Tem 12

Tema 12. Medida del crecimiento bacteriano
1. Métodos de determinación de la masa celular
1.1. METODOS DIRECTOS GRAVIMÉTRICOS
• Peso húmedo
• Peso seco
1.2. METODOS INDIRECTOS
• De componentes del cultivo: Nitrógeno total, ARN, ADN; proteínas….
• De la actividad metabólica: consumo de un nutriente característico,
consumo de oxígeno (respiración)
• Métodos turbidimétricos: espectrofotométricos, nefelométricos
p ,
2. Métodos de determinación del número de células
2.1. METODOS DIRECTOS
• Recuento en cámara de Petroff-Hauser
• Contadores electrónicos de partículas (Coulter)
2.2.
2 2 MÉTODOS INDIRECTOS
• Recuento de viables en placa
• Recuento en filtros de membrana
• Recuento del NMP: número más probable


Objetivos del tema:
j
1. Diferenciar entre métodos directos e indirectos de la medida del crecimiento
microbiano
2. Conocer los diferentes métodos de estimar el número de células
microbianas y discutir las limitaciones
3. Conocer los diferentes métodos de estimar la biomasa microbiana y discutir
sus limitaciones
4. Aprender a aplicar los métodos de medida del crecimiento bacteriano e
interpretar los resultados
5. Comprender la aplicación y utilidad de los métodos de medida del
crecimiento bacteriano


1. Métodos de medida de la masa celular
1.1.Métodos directos gravimétricos
• Peso húmedo: centrifugación de un volumen de cultivo y pesada
g p

• Peso seco:
o centrifugación lavado y desecación
centrifugación,
o filtración en filtros gravimétricos y se seca hasta peso constante
A: Peso del filtro y cultivo secos (mg)
B: Peso del filtro seco (mg)

Aunque es una determinación que requiere tiempo es
un método de medida de la masa bacteriana más fiable
que el peso fresco que se ve más influenciado por las
condiciones fisiológicas y ambientales.
No obstante son menos sensibles que otros métodos
ya que 1mg de masa (se requiere balanzas de
p
precisión), equivale a varios billones de bacterias
), q
Balanza para determinaciones
gravimétricas


1.
1 Métodos de medida de la masa celular

1.2. Métodos indirectos de consumo o producción

• De componentes del cultivo: Nitrógeno total ARN ADN;
total, ARN,
proteínas….

• De la actividad metabólica: consumo de un nutriente
característico, consumo de oxígeno (respiración); producción de
CO2, del poder reductor, de la carga energética….

La magnitud de una actividad metabólica concreta
del cultivo es función de la masa celular y por tanto
es un método indirecto de la estimación de la masa
del cultivo que desarrolla dicha actividad
q
Respirómetro 6

1.2.Métodos indirectos turbidimétricos
Métodos turbidimétricos: espectrofotómetros
p
Luz roja 1 cm
(~600 nm)

I0 I (luz no dispersa)

Dispersión

OD = log[I0/I] OD = log[10/1] = 1.0 ~ 109 células/ml

Útil en rango lineal
OD = 0.1 a 1 0
0 1 1.0


A mayor turbidez mayor población celular

Medida de turbidez como indicadores del crecimiento

1.2. Métodos indirectos turbidimétricos

La
L escala Mc F l d
l M Farland

Precipitados de BaSO4

BaCl2 1% + concentraciones variables H2SO4

Número células / ml

2. Métodos de medida del número de células
2.1. Métodos directos recuento de células totales
Cámara de Petroff-Hauser
Petroff Hauser

Cámara
cubre

Se coloca la muestra entre la cámara y el cubre sin que rebose. El espacio que queda es de
0.02mm. La rejilla tiene 25 celdillas mayores y un total de 400. Un área total de 1mm2 y volumen
de 0.02mm3

Nº de células /ml = nº células /nº celdillas/ vol celdilla

vol celdilla= 0.02/400 mm3 = 5.10-5 mm3= 5. 10-8 ml

43 células en 16 celdillas Nº células= 43/16/5. 10-8

Nº células/ml = 0.5375.108

Nº células/ml = 5,375 107

2.1. Métodos directos: recuento de células totales
• Contadores electrónicos de partículas (Contador Coulter)
vacio
Electrodo
interno

Electrodo
externo

Electrolito con
bacterias
(p
(particulas) en
)
suspensión

Orificio Tubo de cristal

Técnica basada en la diferencia de conductividad
entre l células y el fluido en el que están
t las él l l fl id l tá
suspendidas


Citometría de flujo
Cit t í d fl j

Las células/partículas marcadas con un colorante fluorescente son valoradas
individualmente por un detector láser que las identifica por su tamaño y su coloración.
Esto permite identificar dentro de una población compleja grupos celulares o de
partículas según el patrón d marcaje. A i i
tí l ú l t ó de j Asimismo, esta té i f ilit l clasificación d
t técnica facilita la l ifi ió de
subpoblaciones de células/partículas según su fluorescencia.


