Este documento describe un método para determinar cuantitativamente el colesterol LDL (LDLc) en suero sin necesidad de centrifugación. El método implica dos pasos: 1) eliminación de lipoproteínas no-LDL y 2) medición del LDLc restante. Los niveles elevados de LDLc son un factor de riesgo cardiovascular importante. El documento también proporciona detalles sobre los reactivos, procedimiento, control de calidad y características del método.
SEGUNDA Y TERCERA SEMANA DEL DESARROLLO EMBRIONARIO.pptx
LDL (spinreact)
1. Colesterol LDL
Enzimático colorimétrico. Liquido
BSIS51 Ed.2006 SPINREACT,S.A.U. Ctra.Santa Coloma, 7 E-17176 SANT ESTEVE DE BAS (GI) SPAIN
Tel. +34 972 69 08 00 Fax +34 972 69 00 99. e-mail: spinreact@spinreact.com
LDLc -D
Determinación cuantitativa de colesterol LDL
IVD
Conservar a 2-8ºC
PRINCIPIO DEL METODO
Determinación directa del LDLc (colesterol de lipoproteínas de baja
densidad) sin necesidad de pre-tratamiento o centrifugado de la muestra.
La determinación se realiza en dos pasos:
1º Eliminación de lipoproteínas no-LDL
Ésteres colesterol
CHE
Colesterol + Ácidos grasos
Colesterol + O2
CHOD
4-Colestenona + H2
O2
2 H2
O2
Catalasa
2H2
O + O2
2º Medición de LDLc
Ésteres colesterol
CHE
Colesterol + Ácidos grasos
Colesterol + O2
CHOD
4-Colestenona + H2
O2
2 H2
O2
+ TODS + 4-AA
POD
Quinonimina + 4H2
O
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de
LDLc presente en la muestra ensayada.
SIGNIFICADO CLINICO
Las partículas de LDLc son lipoproteínas que transportan el colesterol a
las células. Niveles elevados de colesterol LDL son un factor de riesgo de
desarrollo de enfermedades cardiovasculares, a menudo se le denomina
“colesterol malo”. Niveles altos de colesterol LDL están relacionados con
obesidad, diabetes y nefrosis1,5,6
.
El diagnostico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos
clínicos y de laboratorio.
REACTIVOS
R 1
Enzimas
GOOD pH 7,0 (20ºC)
Colesterol esterasa (CHE)
Colesterol oxidasa (CHOD)
Catalasa
N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3,5-
dimetoxianilina (TODS)
50 mmol/L
380 U/L
380 U/L
400 U/mL
0,45 mmol/L
R 2
Enzimas
GOOD pH 7,0
4 – Aminoantipirina (4-AA)
Peroxidasa (POD)
50 mmol/L
1,00 mmol/L
1000 U/L
HDLc/LDLc CAL Patrón. Suero humano liofilizado
PRECAUCIONES
HDLc/LDLc CAL: Todos los componentes de origen humano han resultado ser
negativos para el antígeno HBs, HCV y para el anti-HIV (1/2). Sin embargo,
deben tratarse con precaución como potencialmente infecciosos.
PREPARACION
R 1 y R 2: Listos para su uso.
HDLc/LDLc CAL: Reconstituir el contenido de un vial con 1 mL de agua
destilada. Tapar el vial y mezclar suavemente hasta disolver su contenido.
CONSERVACION Y ESTABILIDAD
Todos los componentes del kit son estables hasta la fecha de caducidad
indicada en la etiqueta del vial, cuando se mantienen los viales bien
cerrados a 2-8ºC, protegidos de la luz y se evita la contaminación.
R 1 y R 2: Una vez abiertos son estables 4 semanas a 2-8ºC.
HDLc/LDLc CAL: Una vez reconstituido es estable 1 semana a 2-8ºC o 5
semanas a –20ºC. No usar reactivos fuera de la fecha indicada.
Indicadores de deterioro de los reactivos:
- Presencia de partículas y turbidez.
MATERIAL ADICIONAL
- Espectrofotómetro o analizador para lecturas a 600 nm.
- Cubetas de 1,0 cm de paso de luz.
- Equipamiento habitual de laboratorio.
MUESTRAS
Suero1
: Procesar la muestra sin demora. Evitar la congelación y
descongelación repetida de la muestra.
Estabilidad: 7 dias a 2-8ºC.
PROCEDIMIENTO
1. Condiciones del ensayo:
Longitud de onda: . . .. . . . . . . . . .. .600 (590-700) nm
Cubeta:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 cm paso de luz
Temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37ºC
2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada.
3. Pipetear en tubos de ensayo:
Blanco Patrón Muestra
R 1 ( L) 300 300 300
Patrón ( L) -- 4 --
Muestra ( L) -- -- 4
4. Mezclar e incubar 5 min a 37ºC
5. Añadir:
R 2 ( L) 100 100 100
6. Mezclar e incubar 5 minutos a 37ºC.
7. Leer la absorbancia (A), frente al Blanco de reactivo.
CALCULOS
Patrón)A(
Muestra)A(
x Conc. Patrón = mg/dL de LDL colesterol en la muestra
Factor de conversión: mg/dL x 0.02586 = mmol/L
CONTROL DE CALIDAD
Es conveniente analizar junto con las muestras sueros control valorados:
SPINTROL H Normal y Patológico (Ref. 1002120 y 1002210)
Si los valores hallados se encuentran fuera del rango de tolerancia, se debe
revisar los instrumentos, los reactivos y la calibración.
