2. QUÍMICA ANALÍTICA
Es la herramienta fundamental para realizar el análisis químico de los alimentos.
Puede definirse como la rama de la Química que se ocupa de la identificación y
cuantificación de un componente químico en una sustancia dada.
La química analítica se divide en dos campos de acción:
• el análisis cualitativo: cuyo objeto es identificar cuales son los componentes que
están presentes en una muestra.
• el análisis cuantitativo: por medio del cual se determina cuanto hay de cada
componente en la muestra evaluada.
Para cumplir estos dos objetivos, la química analítica se vale del método analítico.
Se define como el conjunto de operaciones físicas y químicas que permite
identificar y/o cuantificar un componente químico, al cual se denomina
analito, en el sistema material que lo contiene, el cual se denomina matriz.

3. QUÍMICA ANALÍTICA
Los métodos de análisis químico pueden clasificarse en dos grandes grupos:
• Métodos químicos clásicos
a. Análisis volumétrico: se basa en la medida exacta del volumen de una
solución que contiene suficiente reactivo para reaccionar con el analito.
b. Análisis gravimétrico: la determinación del analito se realiza midiendo
directa o indirectamente su masa.
• Métodos instrumentales (físico-químicos)
a. Métodos espectrométricos
b. Métodos electroanalíticos
c. Métodos cromatográficos

4. ASPECTOS GENERALES
Por la diversidad de sus orígenes y la gran variabilidad en su composición
química, han surgido una variedad enorme de Métodos de Análisis para
Carbohidratos.
A. Métodos Físicos
a. Cromatografía en papel y de capa fina
b. Cromatografía de gas – líquido
c. Cromatografía de intercambio iónico
d. Electroforesis (gel de poliacrilamida – PAGE)
e. Refractometría
f. Hidrometría
g. Polarimetría
h. Espectroscopia de rayos infrarrojos (de Fourier FT – IR)
B. Métodos Químicos
Métodos Redox
Métodos por formación de complejos
C. Métodos Bioquímicos
Métodos Enzimáticos

5. MÉTODOS FÍSICOS
Cromatografía
La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de mezclas
complejas. Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo
objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y
determinar las cantidades de dichos componentes.
Las técnicas cromatográficas son muy variadas, pero en todas hay una fase móvil que
consiste en un fluido (gas, líquido o fluido supercrítico) que arrastra la muestra a través
de una fase estacionaria que se trata de un sólido o un líquido fijado en un sólido. Los
componentes de la mezcla interaccionan en distinta forma con la fase estacionaria.
De este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se
van separando. Después de que los componentes hayan pasado por la fase
estacionaria, separándose, pasan por un detector que genera una señal que puede
depender de la concentración y del tipo de compuesto.
La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas:
• Separar los componentes de la mezcla para obtenerlos más puros y que puedan ser usados
posteriormente.
• Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica). En este caso, las
cantidades de material empleadas son pequeñas.

6. Cromatografía líquida
Dentro de esta categoría se destaca la cromatografía líquida de alta resolución (HPCL, del
inglés High Performance Liquid Chromatography). Es la técnica cromatográfica más
empleada en la actualidad, normalmente en su modalidad de fase reversa donde la fase
estacionaria tiene carácter no polar, y la fase móvil posee carácter polar.
Terminología empleada en cromatografía:
• Analito: es la substancia que se va a separar durante la cromatografía.
• Cromatografía analítica: se emplea para determinar la existencia y la concentración de
un analito en una muestra.
• Fase enlazada: es una fase estacionaria que se une de forma covalente a las partículas
de soporte o a las paredes internas de la columna.
• Cromatograma: es el resultado gráfico de la cromatografía. En el caso de separación
óptima, los diferentes picos o manchas del cromatograma se corresponden a los
componentes de la mezcla separada.
• Muestra: es la materia que va a ser analizada en la cromatografía. Puede consistir en
un simple componente o una mezcla de varios.
• Soluto: es cada uno de los componentes de la muestra que va a ser separado.
• Disolvente: es toda sustancia capaz de solubilizar a otra, especialmente la fase líquida
móvil en cromatografía de líquidos.
• Fase estacionaria: es la sustancia que está fija en una posición en el procedimiento de la
cromatografía.

