20131129 FFF Genética y Genómica_Daniel Ramón

1. º
GENÉTICA Y GENÓMICA
Herramientas para el desarrollo de nuevos alimentos
Daniel Ramón Vidal

2. Genética y genómica
1. El pasado: genética en alimentación
2. El presente: la genómica y los modelos
3. ¿Cómo usar estas técnicas?

3. Genética y genómica
1. El pasado: genética en alimentación
2. El presente: la genómica y los modelos
3. ¿Cómo usar estas técnicas?

4. Historia de la agricultura

5. ¿Cómo se han mejorado las especies?
MUTACIÓN
CRUCE SEXUAL

6. Brócolis, coles y coliflores
Repollo
Coliflor
Yema
terminal
Coliflor
Col
Yema floral
Coles de
Bruselas
Ancestro
Flores y
tallos
Yema
lateral
Hojas
Tallos
Colrabi
Col de
Bruselas
Brócoli
Cale

7. Pomelos “naturales”
Naranja dulce
Pomelos
ancestrales
Pomelo Hudson
Pummelo
Pomelo Star Ruby

8. Gallinas mejoradas genéticamente

9. Y también transgénicos

10. ¿Va a ir a más?

11. El proyecto Genoma Humano
•
Desde el año 2001 disponemos de la secuencia
completa del genoma humano que está
compuesta por unos 23000 genes; sólo
conocemos la funcionalidad de la mitad
•
Costó 3000 millones de dólares y casi diez años
de trabajo de más de 1000 científicos
•
En muchos casos ya conocemos que genes de
nuestro
genoma
se
relacionan
con
metabolopatías
con
posible
prevención
nutricional o con las sensaciones organolépticas

12. El uso indirecto de la genética y la genómica
• Los ratones mutantes ob/ob que no
producen leptina son obesos; lo
mismo pasa con los ratones mutantes
db/db o las ratas mutantes fa/fa que
son defectivas en el receptor de
leptina
• En humanos hay genes equivalentes
• En humanos se han descrito defectos
congénitos en la vía de leptina que se
asocian a una obesidad mórbida
temprana
• En el genoma humano ya se han
identificado más de 300 genes
relacionados con obesidad

13. Genética y genómica
1. El pasado: genética en alimentación
2. El presente: la genómica y los modelos
3. ¿Cómo usar estas técnicas?

14. ¿Hacia donde va la secuenciación masiva?
• A fecha de hoy ya se han
secuenciado completamente 7407
genomas de distintos animales,
plantas y microorganismos
• Hay otros 25406 genomas en
proceso de secuenciación
• Entre
otros
de
interés
agroalimentario se han secuenciado
los genomas del arroz, el maíz, el
trigo, la judía, la uva, el tomate, el
cacao, la levadura panadera o
algunas bacterias lácticas

15. Las plataformas de secuenciación masiva
2001
2013
10 años
3000 millones $
1000 científicos
3 semanas
4000 €
1 técnico FP

16. El futuro genómico
2014 Q4
9 minutos
100 $
Sin personal

17. Las otras tecnologías “ómicas”

18. La genómica comparativa
12 Mb
5770 genes
100.2 Mb
21733 genes
3000 Mb
23000 genes

19. Organismos modelo: Caenorhabditis elegans
• Fácil de usar en el laboratorio, tamaño
pequeño
• Ciclo de vida corto
• Disponibilidad
de
herramientas
genéticas (clásicas y moleculares)
• Buena colección de mutantes
• Genoma secuenciado y bien anotado
• Alto porcentaje de homología con el
genoma humano

20. La apuesta de Biopolis SL
Bioquímica
Cultivos celulares
Genómica
Microbiología
Organismos modelo
Biología molecular
Escalado
Metabolómica
Fermentación
Modelos murinos

21. Genética y genómica
1. El pasado: genética en alimentación
2. El presente: la genómica y los modelos
3. ¿Cómo usar estas técnicas?

22. Cacao y salud: ¿cómo demostrarlo?
• Hay muchas referencias bibliográficas sobre el efecto de los polifenoles del cacao
en la prevención del riesgo cardiovascular
• Un polvo de cacao convencional tiene un 3-4% de polifenoles
• Un producto con mayor contenido en polifenoles sería muy interesante

23. CocoanOX 12%
Selección de frutos
Inactivación PPO
Tamizado
Molienda
Extracción solventes
CocoanOX 12%
Aventado
Extracción de grasa
Torta de cacao
Secado
CocoanOX 30-45-70%
E. Cienfuegos-Jovellanos, F.K. Jaisli, M.A. Pasamar, Y. Castilla, F.J. Arcos, D. Ramón. (2007). Method for obtaining polyphenol-rich cocoa powder with a low fat
content and cocoa thus obtained. WO2007/096449

