Descripción de los métodos de identificación bacteriana en el laboratorio de microbiología

1. Métodos de identificación bacteriana
María Belén Huertas Chacón
belenhuertas@gmail.com
http://paratecnicosdelaboratorio.blogspot.com.es/

2. Identificación bacteriana
• Labor principal laboratorio de microbiología:
o Identificación de los microorganismos implicados en
procesos clínicos asociados a infecciones.
o Conocer las implicaciones patológicas y la evolución
clínica.
o Aplicar una terapia antimicrobiana eficaz
o Asignar una especie al aislamiento microbiano.
APLICACIÓN DE TÉCNICAS FENOTÍPICAS
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3. Identificación bacteriana
• Métodos fenotípicos o "tradicionales"
• Métodos moleculares
• Métodos basados en proteómica
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4. Identificación bacteriana
• Características fenotípicas:
o Morfología en la tinción de Gram
o Cto. en los distintos medios de cultivo
o Cto. en diferentes atmósferas
o Oxidasa
o Catalasa
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5. Identificación bacteriana
• Identificación del género
o Características del cultivo
 Atmósfera de incubación
o Pruebas primarias
 Tinción de Gram
 Morfología colonias
 Catalasa
 Oxidasa
 Oxidación-fermentación
 Fermentación de la glucosa
 Producción de esporas
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6. Identificación bacteriana
• Conclusión: (Identificación de la especie)
Estas pruebas deben ser suficientes para
identificar labacteria causante de la infección,
pero si con esta batería de pruebas no
identificaramos la bacteria siempre podríamos
recurrir a los sistemas comerciales.
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7. Identificación fenotípica
• Característias microscópicas
• Características macroscópicas
• Cultivo
• Pruebas bioquímicas
• Pruebas basadas en la resistencia a ciertas substancias
• Sistemas comerciales
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8. Identificación fenotípica
• Característias microscópicas
o Examen en fresco
o Tinciones
• Características macroscópicas
o Morfología
o Hemólisis
• Cultivo
o Medios de cultivo
o Requisitos de crecimiento
 Atmósfera
 Temperatura
 Nutrición
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9. Identificación fenotípica
• Pruebas bioquímicas
o Pruebas con lectura inmediata
o Pruebas rápidas (con lecturas en menos de 6 horas)
o Pruebas lentas (con lectura de 18 a 48 horas)
• Pruebas basadas en la resistencia a ciertas substancias
o Optoquina
o Bacitracina
o Solubiliad en bilis
• Sistemas comerciales
o Sistemas manuales
o Sistemas automáticos
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10. Identificación fenotípica
• Característias microscópicas
o El estudio microscópico en fresco y tras tinción revela
la forma y manerade agruparse, la estructura de las
celulas y su tamaño.
o La tinción es el primer paso (el único algunas veces)
para la identificación bacteriana.
Las tinciones más utilizadas son:
 Azul de Metileno
 Gram
La tinción de Gram es la tinción más importante, y
en algunas ocasiones (LCR) la Primera y/o única herramienta
para un diagnóstico
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11. Identificación fenotípica
• Características macroscópicas
o La morfología de las colonias: Fundamental para la
identificación preliminar así como la diferenciación de
microorganismos (colonias de cultivo fresco, medios no
selectivos y preferiblemente aislamiento de la bacteria
en cultivo puro)
 Tamaño
 Forma
 Textura
 Color
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12. Identificación fenotípica
oHemólisis:
Agunas bacterias producen hemolisínas que causan
la lisis de los hematíes en medios que contienen
sangre
 Beta. Zona clara alrededor de la colonia
 Alfa. Halo verdoso alrededor de la colonia
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13. Identificación fenotípica
• Cultivo
C
o Medios de cultivo:
En los medios de cultivo las bacterias se multiplican pero
se necesita esperar entre 18 y 24 horas. Para ello las
bacterias necesitan una fuente de energía, una fuente
de carbono, una fuente de nitrógeno, algunas sales,
oligoelementos y agua.
 Líquidos. Las substancias nutritivas se encuentran
disueltas. E. crecimieneto sueleser mayor
 Sólidos. Consisten en una base de agar. Permite
disponer de las colonias bacterianas
Capacidad para permitir crecimiento bacterias
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14. Identificación fenotípica
 Medios básicos. Ricos en nutrientes que permiten
que permiten el crecimiento de la mayoría de las
bacterias
 Medios de enriquecimiento. Están desarrollados
para recuperar bacterias exigentes (requisitos
nutricionales. Suelen ser medios líquidos
 Medios selectivos. Fomentan el cto. de algunas
bacterias e impoden el de otras
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15. Identificación fenotípica
 Medios diferenciales. Se utilizan para poner de
manifiesto características distintivas de las
colonias. Distinguen entre los distintos grupos
bacterianos casi siempre por el color de las colonias
 Medios cromogénicos. Incorporan substancias
cromogénicas para detectar distintas enzimas
producidas por los microorganismos. Cuando la
bacteria produce la enzima hidroliza el sustrato
liberando el compuesto cromogénico que adquiere un
color intenso dando color a la colonia.
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16. Identificación fenotípica
o Requisitos de crecimiento
 Atmósfera:
 Aerobias estrictas: crecen sólo en presencia de
oxígeno.
 Anaerobias estrictas: Crecen sólo en ausencia de
oxígeno.
 Facultativas: Crecen tanto en aerobiosis como en
anaerobiosis.
 Microaerófilas: crecen mejor en una atmósfera
reducida de oxígeno.
 Capnofílicas: requieren CO2 adicional para crecer.
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17. Identificación fenotípica
 Temperatura.
 Psicrofílicas: Pueden crecer a bajas temperaturas
entre 2 - 5ºC (óptima 10 - 30ºC)
 Mesofílicas: Requieren para su crecimiento
temperatura entre 10 - 45ºC (Tª óptima entre
30 - 40ºC)
 Termofílicas: Crecen muy poco a 37ºC (Tª
óptima enre 50 - 60ºC)
La mayoría de las bacterias son MESOFÍLICAS
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18. Identificación fenotípica
 Nutrición
 Capacidad para crecer en medios ordinarios
 Capacidad para crecer en medios con adición de
sangre, suero o glucosa
 Necesidad de factores específicos:
 Factor X (hemina)
 Factor V (NAD) Haemophilus spp
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19. Identificación fenotípica
• Pruebas bioquímicas
Las pruebas bioquímicas nos permiten determinar las
características metabólicas de las bacterias
o Pruebas de lectura inmediata
o Pruebas de lectura rápida (menos de 6 horas)
o Pruebas de lectura lenta (entre 18 y 48 horas)
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20. Identificación fenotípica
o Pruebas de lectura inmediata:
 Catalasa: Diferenciar Microccocacceae (positivo) de
Streptococcus spp y Enterococcus spp (negativo)
 Oxidasa: Determinar la presencia de la enzima
oxidasa.
 Neisserias: Oxidasa positiva
 Pseudomonas (Oxidasa positiva) de otras
enterobacterias oxidasa negativa
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21. Identificación fenotípica
o Pruebas de lecturas rápidas: Lectura de los resultados
en menos de 6 horas.
 Hidrólisis del hipurato: Para la identificación de
Campylobacter jejuni, Listeria monocitogenes,
Gardneella vaginalis, y Streptococcus agalactiae
 ONPG (Beta-galactosidasa): Con ella demostramos la
presencia de la enzima Beta - galactosidasa.
Todas las bacterias fermentadoras lentas de la
lactosa son Beta-galactosidasa positivas.
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22. Identificación fenotípica
 PYR: Identificación de Streptococcus pyogenes y
Enterococcus spp. También en la diferenciación
Staphylococcus lugdunensis de otros estafilococos
coagulasa negativos.
 LAP: Identificación de cocos grampositivos catalasa
negativa
 Ureasas: Diferenciar Proteus (positiva) de otras
enterobacterias. También se utiliza para la
diferenciación entre Physobacter phenylpyruvicus y
Moraxella spp Helicobacter pylori y Brucella spp que
también hidrolizan la urea.
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23. Identificación fenotípica
 Indol: Detecta liberación de indol en un compuesto
bacteriano.
 E coli: Indol positivo
 Klebsiella spp: indol negativo
o Pruebas lentas: Lectura entre las 18 y 48 horas
 Oxido-Fermentación: Indica el tipo de metaboismo
energético de la bacteria, respiratorio, es decir,
oxidativo (O) o fermentador (F). La bacteria se
inocula en el medio y se incuba en aerobiosis y
anaerobiosis simultáneamente
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24. Identificación fenotípica
 Reducción de nitratos:
 Asignar bacterias a la familia Enterobacteriaceae
 Diferenciar Moraxella catatthalis del género