7. Cromatográfo

8. Cromatográfo

9. Cromatografía en capa fina
Las capas finas preparadas sobre vidrio se denominan cromatoplacas o placas simplemente.
Se usan dos tipos de capas: capa compacta que se adhiere a la placa de vidrio por medio de
un agente aglomerante incorporado al adsorbente o por las cualidades adherentes del
propio material, y capa suelta.
Reactivos utilizados para revelar carbohidratos
Reactivos específicos dan manchas coloreadas con diversos azúcares, entre ellos el ftalato de
anilina (en n-butanol saturado de agua) y naftoresorcinol (en acetona, agua y ácido fosfórico).
Diversas técnicas se emplean en la detección de los carbohidratos después de la separación
cromatográfica. Se incluyen revelaciones con sprays o inmersiones de tiras de papel en
platos de capa fina conteniendo diversos reactivos de coloración.
Dentro de los sprays cromogénicos se mencionan: el ácido tiobarbitúrico para la
determinación de ácidos sálicos; el orcinol-ácido sulfúrico para determinar galactosa; antrona
para hexosas; carbazol para ácidos urónicos; el resorcinol para residuos de ácidos sálicos
unidos.

10. Aplicaciones de la cromatografía de capa fina
En las separaciones sobre capa fina pueden realizarse separaciones por reparto, filtración
sobre gel, adsorción e intercambio iónico. Las propiedades particulares de la
cromatografía en capa fina permiten desarrollar el fraccionamiento en un periodo de
tiempo mucho menor (entre veinte y cuarenta minutos).
Una razón es el tamaño tan fino de las partículas que constituyen los medios empleados
en cromatografía en capa fina, por lo que se consiguen mejores resoluciones y manchas
más compactas.
Materiales y sustancias
-Placa de vidrio con sílica gel
-Cámara cromatográfica
-Pipetas
-Pera para pipetear
-Regla
-Estufa
-Solvente de desarrollo (50 ml Butanol, 30 ml propanol, 20 ml Ac Bórico 0,5%)
-Muestra (CHO #1; CHO#2)
-Carbohidratos patrón (xilosa, lactosa, sacarosa, glucosa, galactosa, ribosa, fructosa).

11. Procedimiento
En la placa de vidrio trazar una línea a 1.5 cm de la base, que servirá como punto de
origen para la aplicación de las muestras, luego aplicar las muestras y los carbohidratos
patrones con un capilar, mas o menos con separaciones de unos 0,5 cm, calentar en la
estufa a unos 120 ºC por unos 2 minutos, luego agregar 50 ml del solvente de desarrollo
en la cámara cromatográfica.
Poner la placa en la cámara cromatográfica y esperar hasta que ascienda el solvente de
desarrollo por la placa de vidrio hasta unos 7 cm de la base. Una vez ascendido el
solvente sacar la placa y tirar una raya con cuidado hasta donde llegó el
solvente, calentar en la estufa por unos minutos.
Luego sacamos la placa de la estufa y con una brocha con cuidado pasamos el reactivo de
Molisch para el revelado, una vez hecho esto secamos en la estufa a 120 o 140 ºC de 1 a 5
minutos, tener cuidado de que las manchas no se vayan a dañar, observar de rato en rato
hasta que aparezcan las manchas coloreadas.
Medir la distancia desde el punto de origen hasta la mitad de la mancha, y luego desde el
punto de origen hasta el frente del solvente y calcular el RF.
En el revelado se forman derivados del furfural, las hexosas van a formar hidroxi metil
furfural y las pentosas forman furfural y estas son incoloras, pero como el reactivo de
Molisch tiene α naftol van a formar complejos coloreados de violeta púrpura rosado.

