Resumen E. coli

1. Rocha-Ramírez et al. BMC Microbiology (2016) 16:158

2. INTRODUCCIÓN
E. coli ENTEROAGREGATIVA (EAEC)
• Diarrea aguda, persistente, con
sangre
• Diarrea del viajero
• Diarrea en pacientes con VIH / SIDA
• Asociada con la inflamación de la
mucosa intestinal
Patrón de adherencia autoagregativa
en células HEp-2
Factores de virulencia
• Plásmido AA : La flagelina AAF( AAF I, AAFII, AAFIII)
• Toxina EAST1 (Toxina termoestable de E. coli
enteroagregativa 1)
• Proteínas Autotransportadoras (ATs):
Pet (Plasmid-encoded toxin)
Pic (protein involved in intestinal colonization)
Nataro et.al 1994

3. ESTUDIOS ASOCIADOS A EAEC
La formación biofilm
espeso sobre la
mucosa del epitelio
intestinal en lechones
gnotobióticos
inoculados con EAEC
• Epitelio intestinal de lechones gnotobióticos
inoculados con EAEC
• Modelo murino -EAEC 042 (O44: H18)
Hipersecreción de moco, respuesta inflamatoria leve con
infiltración mononuclear y edema en la lámina propia del
intestino
• Los estudios epidemiológicos sobre l por
CEEA en humanos
La presencia de lactoferrina, IL-8 e IL-1β en las heces de
las personas infectadas
• Ensayos in vitro usando líneas
celulares intestinales HT29 o T84
infectadas con la cepa EAEC O42
Se observo flagelina , la fimbria de adherencia
agregada (AAF), así como la alteración
basolateral de las células epiteliales promovió
la liberación de IL-8.

4. • La contracción del citoesqueleto
• Pérdida de fibras de estrés de actina
Formación de burbujas superficiales
Pet (Plasmid-encoded toxin)
• Familia de las SPATE :Tsh, EspC, y EspP de E.
coli y ShMu y SepA deShigella
• Causa efectos enterotóxicos y citotóxicos
debido a su actividad serin proteasa
Sistema de secreción tipo V: Proteínas Autotrasportadoras
Efectos citopáticos en las células
de cultivo HEp-2 y HT29
azul de Coomassie
Dautin, 2010 Navarro et al., 199

5. Fernando Navarro-Garcia 2010
PET (PLASMID-ENCODED TOXIN)

6. Cepas de E.coli productores
de SPATE
Acumulación de células
inflamatorias, principalmente
macrófagos M1, que determina la
migración de subpoblaciones
celulares, principalmente TH1, así
como la expresión de mediadores
inflamatorios como el óxido nítrico
Estimular la respuesta inmune
primaria
Tiene receptores de membrana de las
células efectoras del sistema
inmunitario innato que le permiten
actuar en el reconocimiento de
señales de peligro
PRR (reconoce patrones moleculares
asociados a patógenos PAMP)
TLR
Explorar el papel de Pet en la respuesta inmune innata, se analizó si la Pet
contribuye a un aumento de la migración y la activación de los macrófagos mediante
la síntesis de proteínas de respuesta temprana y tardía, como IL-8, TNF, IL- 10 y la
translocación de pp65 a NF-kB.
ESTUDIOS ASOCIADOS A PET
OBJETIVO

7. METODOLOGÍA
E. coli HB101 pCFN1
3 ml LB(Amp) 6 h
37ºC /200 rpm.
1 ml en 1 l de LB
(Amp) 18 h 37ºC/ 200
rpm
10,000 G
4 ºc/30 min
se precipitó con
sulfato de amonio al
60% 4 ° C
10.000 G/ 4 ° C /30
min. Se suspendió en
buffer fosfato de sodio.
se dializó 2 días con /12 h
. Se dializaron Tris-HCl
0,05 M/ 0. 01 M EDTA
Eluyó a partir de una columna de
cromatografía Q-Sepharosey
columna FPLC( líquida de
proteínas) Mono S HR 5/5
Determinación de las
fracciones de proteína por
Bradford
PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
SDS-PAGE
EAECO42
(O44: H18)