Neisseria
 Identificación de bacilos grampositivos
aerobios
 Rojo de metilo: Identificación a nivel de especie de
los bacilos entéricos gramnegativos.
 Voges-Proskauer: Identificación a nivel de especie
de bacilos entéricos gramnegativos, Aeromonas
spp y Vibrio spp
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25. Identificación fenotípica
 Agar hierro de Kligler:
 Capacidad de metabolizar un hidrato de carbono
específico (glucosa, lactosa o ambas)
 Producción o no de gases CO2 e H2
 Producción de ácido sulfhídrico (SH2)
Otro medio sería el TSI (Triple Sugar Iron) que
contiene un tercer hidrato de carbono: la sacarosa
 Fermentación de azúcares
 Hidrólisis de la esculina
 Coagulasa: Diferenciar S aureus (positiva) de otros
Staphylococcus
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26. Identificación fenotípica
 Fenilalanina-desaminasa: Diferenciar Proteus,
Providencia y Morganella de otros género de
enterobacterias.
 ADNasa
 Hidrólisis de la gelatina
 Descarboxilasas
 Lipasa
 Lecitinasa
 Utilización de citrato: Entre las enterobacterias,
Enterobacter, Serratia, Klebsiella, Citrobacter y
algunas especies de Salmonella.
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27. Identificación fenotípica
 Utilización de malonato
 Prueba de CAMP
• Pruebas basadas en la resistencia a ciertas
substancias:
o Optoquina: Inhibe crecimiento de S pneumniae, pero
no de otros Streptococcus alfa-hemolíticos
o Bacitracina: Los streptococcus beta-hemolíticos del
grupo A suelen ser sensibles a bajas concentraciones
de bacitracina.
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28. Identificación fenotípica
o Solubilidad en bilis: Se basa en la capacidad de
determinadas especies bacterianas de lisarse en
presencia de sales biliares, el efecto de esta enzima
autolítica se pone de manifiesto sobre colonias de S
pneumoniae
o Crecimiento en caldo hipersalino
• S
Sistemas comerciales
o Sistemas comerciales manuales o galerías multipruebas
o Sistemas comerciales automatizados
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