g)*
Catalizador t1/2
&
(hrs)
Miles (Taka-
sweet)
171 Células de Flavobacterium
aborescens, extruidas y reticuladas
1800
Gist-Brocades 675
(MGIU/L)
Enzima de Streptomyces
missouriensis en gelatina
reticulada con glutaraldehído
1500
CPC Int. Inc. 1487 Enzima en DEAE-celulosa
Novo A/S 200 Células de B. coagulans
entrecruzadas
1500
Finnsugar
(Spezyme, IGI)
Enzima de Streptomyces
Rubiginosus en DEAE celulosa y
poliestireno con TiO2
1200
*IGIU: Cantidad de enzima que produce un mol de fructosa por minuto
&
Tiempo de vida media, bajo condiciones óptimas de reacción.

Ácido Cítrico
• Su producción rebasa las 3x105
tons/año
• Pfizer tiene la mayor planta con capacidad mayor a 8x104
tons/año
• 70% es consumido por industria de alimentos y bebidas,
donde representa el 55-65% del total de acidulantes
• 18% se dirige a industria farmacéutica
• Se produce por Aspergillus y Penicillium, aunque también
levaduras y bacterias pueden acumular ác. cítrico a partir de
glucosa en un menor tiempo de fermentación.
• Su producción requiere de una operación defectuosa del
CAT y su transporte fuera de la célula.

Degradación de glucosa a ácido cítrico a través de
glicólisis y ciclo de los ácidos tricarboxílicos

Producción de ácido cítrico (AC)
• Todas las reacciones del CAT excepto la condensación del
AC cítrico son reversibles.
• Se bloquea la transformación del AC reduciendo a un
mínimo la presencia de iones fierro (cofactor de aconitasa)
• Se interrumpe entonces la formación de los demás
intermediarios esenciales en biosíntesis, por lo cual se
requieren reacciones adicionales llamadas anapleróticas ó
de reabastecimiento que regeneren los intermediarios del
CAT, aprovechando la reversibilidad del ciclo
• Tres reacciones anapleróticas pueden ocurrir

Reacciones
Anapleróticas
del ciclo de
Krebs (CAT)

• La única reacción anaplerótica comprobada en A. niger es la
carboxilación del piruvato, permitiendo la fijación del CO2
removido de piruvato durante su descarboxilación a acetil-CoA
• A partir de glucosa se han tenido rendimientos de 70-90%
(w/w), con el máximo teórico de 112%.
• La participación del ciclo del glioxilato durante la
fermentación cítrica de A. niger es controvertida y solo se ha
comprobado en levaduras.
• Para evitar esta reacción:
Oxalacetato oxalacetato hidrolasa oxalato + acetato
Se conduce la reacción a pH 3.5, al cual ésta enzima no actúa
• Los altos niveles de AC inhiben la fosfofructocinasa, la cual se
protege en presencia de iones NH4
+
a concentraciones
superiores a las fisiológicas

• La deficiencia de Mn2+
permite la acumulación de iones NH4
+
,
modificándose la síntesis normal de lípidos
• La consecuencia de esto es la presencia de membranas celulares
defectuosas con mayor permeabilidad al AC, así como un mayor
flujo de C hacia el AC como resultado de la disminución de lípidos
en los componentes celulares
• Cuando se usan levaduras para producir AC, la fermentación es
independiente de Mn2+,
requieren de un pH menos ácido (4.5-6.5),
requieren de tiamina y se acumula AC en condiciones de limitación
de N
Aspectos Nutricionales
• La producción de AC está relacionada inversamente con el
crecimiento celular
• Los carbohidratos deben ser simples : melaza (14-240 g/L); N: sales
de amonio (0.1-0.4 g/L); 0.1-0.2% de fosfato, Fe2+
y Mn2+
en bajos
niveles, por lo que se debe remover el Fe de las melazas (EDTA,
polietilenamina).
Aspectos Fisicoquímicos
• Temperatura de 25-30°C, ya que a T mayor se acumula ác. oxálico
• pH inicial 3.5-4.5, pero se mantiene en 2 durante la etapa productiva

Cinética de la
fermentación para
producir ácido
cítrico por A.
niger.
La fermentación
es sumergida,
aeróbica en
grandes biorreac-
tores de acero
inox. en un medio
deficiente en
hierro.