12. Reacción de Molisch
Este ensayo permite detectar la presencia de hidratos de carbono
en una muestra; se basa en la acción hidrolizante y deshidratante
que ejerce el ácido sulfúrico sobre estos compuestos. Como se
sabe, los ácidos concentrados originan una deshidratación de los
azúcares para rendir furfurales, que son derivados aldehídicos del
furano. Los furfurales se condensan con los fenoles para dar
productos coloreados característicos, empleados frecuentemente en
el análisis colorimétrico.
Procedimiento experimental
En un tubo de ensayo se depositan 10 ml de una disolución al 5% de la muestra a
ensayar, en un segundo tubo de ensayo se deposita la misma cantidad de una disolución
también al 5% de un hidrato de carbono conocido (glucosa). Se añaden unas gotas de
reactivo de Molisch (α-naftol al 5% en etanol) y se mezcla el contenido. Inclínense los
tubos y déjese resbalar cuidadosamente 1 ml de ácido SO4H2 concentrado a lo largo de
la pared del tubo de manera que se forme una capa bajo la fase acuosa. A continuación se
calientan los tubos en un baño de agua unos minutos. La reacción es positiva si se forma
un anillo rojo violáceo en la interfase. Esta reacción la dan todos los azúcares por lo que
debe llevarse a cabo evitando la presencia de restos de papel de filtro o materiales
similares en los tubos de ensayo.

13.  La refracción
Cuando se pone un lápiz en el agua, la punta del lápiz aparece inclinada. Luego, si se hace
lo mismo pero colocando el lápiz en una solución de agua azucarada, la punta del mismo
aparecerá más inclinada. Este es el fenómeno de la refracción de la luz.
Los refractómetros son instrumentos de medición basados en el fenómeno de refracción
de la luz. Se basan en el principio por el cual cuando aumenta la densidad de una
sustancia (por ejemplo: cuando se disuelve el azúcar en el agua), el índice de refracción
aumenta proporcionalmente.
Los refractómetros fueron inventados por Dr. Ernst Abbe, científico alemán-austriaco a
principios del siglo XX. Existen dos tipos de refractómetros en función de la detección
del índice de refracción: sistemas transparentes y sistemas de reflexión. Los
refractómetros portátiles y los refractómetro Abbe usan los sistemas
transparentes, mientras que los refractómetros digitales usan los sistemas de reflexión.

14. Descripción del sistema transparente.
En la figura de abajo la detección es hecha utilizando el fenómeno refractivo producido en
el limite del prisma. Si la muestra es de baja concentración, el ángulo de refracción es
grande (vea "A") debido a la gran diferencia en el índice de refracción entre el prisma y la
muestra.
Si la muestra es concentrada, el ángulo de refracción es pequeño (vea "B") debido a la
pequeña diferencia en el índice de refracción entre el prisma y la muestra.

15. Descripción del sistema de reflexión
El sistema de refracción para el refractómetro digital (sistema de reflexión). En la figura
debajo, haz de luz A, que incide desde la parte baja izquierda del prisma, no es reflejada por
el limite, pero pasa a través de la muestra. El haz de luz B se refleja por la cara
derecha, directamente a lo largo del límite del prisma. El haz de luz C, incide en un ángulo
demasiado grande para pasar a través de la muestra, si no que es totalmente reflejado hacia
el lado bajo y derecho del prisma. Como resultado, la línea límite es producida dividiendo la
luz y la sombra en el otro lado de la línea punteada B en la figura. El ángulo de reflexión
de esta línea es proporcional al índice de refracción, la posición de la línea límite entre la
luz y los campos oscuros son captadas por un sensor y convertidas en índices refractivos.

16. Unidad de medida (Brix)
La Escala de Medición (%) muestra el porcentaje de concentración de los sólidos solubles
contenidos en una muestra (solución de agua). El contenido de los sólidos solubles es el
total de todos los sólidos disueltos en el agua, incluso el azúcar, las sales, las proteínas, los
ácidos, etc., y la medida leída es el total de la suma de éstos.
Básicamente, el porcentaje Brix (%) se calibra a la cantidad de gramos de azúcar
contenidos en 100g de solución de azúcar. Así, al medir una solución de azúcar, Brix (%)
debe ser perfectamente equivalente a la concentración real.

17. MÉTODOS QUÍMICOS
Método de Fehling-Soxhlet
Este método se basa en la precipitación de ácido cuproso (Cu2O)en
presencia de una sustancia reductora. Se utiliza para determinar
azúcares reductores; puede ser por análisis gravimétrico o
volumétrico.
 Método gravimétrico de Munson y Walker.
El método gravimétrico se conoce como la propuesta de Munson y Walker. Corresponde a
la cantidad de cobre reducido en presencia de azúcares reductores; el peso en miligramos
de Cu2O corresponden a los miligramos de azúcares analizados, por medio de las tablas de
Munson y Walker que aparecen en el AOAC.
Los azúcares reductores son aquellos azúcares que poseen su
grupo carbonilo (grupo funcional que consiste en un átomo de
carbono con un doble enlace a un átomo de oxígeno) intacto, y que a
través del mismo pueden reaccionar con otras moléculas.