2.2.Métodos indirectos • Recuento de viables en placa

Método de extensión. La
muestra se siembra sobre la
superficie del medio sólido

Método de vertido El medio
ertido
sólido en sobrefusión se
añade a la muestra

Diluir y anotar la dilución
Sembrar sobre la placa (0.1ml)
Muestra:
Incubar
1 célula = 1 colonia ~ 106 células Placa Petri medio sólido


Muestra
(E. coli)

Para el recuento hay que tener
en cuenta la dilución y le
volumen de muestra sembrado


Recuento d viables en placa
R t de i bl l

Cuentacolonias tradicional

Cuentacolonias automático


•R
Recuento en sistemas de filtros de membrana
t i t d filt d b

El filtro de
membrana se retira
del soporte y se
coloca sobre una
placa de medio de
cultivo

Incubación (24 horas)
( )

Muestra filtrada a
Filtro de través del filtro de
membrana sobre el membrana (0.45 µm)
soporte
Flujo a alta
Sistema de filtración con membrana velocidad

Capa de
contacto

Membrana

Poros tapados


Crecimiento de colonias
de bacterias sobre las
membranas filtrantes

Observación de las células al microscopio electrónico de barrido sobre
membranas filtrantes


2.2.Métodos indirectos • Recuento del NMP: número más probable

En la estimación del nº de bacterias
por el método del NMP, tras realizar
las diluciones de la muestras se
siembran 5 tubos por cada dilución
dilución.
1: 10-5 1: 10-6 1: 10-7 Se incuban los tubos y se observa
el número de tubos en los que hay
crecimiento.
crecimiento
En el ejemplo: 4 2 1
Este número se lleva a la tabla de
Mc Grady que nos dará el número
de bacterias de muestra solo hay
q
que tener en cuenta la dilución para
p
4 tubos + 2 tubos + 1 tubo +
calcular el número final

4.2.1= 26. 10 -5 células en 100ml .
Nº de células por ml = 26. 10-3

Tabla del número más probable (NMP) para 5 tubos
Nº de tubos crecidos en las NMP de cél. Nº de tubos crecidos en las NMP de cél.
tres últimas diluciones X 100ml tres últimas diluciones X 100ml

0 0 0 1.8 4 3 0 27

0 0 1 2 4 3 1 33

0 1 0 2 4 4 0 34

0 2 0 4 5 0 0 23

1 0 0 3 5 0 1 30

1 0 1 4 5 0 2 40

1 1 0 4 5 1 0 30

1 1 1 6 5 1 1 50

1 2 0 6 5 1 2 60

2 0 0 4 5 2 0 50

2 0 1 7 5 2 1 70

2 1 0 7 5 2 2 90

2 1 1 9 5 3 0 80

2 2 0 9 5 3 1 110

2 3 0 12 5 3 2 140

3 0 0 8 5 3 3 170

3 0 1 11 5 4 0 130

3 1 0 11 5 4 1 170

3 1 1 14 5 4 2 220

3 2 0 14 5 4 3 280

3 2 1 17 5 4 4 350

4 0 0 13 5 5 0 240

4 0 1 17 5 5 1 300

4 1 0 17 5 5 2 500

4 1 1 21 5 5 3 900

4 1 2 26 5 5 4 1600
4.2.1= 26
4 2 0 22 5 5 5 > 1600

4 2 1 26 4 2 1 26


BIBLIOGRAFÍA

1.LIBROS
1 LIBROS DE TEXTO:

•Medidas directas del crecimiento bacteriano. Crecimiento microbiano. Brock
Biología de los microorganismos (10ª Edición). Pearson Prentice Hall. (2003).
Edición) Hall (2003)
•Medidas indirectas del crecimiento bacteriano. Crecimiento microbiano.
Brock Biología de los microorganismos (10ª Edición). Pearson Prentice Hall.
(2003).
(2003)
•Crecimiento microbiano. Microbiología (5ª Edición). Prescott, Harley y Klein.
Mc Graw-Hill (2004).

2. Páginas Web:

http://coli.usal.es/web/educativo/micro2/tema07.html#anchor601616
http://coli usal es/web/educativo/micro2/tema07 html#anchor601616

http://www.unavarra.es/genmic/microgral/Tema%2002.-%20Cultivo%20de%20microorganismos.pdf

http://www.unavarra.es/genmic/micind-2-3.htm

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