Diagrama simplificado del proceso de producción de ácido
cítrico por cultivo sumergido a partir de melazas
4

Microorganismos usados para elaborar productos valiosos
en la industria de alimentos

Gene encoding
protein of interest
Expression vector
Sequence encoding
6 His in frame with
cloned ORF
Clone producing His-tagged protein
Ni Affinity
Column
Tagging Proteins for Affinity
Purification

Affinity
Chromatography
Ni Column
Crude
Extract
Eluent-
Competes for
Ni Matrix
Pure
Protein
Clone producing
His-tagged protein
of Interest

PAGE Results of a
Protein Purification

Separación de DNA por
Electroforesis en Gel
Propósitos
• Herramienta analítica
- Identifcar o conocer algo acerca de un fragmento
particular de DNA: tamaño, topología, patrón de
restricción, pureza, concentración
• Herramienta Preparativa
- Separar un fragmento de interés de una mezcla
compleja de fragmentos de DNA.

El Gel Tamiza las Moléculas -
Pequeñas Moléculas Migran más Rápido
+
-
Tiempo
DNA de Alto PM,
incremento en la
fricción
DNA de bajo PM,
disminución en la
fricción

• Moléculas cargadas se moverán en un campo
eléctrico
• Se usa una matriz de gel para “tamizar” las
moléculas
– Agarosa – floja; amplio rango de separación
– Acrilamida – más apretada; estrecho rango de
separación
• El movimiento a través del gel depende de la carga
y forma – NO de la masa
• Para que el movimiento sea proporcional a la masa
(PM) la molécula debe tener un relación
carga/masa constante.

• El DNA tiene 2 cargas negativas (fosfato
diésteres) por par de bases
• Todas las moléculas lineales de doble tira
del DNA tienen (esencialmente) la misma
forma
• Por tanto – el movimiento es proporcional a
la longitud (MW)
– Distancia ∝ 1 / log (MW)

+
A B C D E
DNA cargado en pozos
Movimiento
de fragmentos
de DNA
Gel Electrophoresis

NH3
+
H3N+
Bromuro de Etidio
Colorante para visualizar DNA
Absorbe a ~520nm
Fluoresce a 605nm
(Fluoresce naranja
bajo luz UV)
Fluorescencuia se
incrementa por
enlace al DNA

Bromuro de Etidio Intercalado
en la hélice del DNA

Análisis de
Restricción
ApaI
XbaI
KpnI
XhoI
Marker
48
33
25
17
10

Información de Electroforesis en Gel
• Tamaño
– Distancia migrada es
inversamente
proporcional al logPM (o
log(# pb).
• Cantidad
- Enlace del etidio es
directamente
proporcional a la
MASA del DNA

1011
Molecules x 10 Kb
= 1012
Kb
= ~100 ng
2x1011
Molecules x 5 Kb
= 1012
Kb
= ~100 ng
1012
Molecules x 1 Kb
= 1012
Kb
= ~100 ng
Quantitation of DNA by Ethidium Bromide
Staining
10 Kb
5 Kb
1 Kb
Marker DNA -
Known size
and quantity

Clicker Question
• You have purified your favorite plasmid
from a strain of E. coli. You run an
agarose gel with a standard of known
concentration to quantitate the DNA. But
what about protein contamination?
• Does the presence of contaminating
protein interfere with this procedure?
A.Yes
B.No

La Densidad de la Matriz Define
la Resolución del Gel
Porcentaje de Agarose

Resolución de moléculas
muy grandes de DNA por
Electroforesis en Gel de
Campo Pulsante
180 KiloBP
90 KiloBP
45 KiloBP
El campo eléctrico se
reorienta constantemente
mientras se corre el gel.
Consecuentemente, las
moléculas de DNA
tienen que reorientarse.
Pequeños fragmentos se
reorientan más
fácilmente.

Transferir DNA
a membrane
Añadir fragmento de DNA
etiquetado e hibridizar
Digerir muestra de DNA
Con enzimes de restricción
Electroforesis
Southern Blot
Inventado por E. Southern
Oxford University

Strain 1
EcoRI EcoRI
EcoRI EcoRI
Probe
x
xStrain 2
AGGCATTAG5’ -3’
TTTAACGCG5’ -3’
CCGGCTAAC5’ -3’
“sonda” etiquetada
se hibrida a la
secuencia
complementaria
TCCGTAATC****3’- -5’
TCCGTAATC****3’- -5’

Premio Nobel Química 2006
• Roger D. Kornberg, a structural biologist at Stanford University, has been
awarded the 2006 Nobel Prize in Chemistry for his studies on the molecular basis
of eukaryotic transcription, the process by which the genetic code of DNA is
converted into messenger RNA for later translation into proteins.
• Kornberg has used the yeast Saccharomyces cerevisiae as a model
eukaryotic organism. He developed an in vitro yeast transcription system
that contained highly purified RNA polymerase II and five helper proteins
known as general transcription factors. However, the system did not
respond to the addition of other transcription factors known to activate
specific genes in cells. This observation led Kornberg to discover a
protein complex known as Mediator, which serves to transfer signals from
gene-specific transcription factors to RNA polymerase II and the general
transcription factors.