18. •Materiales y Reactivos
•Un balón aforado de 250 ml
Reactivo de Fehling – Soxhlet:
•Un balón aforado de 100 ml
Reactivo A
•Un vaso de precipitados de 500ml
Disolver 69.28 g de sulfato de cobre pentahidratado
•Un vaso de precipitados de 250ml
(CuSO4 . 5H2O) y 1 ml de ácido sulfúrico 1M en
•Un Erlenmeyer de 500ml
1L de agua. La solución puede almacenarse
•Una placa de calentamiento
indefinidamente.
•Cinco tubos de ensayo
•Dos pipetas graduadas de 5ml
Reactivo B
•Un embudo de vidrio
Disolver 346g de tartrato de sodio y potasio
•Un agitador de vidrio
tetrahidratado KNaC4H4O6*4H2O (sal de Rochelle)
•Una probeta de 100ml
y 100g de hidróxido de sodio (NaOH) en agua y
•Una probeta de 50ml
aforar a 1L. La solución es estable indefinidamente
•Una pipeta aforada de 25ml
si es almacenada en un recipiente hermético.
•Una pipeta aforada de 10ml
•Un vidrio de reloj
•Una propipeta
•Dos aros con nuez ( uno pequeño)
•Una gradilla

19. PROCEDIMIENTO
1. Preparación del reactivo de Fehling-Soxhlet: mezclar volúmenes iguales de la solución
de sulfato de cobre y de la solución alcalina del tartrato de sodio y de potasio.
2. Preparación de la muestra – solución No.1: pesar 20 g de la muestra y disolverla en un
matraz aforado de 250ml con agua destilada, si se observan partículas sólidas dejarlas
decantar.
3. Ensayo Previo: en cinco tubos de ensayo agregar sucesivamente a, 2, 3, 4 y 5 ml de la
muestra azucarada antes preparada, añadir a cada tubo 5 ml de la solución de Fehling-
Soxhlet, calentar en una baño con agua hirviendo por unos tres minutos. Dejar
sedimentar el óxido cuproso y observar el color del líquido en cada tubo; notar cual
tiene el tinte de color azul más ligero.
Si no se observa en ninguno de los tubos una coloración azul, se debe volver a preparar
la solución No.1, utilizando la mitad del peso de la muestra anterior.
Para continuar con el análisis, se mide 20 veces el volumen de la solución No 1 con la
que se obtuvo el color azul más ligero, y se coloca en un matraz aforado de 100ml y se
completa a volumen con agua destilada (preparación de solución No.2).

20. 4. Análisis gravimétrico: en un vaso de precipitado de 250ml adicione 50ml del reactivo
de Fehling-Soxhlet y 50ml de la solución No.2 azucarada, cubrir el vaso con un vidrio
de reloj y calentar hasta el punto de ebullición por unos 4 a 5 minutos. Retirar de la
llama y agregar inmediatamente 100cm de agua destilada fría.
Luego filtrar sobre un papel de filtro previamente pesado y lavar el precipitado con
una tres porciones de 20 ml de agua caliente, luego con tres porciones de 10 ml de
alcohol al 70% y finalmente con dos porciones de 20 ml de éter etílico. Colocar en la
estufa a 120 oC por 15 minutos, dejar enfriar en el desecador y pesar.
Análisis
Calcular con el peso en miligramos del Cu2O, los miligramos de azúcares reductores como
glucosa que se están analizando por medio de las tablas de Munson y Walker (AOAC).
El contenido de cobre es proporcional al azúcar presente.