24. Efecto antioxidante en C. elegans
+CCX-12
5 dÍas
C. elegans
Estrés
oxidativo
5 hours
-CCX-12
EXPERIMENTO
% SUPERVIVENCIA
SIN CCX-12
5
CON CCX-12
39

25. Transcriptómica y mutantes
SIR2
EXPERIMENTO
SIR1
% SUPERVIVENCIA
SIN CCX-12 WT
5
CON CCX-12 WT
39
CON CCX-12 SIR 2.1
7

26. ¿Cuál es la diana de los polifenoles de cacao?
Insulin-like
peptides
DAF-2
AGE-1
SGK-1
AKT-1
AKT-2
FTT-2
PAR-5
DAF-16
Citoplasma
Núcleo
SKN-1
SIR-2
DAF-16
Genes de longevidad

27. Aumento de la esperanza de vida
+CCX-12
100
90
80
>21 días
70
% worms 60
alive
50
40
30
20
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
C. elegans
days of adult
-CCX-12
EXPERIMENTO
LIFESPAN (días)
SIN CCX-12
15.2
CON CCX-12
17.8
P. Martorell, J. V. Forment, R. de Llanos, F. Montón, S. Llopis, N. González, S. Genovés, E. Cienfuegos, H. Monzó, D. Ramón. (2011). Cocoa polyphenols increase
lifespan in Caenorhabditis elegans by a SIR-2.1 and DAF-16 dependent mechanism. Journal of Agricultural and Food Chemistry 59: 2077-2085

28. Probióticos y estrés oxidativo
Streptococcus
(9 cepas)
Lactobacillus
(75 cepas)
ESCRUTINIO MASIVO
Bifidobacterium
(15 cepas)

29. Escrutinio en dos pasos
1
Ensayo
Alimentación
Sincronización
Huevos
(1mL Buffer M9)
L1 Larvae
Adultos
4 días
1 día
3 días
5 horas
Placas NG
20°C
25°C
25°C
25°C
M9 + Colesterol
Probiótico
Inhibición E. coli
C. elegans
BA17 fem-1
Estrés oxidativo
Viabilidad
NG-OP50
2
5 días
Estrés
oxidativo
(3mM H2O2)
5 horas
NG-probiótico
C. elegans
wild –type (N2)
G. Grompone, M.C. Degivry, D. Ramón, P. Martorell, N. González, S. Genovés, S. Legrain-Raspaud, I. Chabaud, R, Bourdet-Siscard. (2011). Method for selecting
bacteria with antioxidant activity. WO2011/083353A1

30. CNCM I-3690: una cepa antioxidante
• En general, las bacterias lácticas incrementan ligeramente la resistencia al estrés
oxidativo; no se observó efecto en las bifidobacterias ensayadas
• Se detectó un fuerte efecto en once cepas pertenecientes a los géneros
Lactobacillus y Streptococcus; una de ellas, denominada Lactobacillus rhamnosus
CNCM I-3690, funcionó de forma muy eficaz

31. Transcriptómica de la cepa I-3690
E. coli OP50
Insulin like-pathway
CNCM I-3690
Metabolismo de lípidos
DAF-16
CNCM I-4317
Respuesta a estrés
Sistema inmune innato

32. Resultados en un modelo murino
No colitis
Vehicle + TNBS
• Se ensayó la administración intragástrica
durante 5 días de 108 ufc de la cepa I-3690
en un modelo de rectocolitis inducida por
TNBS en ratones Balb/c; como control
positivo se utilizó prednisolona y como
control negativo se usó el tampón de
administración del probiótico
• Se realizó un análisis histopatológico
CNCMI-3690 + TNBS
Prednisolone + TNBS
• El coeficiente de Wallace fue de 3.4 en el
grupo control con el placebo y de 1.5 en el
grupo de la prednisolona; el valor en el
grupo tratado con la cepa L10C fue de 2.4
G. Grompone, P. Martorell, S. Llopis, N. González, S. Genovés, A.P. Mulet, T. Fernández-Calero, I. Tiscornia, M. Bollati-Fogolin, I. Chambaud, B. Foligné, A.
Montserrat, D. Ramón. (2012). Anti-inflammatory Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690 strain protects against oxidative stress and increases lifespan in
Caenorhabditis elegans. PLOS ONE 7: e52493

33. La enfermedad de Alzheimer
Estrés oxidativo
Inflamación
Degeneración neuronal
Haces neurofibrilares

34. Péptidos desde CB
“COCOA BARQUILLO”
HIDRÓLISIS PROTEÍCA
Hydrophobic Interaction chromatography (HIC)
FRACCIONES HIC
FRACCIONES HIC POSITIVAS
Reverse Phase Chromatography (RPC)
FRACCIONES RPC
FRACCIONES RPC POSITIVAS
MALDI-TOF
IDENTIFICACIÓN DE LOS
PÉPTIDOS