Mighty Machine In this ribbon structure of
part of the yeast RNA polymerase II complex,
the clamp protein (yellow) closes on the DNA
(blue and green) and growing RNA transcript
(red). The bridge helix is shown in green and
the complex's active site magnesium ion is
shown in pink.
In 2001, Kornberg and his colleagues published high-resolution X-ray crystal
structures of a 10-subunit yeast RNA polymerase and of a complex consisting of
RNA polymerase, template DNA, and product RNA (Science 2001, 292, 1863
and 1876).
These structures showed that the two largest subunits of RNA polymerase lie in
the center on either side of a nucleic acid-binding cleft, with the smaller subunits
on the outside. The cleft is bridged by an α-helix that acts like a ratchet to move
the growing RNA transcript out of the active site during RNA synthesis.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Es un método para la amplificación rápida de DNA in vitro que
produce grandes cantidades de genes específicos para clonar,
secuenciar o para propósitos de mutagénesis
Se requiere conocer una parte de la secuencia nucleotídica del
gen que se desee amplificar, éstos son los iniciadores, a partir de
los cuales se sintetiza la hebra complementaria por la DNA
polimerasa (Thermus aquaticus [Taq] polimerasa)
1. Dos oligonucleótidos (degenerados o no) iniciadores en los
extremos del DNA blanco se fabrican en un aparato de síntesis
de oligonucleótidos y se añaden en mucho exceso al DNA blanco
desnaturalizado por calor
2. Cuando se enfría la mezcla, se asegura que el exceso de
iniciadores (primers), relativos al DNA blanco, se hibridicen a
las hebras separadas con los iniciadores y no entre ellas
(alineamiento)

3. La DNA polimerasa extiende los iniciadores usando las hebras
blanco como plantilla
4. Después de un tiempo adecuado de incubación, la mezcla se
vuelve a calentar para separar las tiras, y se continúa con este ciclo
unas 20-30 veces (calentamiento, alineación, extensión)
 Los productos de extensión de un iniciador, pueden servir como
plantilla para otro iniciador en el siguiente ciclo
 Cada ciclo ( aprox. 5 min) involucra:
1. Desnaturalización por calor 93°C, 5 min (después de 1er
ciclo: 1 min)
2. Enfriamiento para alineamiento de iniciadores 45°C, 1 min
3. Extensión de iniciadores 70°C, 1 min. Después del último ciclo se
deja 10 min para finalizar las extensiones
 En cada ciclo se duplica el contenido del DNA blanco original,
obteniéndose en 20-30 ciclos aumentos en 106
-109
de la secuencia
blanco

PCR para amplificar secuencias de DNA.
(a) calentamiento del DNA blanco y exceso
de dos iniciadores, uno complementario de
una tira y el otro de la tira complementaria,
más DNA polimerasa. (b) alineamiento y
extensión, originándose dos tiras hijas. (c)
nuevo ciclo. (d) 2a copia de DNA. (f)
Efecto de 20 ciclos PCR en un DNA blanco
conteniendo 10 copias inicialmente (la
gráfica es semilog)

 La Taq polimerasa no tiene función correctora, por lo cual
comete errores en la extensión
 Cuando la exactitud es crucial, puede usarse la DNA
polimerasa del arqueano Pyrococcus furiosus (Top=100°C;
Pfu), ya que tiene actividad correctora
 La amplificación in vivo tomaría varios días, por lo cual los
termocicladores son muy útiles.
 La DNA polimerasa termoestable se ha clonado en E. coli y
se produce en grandes cantidades
 El PCR es muy útil en la clonación de DNA porque si se
conoce la secuencia en sus extremos puede amplificarse
antes de clonar
 Como herramienta para la secuenciación de DNA, el PCR
produce grandes cantidades de DNA que pueden usarse
como plantillas

 El PCR puede producir grandes cantidades de DNA mutado
 Usando oligonucleótidos con algunas bases que no se
hibridizarán como iniciadores, pueden introducirse
mutaciones. Los mutantes puede entonces amplificarse por
PCR
 El DNA mutado puede usarse para transformar células,
formando derivados mutantes
 El PCR puede usarse para estudios comparativos ó
evolucionarios, amplificando genes de diferentes fuentes,
donde el DNA ya se ha clonado y secuenciado, usando
iniciadores que no sean perfectamente complementarios, pero
que sean regiones altamente conservadas
 Con los iniciadores adecuados, puede identificarse una sola
célula bacteriana, en presencia de otras, en una muestra
 Puede usarse para identificación de individuos (huellas
dactilares de DNA)

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