22.  Método volumétrico de Lane y Eynon
En el método de Lane y Eynon (1923) se hace reaccionar sulfato cúprico con azúcar
reductor en medio alcalino, formándose oxido cuproso, el cual forma un precipitado rojo
ladrillo. Este método utiliza azul de metileno como indicador, el cual es decolorado una vez
que todo el cobre ha sido reducido, lo que indica el fin de la titulación. Se fundamenta
también en la reacción de Fehling.
Reactivos:
1. Solución de Fehling A (34,639 g de CuSO4◦5H2O en 500 ml de agua)
2. Solución de Fehling B (173 g de tartrato de sodio y potasio, y NaOH en 500 ml de agua)
3. Azul de metileno (1%)
4. Solución patrón de glucosa al 1%
5. Solución diluida de glucosa (50 mg/ml), preparada a partir de la solución patrón de
glucosa (1%)
6. Solución de acetato básico de plomo al 30%
7. Oxalato de sodio o potasio en polvo
8. Solución de HCl 1:1
9. Solución de NaOH 6 N.

23. Procedimiento
Determinación de azúcares reductores
Tomar una alícuota de 25 ml, colocarla en un matraz aforado de 100 ml, aforar con
agua, mezclar bien y colocar la solución en una bureta. Colocar en una fiola de 250 ml 5 ml
de solución de Fehling A y 5 ml de solución de Fehling B. Añadir 2 o 3 gotas de solución
de azul de metileno. Diluir con aproximadamente 20 ml de agua destilada y agregar perlas
de vidrio.
Llevar a ebullición la solución de Fehling y agregar lentamente la solución de glucosa sin
dejar de calentar, hasta que desaparezca la coloración azul. En el momento en que
desaparece el color del indicador, en los bordes del fondo del matraz se puede observar
cierto tono rojizo.
Nota: durante todo el tiempo en que se añade la solución de glucosa, la solución de Fehling
debe mantenerse en ebullición.

24. PROCEDIMIENTO
Fehling A y Fehling B Tubos de ensayo con Fehling A (azul) Fehling A + B
y Fehling B (transparente)
Disolución de la muestra en agua Adición del reactivo Fehling a Se calienta la preparación
la muestra

25. Comienza a virar el color Fehling positivo (se precipita el óxido de Cu)
Fehling + Fehling -

27. Determinación de fibra
Se conoce como fibra o fibra dietética, al total de polisacáridos presentes en las plantas y
que son resistentes a la digestión por las enzimas del tracto gastrointestinal humano.
 Determinación de fibra cruda o Método de Weende (1.850)
Este método permite determinar el contenido de fibra en la muestra, después de ser
digerida con soluciones de ácido sulfúrico e hidróxido de sodio y calcinado el residuo; se
efectúa una extracción secuencial de los componentes que no forman parte de la fibra, y
posterior aislamiento del residuo insoluble (fibra cruda). La diferencia de pesos después de
la calcinación nos indica la cantidad de fibra presente.
Reactivos
- Solución de ácido sulfúrico 0.255N
- Solución de hidróxido de sodio 0.313N, libre de carbonato de sodio
- Antiespumante (ej. alcohol octil o silicona)
- Alcohol etílico al 95% (V/V)
- Éter de petróleo
-Solución de ácido clorhídrico al 1% (V/V)

28. Materiales y equipo
•Matraz de bola fondo plano, 600 ml, cuello esmerilado
•Unidad de condensación para el matraz
•Matraz Kitazato de un litro
•Embudo Buchner
•Crisol de filtración
•Conos de hule
•Papel filtro Whatman No. 541
•Pipeta de 500 ml
•Desecador
•Horno de laboratorio
•Mufla
Preparación dela porción de ensayo:
- Para productos con contenido de grasa menor de 2%, se trabaja directamente.
- Para productos con contenido de grasa mayor de 2%, desgrasar por método Soxhlet.

29. Preparación de la muestra:
• Productos líquidos o pastosos: se homogeniza la muestra agitándola con varilla de
vidrio o agitador por 15 segundos.
• Productos sólidos o semisólidos: se toman 3 porciones en puntos diferentes de la
muestra y se tritura en un mortero hasta obtener una mezcla homogénea.
•Productos en fase sólida y líquida: para productos de más de 30 días de producido, se
separa la fase líquida y se agita por 15 segundos, se trabaja con esta y se desecha la fase
sólida. Para productos con menos de 30 días de producido, se homogeniza la muestra
haciéndola pasar por una licuadora, retirando previamente las semillas u otras materias
que puedan interferir.
• Frutas frescas: dependiendo del tipo, se pican en pequeñas porciones, se muelen o
licuan.
• Frutas deshidratadas y especias: se muelen 3 veces o se pasan por una
licuadora, efectuándolo de forma rápida para evitar afectaciones de la muestra.