8. ELIMINACIÓN DE LPS (ENDOTOXINA) POR GEL
DE AGAROSA POLIMIXINA-B
Polimixina B
(Detoxi Gel, Pierce)
se colocaron alícuotas de
0.5 ml de polimixina B,
sobre las columnas de
polipropileno de 0.5 ml
se equilibró mediante
lavado; cinco volúmenes de
PBS y diez volúmenes de
desoxicolato de sodio al 1%.
Se colocó una alícuota de
250 μL de Pet (300 μg/mL)
temperatura ambiente /60
min
La columna se eluyó
con PBS y de esto se
recogieron 250 μL de
Pet
Determinación de las
fracciones de proteína por
Bradford
SDS-PAGE

9. 100 μL de fracción de
proteína Pet con 100 μL de
LAL 60 min a 37 ° C
Ensayo Limulus Amebocyte Lysate
(LAL) (Cat. N-289-06, LONZA
Valores de 0.125 EU / mL
o menos se consideraron
adecuados para el uso de
Pet en ensayos de
actividad de toxinas
ACTIVIDAD DE ENDOTOXINAS

10. • Ratas Sprague Dawley ( n = 4)
100 y 150 g, ambos sexos
• modelo de bucle ligado
(CINVESTAV-IPN Animal
Ethics Committee) Norma
Oficial Mexicana NOM-062-
ZOO-1999
• Anestésicos Xylazine (6.5 mg
/ kg) y Ketamine (34.5 mg /
kg).
• 1000 μL de 1.5 × 108 CFU E. coli O42.
• 100 μg de Pet purificado
• PBS
12h fueron sacrificados por
dislocación cervical y los segmentos
del íleon fueron disecados.
se fijaron con formalina tamponada
(pH 7,3, 10%) y se incluyeron en
parafina. Se cortaron 5 μm de espesor
laparotomía y exposición del
intestino delgado
Análisis histológico
MODELO DE LAZO LIGADO EN RATAS

11. CULTIVO Y PREPARACIÓN DE MACRÓFAGOS
DERIVADOS DE SANGRE PERIFÉRICA HUMANA
Bolsas de concentrados de
leucocitos (Banco de sangre
del Hospital Infantil de
México Federico Gómez)
La fracción de células
mononucleares se obtuvo
por centrifugación
se lavaron con solución salina fisiológica. los
monocitos obtenidos se purificaron por el método de
selección negativa usando una mezcla de anticuerpos
anti-CD3, CD7, CD19, CD45RA, CD56 y anti-IgE
Citométro de flujo usando anti-CD14
conjugado con FITC
Monocitos purificados (3 × 10 5 monocitos / mL) se
diferenciaron a macrófagos cultivando las células durante 7
días en placas de fijación en medio RPMI-1640
suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS)

12. QUIMIOTAXIS
Filtro :de nitrocelulosa con un diámetro de 0.5μm (superior)
filtro de nitrato de celulosa con 8 μm en el fondo
Células; suspensión de 8 × 10 5 células mononucleares en
0,5 ml de solución de Hanks
Sustancia aprobar :1.7 mL de solución de Hanks con 5, 10
o 20 μg / mL de Pet.
El zymosan opsonizado (ZAS) y la solución de Hanks con
BSA (0.2%)
(90 minutos a 37 ° C en atmósfera de 5% de CO 2.)
etanol al 80%(15 m)
fijaron con resina
Microscopio óptico
(400X) en 5 campos
diferentes