Cada laboratorio debe disponer su propio Control de Calidad y establecer
correcciones en el caso de que los controles no cumplan con las tolerancias.
VALORES DE REFERENCIA1,5,6
Nivel de riesgo
Bajo < 100 mg/dL
Medio 130-160 mg/dL
Alto > 160 mg/dL
Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio
establezca sus propios valores de referencia.
CARACTERISTICAS DEL METODO
Rango de medida: Desde el limite de detección 3,7 mg/dL hasta el limite de
linealidad 1000 mg/dL. Si la concentración de la muestra es superior al limite de
linealidad, diluir 1/2 con ClNa 9 g/L y multiplicar el resultado final por 2.
Precisión:
Intraserie (n= 10) Interserie (n= 10)
Media (mg/dL) 63,2 107 49,0 65,2 112 253
SD 0,64 1,89 0,79 0,3 0,7 1,7
CV (%) 1,01 1,76 1,61 0,45 0,60 0,65
Sensibilidad analítica: 1 mg/dL = 0.0012A
Comparación con otros métodos: Los reactivos de SPINREACT (y) no muestran
diferencias sistemáticas significativas cuando se comparan con otros reactivos
comerciales (x).
Los resultados obtenidos con 92 muestras fueron los siguientes:
Coeficiente de regresión (r): 0,998.
Ecuación de la recta de regresión: y= 4,6 + 0,940 x.
Las características del método pueden variar según el analizador utilizado.
INTERFERENCIAS
No interfieren concentraciones de ácido ascórbico hasta 50 mg/dL, hemoglobina
hasta 500 mg/dL y bilirrubina hasta 30 mg/dL,
Se han descrito varias drogas y otras substancias que interfieren en la
determinación del Colesterol LDL3,4
.
NOTAS
SPINREACT dispone de instrucciones detalladas para la aplicación de este
reactivo en distintos analizadores.
BIBLIOGRAFIA
1. Kaplan A et al. Lipoproteins. Clin Chem The C.V. Mosby Co. St Louis. Toronto.
Princeton 1984; 574-577.
2. Okada M. et al. Low-density lipoprotein cholesterol can be chemically measured
J. Lab. Clin. Mad., 1998; 132, 195-201.
3. Young DS. Effects of drugs on Clinical Lab. Tests, 4th ed AACC Press, 1995.
4. Young DS. Effects of disease on Clinical Lab. Tests, 4th ed AACC 2001.
5. Burtis A et al. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd ed AACC 1999.
6. Tietz N W et al. Clinical Guide to Laboratory Tests, 3rd ed AACC 1995.
PRESENTACION
Ref: 41023 R 1
R 2
HDLc/LDLc CAL
1 x 30 mL
1 x 10 mL
1 x 1 mL
Cont.
2. Cholesterol LDL
Enzymatic colorimetric. Liquid
BSIS51 Ed.2007 SPINREACT,S.A.U. Ctra.Santa Coloma, 7 E-17176 SANT ESTEVE DE BAS (GI) SPAIN
Tel. +34 972 69 08 00 Fax +34 972 69 00 99. e-mail: spinreact@spinreact.com
LDLc -D
Quantitative determination of LDL cholesterol
IVD
Store at 2-8ºC
PRINCIPLE OF THE METHOD
Direct determination of serum LDLc (low-density lipoprotein cholesterol)
levels without the need for any pre-treatment or centrifugation steps.
The assay takes place in two steps.
1º Elimination of lipoprotein no-LDL
Cholesterol esters
CHE
Cholesterol + Fatty acids
Cholesterol + O2
CHOD
4-Cholestenone + H2
O2
2 H2
O2
Catalase
2H2
O + O2
2º Measurement of LDLc
Cholesterol esters
CHE
Cholesterol + Fatty acids
Cholesterol + O2
CHOD
4-Cholestenone + H2
O2
2 H2
O2
+ TODS + 4-AA
POD
Quinonimine + 4H2
O
The intensity of the color formed is proportional to the LDLc concentration
in the sample.
CLINICAL SIGNIFICANCE
The LDLc particle is lipoproteins that transport cholesterol to the cells.
Often called “bad cholesterol” because high levels are risk factor for
coronary heart disease and are associated with obesity, diabetes and
nephrosis 1,5,6
.
Clinical diagnosis should not be made on a single test result; it should
integrate clinical and other laboratory data.