35. Identificación del péptido
FRACCIONES RPC POSITIVAS
IDENTIFICACIÓN MALDI-TOF
SECUENCIAS PEPTÍDICAS (17 péptidos)
Theobroma cacao 21 kDa seed protein (221 aas)
mktatavvlllfaftsksyffgvanaanspvldtdgdelqtgvqyyvlssisgagggglalgratgqscpeivvqr
rsdldngtpvifsnadskddvvrvstdvniefvpirdrlcststvwrldnydnsagkwwvttdgvkgepgpnt
lcswfkiekagvlgykfrfcpsvcdscttlcsdigrhsdddgqirlalsdnewawmfkkasktikqvvnakh
B. Muguerza, H. Monzó, N. Alepuz, E. Bataller, S. Genovés, M. Enrique, P. Martorell, D. Ramón. (2010). Obtainment of cocoa extracts rich in
bioactive peptides with inhibiting activity of ACE and PEP enzymes. EP2322041A1
E. Bataller, S. Genovés, P. Martorell, D. Ramón, A. Ibañez, S. Llopis, N. González, H. Monzó, B. Muguerza. (2011). Obtainment of bioactive products
from cocoa having inhibitory activity against the PEP enzyme and antioxidant and/or anti-neurodegenerative activity. WO2011/076954A1

36. Resultados
70
% Worm Survival (C. elegans N2)
100
80
60
% Inhibition
Antioxidant Activity
80
Percentage Not paralyzed
IC50 PEP 13-mer
(0.19 mg/ml)
40
20
60
50
40
30
20
0
0,001
0,01
0,1
1
NGM+vitamin C
9L
11R
13L
not induced
NGM
100
ZPP
9L
75
11R
50
13L
13R
25
0
24
41
43
0
NGM
Paralysis
assay
10
-20
0,0001
•
125
13R
45
47
49
51
53
Time (h)
[13-mer] mg/ml
Inhibición PEP
Actividad antioxidante
Parálisis
• El valor IC50 más bajo para la inhibición de PEP lo dió el péptido 13L-mer (0.19 mg/mL)
• Este péptido presentó la mayor actividad antioxidante in vivo
• También fue el más eficaz en la reducción de la parálisis
• Curiosamente, el péptido 13L-mer inhibe in vitro la enzima humana PLA2
• Hemos detectado trazas de este péptido en chocolates comerciales

37. Transcriptómica
PÉPTIDO 13L-mer
Regulación
Metabolismo del
piruvato
Regulación
Proteasoma
Acetil coA
Turnover de proteínas
Función sináptica
Reducción del
agregado amiloide
REDUCCIÓN DE LA
TOXICIDAD DE Aβ
Regulación
Metabolismo del
triptófano
Serotonina
Locomoción
Apetito

38. Inhibición de la agregación de Aβ
112
1,2
61
30
25
13
Ratio de agregación
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Placebo
13L
Tubulina
Martorell P, Bataller E, Llopis S, González N, Álvarez B, Montón F, Ortíz P, Ramón D, Genovés S. A cocoa peptide protects Caenorhabditis elegans
from oxidative stress and b-amyloid peptide toxicity. PLOS ONE 8: e63283

39. El modelo de C. elegans en Biopolis SL
Efecto antioxidante
Longevidad
Extractos vegetales
Probióticos
Fracciones de purificación
Inflamación
Moléculas aisladas
Obesidad
Enfermedad de Alzheimer
Replicación de virus
Café
Cerveza
Refrescos carbonatados
Colonización de bacterias
Yogurt
Zumos de frutas

40. Revalorización de resíduos
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Paja de trigo
Bagazo
Materiales
lignocelulósicos
Suero de quesería
Fases ricas en glicerol
de biodiesel
Restos grasos de
matadero
Aguas de producción
de mantequillas
Residuos de almazara
Aceites de fritura
Residuos urbanos
Residuos municipales
(RSU)
Gas de síntesis (CO +
H2 )
Biogas (metano +
CO2)
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Metanol
Etanol
1,3-propanodiol
2,3-butanodiol
Ácido L-láctico
Butanol
Iso-butanol
Dihidroxiacetona
Poli-3-hidroxibutirato
Poli-3-hidroxibutiratoco-valerato
mcl-PHA
Ácidos (R)-3-hidroxi
alcanoicos

41. El futuro: la biología de sistemas
• Hay que trabajar con modelos alternativos, el apoyo de las tecnologías
“ómicas” y la ayuda de la bioinformática
• La biología de sistemas es la clave
• El ejemplo de los líderes: Nestlé Institute of Health Sciences

42. La reflexión final
A lo desconocido no hay que
tenerle miedo, simplemente
hay que entenderlo
(Marie Curie, 1867-1934)

43. Daniel Ramón Vidal (daniel.ramon@biopolis.es)
http://www.linkedin.com/profile/view?id=64921252&trk=tab_pro
Biopolis SL
Parc Cientific Universitat de València
C/ Catedrático Agustín Escardino Benlloch 9; Edificio B; 469809-Paterna; Valencia