13. EXPRESIÓN DE CITOQUINAS
Los macrófagos obtenidos
previamente se
estimularon con diferentes
concentraciones de Pet (5,
10 y 20 μg / ml) durante 6 y
24 h
1. 100 μl de anticuerpo de captura de cada citocina diluida (4 ° C)
2. El anticuerpo se eliminó y se añadieron 100 mu l de solución de
bloqueo (incubaron 1 h)
3. Las placas se lavaron 3 veces con 300 μL de PBS / Tween al 0,05%
4. Las citocinas se controlaron y se añadieron cada una de las muestras
(se incubaron durante 2 h)
5. Cada pocillo se lavó cinco veces (PBS / tween)
6. Se añadieron anticuerpo de detección (1: 250) y un conjugado de
estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (1: 250) a cada pocillo
7. Los pocillos se lavaron 7 veces (PBS / tween) y se añadieron 100 μL
de sustrato TMB (30 min)
8. La reacción se detuvo con 50 μL de solución de H2SO4 2 N y
finalmente la cuantificación se realizó en un lector de ELISA a 450 nm
La concentración de citoquinas
proinflamatorias (IL-8, TNF-α) y
antiinflamatorias (IL-10) del
sobrenadante de cada muestra
se midió mediante ELISA con
detección de captura y
anticuerpos
sulfato de polimixina B
LPS 0111: B4 se usaron como
controles

14. TRANSLOCACIÓN DE NF-KB (PP65)
Las muestras de macrófagos se trataron por separado con RPMI-
1640 (10% FBS), Pet (10 μg / ml) y 100 ng / ml LPS de E. coli 0111:
B4. (se incubaron durante 30 min a 37 ° C /5% de CO 2
Se incubaron con anticuerpo primario NF-kB (anticuerpo monoclonal
de conejo anti-NF-kBpp65, termocientífico)(1h)
Se lavo con el anticuerpo de tinción y anticuerpo secundario (Hoescht
Dye y Dylight 488 Goat anti-conejo).
Se observo la fluorescencia de los macrófagos a los diferentes estímulos
usando un microscopio Zeiss Axioskop 2 de epifluorescencia, Zeiss
Axiocam (Zeiss AG, Oberkochen, DE).
Se lavaron con PBS, se permeabilizaron con Triton X-100 (0,1%) y se fijaron con
paraformaldehído (4%). Las células se bloquearon con BSA al 2% y suero de caballo
normal (5%) en solución de Dulbecco-PBS (30 minutos)

15. RESULTADOS
PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA PET

16. EFECTO DE LA PROTEÍNA PET EN EL EPITELIO
INTESTINAL
Bacteria O42E AEC
PBS
Pet
Hemorragia, necrosis,
ulceración y exudados fibrinos
purulentos en las muestras del
epitelio intestinal

17. EFECTO QUIMIOATRAYENTE DE PET EN
MACRÓFAGOS

18. CITOSINAS PRODUCIDAS POR MACRÓFAGOS
*
*
*

19. ACTIVACIÓN DE NF-KB (PP65)
NF-KB:factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas
• Complejo proteico que controla la transcripción del ADN

20. ACTIVACIÓN DE NF-KB (PP65)

21. • La diarrea causada por EAEC es el resultado de una interacción compleja
entre el patógeno y el huésped
• se observa constantemente la activación de una respuesta inflamatoria,
puede ser inducida por LPS, fimbrias (AAF) o flagelina
• E. coli que secretan SPATE en pacientes con EII, cáncer y enfermedad de
Crohn (células inflamatorias)
• En un brote de diarrea asociado de EAEC de un niño fallecido, se identifico la
presencia de infiltración inflamatoria de linfocitos y células plasmáticas, así
como la necrosis del epitelio glandular y alteraciones asociadas con un
cuadro clínico de enterocolitis similar a este estudio
• La migración celular dirigida (quimiotaxis) de células mediadoras de la
inflamación, es un primer paso de la respuesta inmune innata del huésped
• Algunos compuestos sintéticos, otros que forman una parte estructural de
microorganismos (LPS(lipopolisacarido) o flagelina) y factores celulares
como IL-8, C5a del complemento, formilato péptidos (FMLP) y leucotrienos,
poseen efectos adyuvantes y de activación del sistema inmune innato
DISCUSIÓN 1/4