REAGENTS
R 1
Enzymes
GOOD pH 7.0 (20ºC)
Cholesterol esterase (CHE)
Cholesterol oxidase (CHOD)
Catalase
N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-
dimethoxyaniline (TODS)
50 mmol/L
380 U/L
380 U/L
400 U/mL
0.45 mmol/L
R 2
Enzymes
GOOD pH 7.0
4 – Aminoantipyrine (4-AA)
Peroxidase (POD)
50 mmol/L
1.00 mmol/L
1000 U/L
HDLc/LDLc CAL Standard. Lyophilized human serum
PRECAUTIONS
HDLc/LDLc CAL: Components from human origin have been tested and found
to be negative for the presence of HBsAg, HCV, and antibody to HIV (1/2).
However handle cautiously as potentially infectious.
PREPARATION
- R 1 and R 2: Are ready to use.
- HDLc/LDLc CAL: Dissolve the contents with 1 mL of distilled water. Cap
vial and mix gently to dissolve contents.
STORAGE AND STABILITY
All the components of the kit are stable until the expiration date on the
label when stored tightly closed at 2-8ºC and contaminations are
prevented during their use.
- R 1 and R 2: Once opened is stable 4 weeks at 2-8ºC.
- HDLc/LDLc CAL: Once reconstitute 1 week at 2-8ºC or 5 weeks –20ºC.
Do not use reagents over the expiration date.
Signs of reagent deterioration:
- Presence of particles and turbidity.
ADDITIONAL EQUIPMENT
- Spectrophotometer or colorimeter measuring at 600 nm.
- Matched cuvettes 1.0 cm light path.
- General laboratory equipment.
SAMPLES
Serum 1
: After sampling, the test should be performed without delay.
Repeated freezing and thawing should be avoided.
Stability of the sample: 7 days at 2-8ºC .
PROCEDURE
1. Assay conditions:
Wavelength: . . . . . . . . . . . . . .. . . 600 (590-700) nm
Cuvette: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . .1 cm. light path
Temperature . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37ºC
2. Adjust the instrument to zero with distilled water.
3. Pipette into a cuvette:
Blank Standard Sample
R 1 ( L) 300 300 300
Standard ( L) -- 4 --
Sample ( L) -- -- 4
4. Mix and incubate for 5 min. at 37ºC.
5. Add:
R 2 ( L) 100 100 100
6. Mix and incubate for 5 min. at 37ºC.
7. Read the absorbance (A), against the Blank.
CALCULATIONS
dardtanS)A(
Sample)A(
x Standard.conc. = mg/dL of LDLc in the sample
Conversion factor: mg/dL x 0.02586 = mmol/L
QUALITY CONTROL
Control sera are recommended to monitor the performance of assay procedures:
SPINTROL H Normal and Pathologic (Ref. 1002120 and 1002210).
If control values are found outside the defined range, check the instrument,
reagents and calibrator for problems.
Each laboratory should establish its own Quality Control scheme and corrective
actions if controls do not meet the acceptable tolerances.
REFERENCE VALUES1,5,6
Levels of the risk
Desirable < 100 mg/dL
Medium 130-160 mg/dL
High > 160 mg/dL
These values are for orientation purpose; each laboratory should establish its
own reference range.
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
Measuring range: From detection limit of 3,7 mg/dL to linearity limit of 1000
mg/dL.
If the results obtained were greater than linearity limit, dilute the sample 1/2 with
NaCl 9 g/L and multiply the result by 2.
Precision:
Intra-assay Inter-assay
Mean (mg/dL) 63.2 107 49.0 65.2 112 253
SD 0.64 1.89 0.79 0.3 0.7 1.7
CV 1.01 1.76 1.61 0.45 0.60 0.65
Sensitivity: 1 mg/dL = 0.0012A
Accuracy: Results obtained using SPINREACT reagents (y) did not show
systematic differences when compared with other commercial reagents (x).
The results obtained using 92 samples were the following:
Correlation coefficient (r): 0.998.
Regression equation: y= 4.6 + 0.940 x.
The results of the performance characteristics depend on the analyzer used.
INTERFERENCES
No interferences were observed with ascorbic acid up to 50 mg/dL, hemoglobin
up to 500 mg/dL or bilirubin up to 30 mg/dL.
A list of drugs and other interfering substances with LDL cholesterol
determination has been reported by Young et. al3,4
.
NOTES
SPINREACT has instruction sheets for several automatic analyzers.
Instructions for many of them are available on request.
BIBLIOGRAPHY
1. Kaplan A et al. Lipoprotein. Clin Chem The C.V. Mosby Co. St Louis.
2. Okada M. et al. Low-density lipoprotein cholesterol can be chemically measured
J. Lab. Clin. Mad., 1998; 132, 195-201.
3. Young DS. Effects of drugs on Clinical Lab. Tests, 4th ed AACC Press, 1995.
4. Young DS. Effects of disease on Clinical Lab. Tests, 4th ed AACC 2001.
5. Burtis A et al. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd ed AACC 1999.
6. Tietz N W et al. Clinical Guide to Laboratory Tests, 3rd ed AACC 1995.
PACKAGING
Ref: 41023 R 1
R 2
HDLc/LDLc CAL
1 x 30 mL
1 x 10 mL
1 x 1 mL
Cont.