22. • los resultados de nuestro estudio muestran que Pet activa la quimiotaxis de
MDM, se obtuvo un efecto similar cuando las mismas células se tratan con
ZAS
• La activación de los factores celulares se induce como un mecanismo de
protección contra la infección y la colonización por microorganismos en los
epitelios
• Datos obtenidos de estudios que utilizan un modelo de ratón infectado con
S. Typhimurium, muestra que la inflamación intestinal inducida por la
infección bacteriana altera la composición de la microbiota y suprime su
crecimiento. Por lo tanto, sugirió que la inflamación es un factor positivo
para la supervivencia y la expansión de Salmonella
• Se han descrito observaciones similares en E. coli 0157: H7, esta bacteria
produce la metaloproteasa mucinasa tipo STcE, que inhibe la migración de
leucocitos y células polimorfonucleares por mecanismos que implican la
participación de glucoproteínas homólogas a la mucina
DISCUSIÓN 2/4

23. EAEC además de Pet también secreta la proteína Pic, la cual tiene la capacidad
de disminuir la quimiotaxis y la transmigración de los leucocitos
La participación de Pet en la activación de la respuesta inmune solo se ha
asociado en procesos crónicos, pero aún no se ha analizado si la molécula está
involucrada en la respuesta inmune innata.
La producción de IL-10 inducida por Pet se identificó en sus niveles más altos a
las 6 h; aunque, este efecto no se esperaba porque es síntesis y la cinética es
un evento retrasado, esto sugiere que la síntesis temprana de IL-10 inducida
por Pet podría estar relacionada con un mecanismo de inmunosupresión
transitoria que permite E.
Los receptores Toll-like (TLR) expresados ​​en diferentes células, incluidos los
macrófagos, activan las vías de señalización extracelular después de haber
reconocido las moléculas de tipo PAMP; es decir, un evento que conduce a la
liberación de NF-kB y su translocación al núcleo.
DISCUSIÓN 3/4

24. En el estudio, se observó que Pet indujo significativamente la translocación de pp65
después de 30 minutos de estimulación.
En las células epiteliales derivadas de los intestinos, se ha informado la
participación de la citoqueratina 8 (CK8) como receptor de Pet . Sin embargo sin
embargo, los resultados mostraron que Pet no es una molécula de tipo PAMP (datos
no mostrados).
DISCUSIÓN 4/4
Pet participa como una molécula inmuno-estimulante para
macrófagos, que activa tanto su movilidad como la expresión
de citocinas. Estas observaciones sugieren que la toxina
participa en el proceso inflamatorio que se observa durante
la infección del huésped por la producción de EAEC
CONCLUSIÓN

25. PATOTIPO PROTEÍNAS
AUTOTRANSPORTADORA
GENES PREVALENCIA
EAEC
n=21(100%)
Pet pet 4(19)
Pet/Pic pet/pic 6(28)
Negativo - 6(28)
No analizados - 5(23)
Genes Secuencia de primer Tamaño ( pb) Referencias
Patotipos
EAEC aafII
CAC AGG CAA CTG AAA TAA GTC TGG
ATT CCC ATG ATG TCA AGC ACT TC
378 Vidal, et al.
Proteínas autotransportadoras
Pet pet
GGCACAGAA TAA AGGGGTGTT T
CCTCTTGTTTCCACGACATAC
302 Restieri, et al.2007
Pic pic
ACTGGATCTTAAGGCTCA GGAT
GACTTAATGTCACTGTTCAGCG
572 Restieri, et al.2007
GENES IDENTIFICADOS MEDIANTE PCR
IDENTIFICACIÓN DE Pet