30. Método
1. Pese con aproximación de miligramos de 2 a 3 gramos de la muestra desengrasada y
seca. Colóquela en el matraz y adicione 200ml de la solución de ácido sulfúrico en
ebullición.
2. Coloque el condensador y lleve a ebullición en un minuto; de ser necesario adiciónele
antiespumante. Déjelo hervir exactamente por 30 min, manteniendo constante el
volumen con agua destilada y moviendo periódicamente el matraz para remover las
partículas adheridas a las paredes.
3. Instale el embudo Buchner con el papel filtro y precaliéntelo con agua hirviendo.
Simultáneamente y al término del tiempo de ebullición, retire el matraz, déjelo reposar
por un minuto y filtre cuidadosamente usando succión; la filtración se debe realizar en
menos de 10 min. Lave el papel filtro con agua hirviendo.
4. Transfiera el residuo al matraz con ayuda de una pipeta conteniendo 200ml de
solución de NaOH en ebullición y deje hervir por 30 min como en paso 2.
5. Precaliente el crisol de filtración con agua hirviendo y filtre cuidadosamente después
de dejar reposar el hidrolizado por 1 min.

31. 6. Pese rápidamente los crisoles con el residuo (no los manipule) y colóquelos en la mufla
a 550°C por 3 horas, déjelos enfriar en un desecador y péselos nuevamente.
7. Lave el residuo con agua hirviendo, con la solución de HCI y nuevamente con agua
hirviendo, para terminar con tres lavados con éter de petróleo. Coloque el crisol en el
horno a 105°C por 12 horas y enfríe en desecador.
Cálculos
A = Peso del crisol con el residuo seco (g)
B = Peso del crisol con la ceniza (g)
C = Peso de la muestra (g)
Contenido de fibra cruda (%)= 100((A - B)/C)

32. Determinación de Fibra por Detergente Ácido
Este método permite tener una aproximación del grado de digestibilidad de las fibras en el
alimento. La muestra es digerida por medio de cetil-trimetil-amonio en ácido sulfúrico y el
residuo es considerado como la fibra no digerible.
Reactivos
•Solución de detergente ácido al 1 % p/v. A un litro de agua agregar poco a poco 56 ml de
ácido sulfúrico concentrado, lleve la solución a un volumen final de 2 1 con agua y agregue
20g de Cetil-trimetil-amonio.
•Antiespumante Dekalin (decahidronaftaleno)
•Acetona
Materiales y Equipo
•Horno
•Matraces Erlenmeyer de 500 ml
•Mantilla de calentamiento
•Condensador de dedo frío
•Crisoles de filtración, porosidad 1

33. Procedimiento
1. Muela la muestra en un molino de martillos para que pase la malla de 1 mm.
2. Tome una submuestra y séquela durante la noche en un horno a 105°C.
3. Enfríe la muestra en un desecador.
4. Pese con aproximación de miligramos un gramo de la muestra seca y colóquela en un
matraz Erlenmeyer de 500 ml.
5. Adicione 100 ml de la solución de detergente ácido y 2 ml del antiespumante.
6. Coloque el matraz en la mantilla con el condensador instalado.
7. Lleve rápidamente a ebullición (3 a 5 minutos) y continúe el calentamiento por 2 horas.
8. Filtre el contenido del matraz por gravedad en un crisol previamente pesado.
9. Enjuague el matraz con agua destilada caliente y filtre.
10. Enjuague el contenido del crisol con 300 ml de agua destilada caliente. Use succión
débil (por vacío).
11. Enjuague el residuo con acetona y seque.
12. Coloque el crisol en el horno a 105°C durante 12 horas.
13. Enfríe dentro de un desecador la muestra e inmediatamente después determine el peso.
Cálculos
Contenido de Fibra (%) = 100 (W2/W1)
Donde
W1 = Peso de muestra (g)
W2 = Peso del residuo (g)

34. Determinación del contendido de fibra por el método de detergente ácido.

35. Determinación de Fibra por Detergente Neutro
Este método tiene la capacidad de separar los componentes nutricionales solubles. Tiene
limitaciones en su precisión cuando los valores de proteína son muy altos y los valores de
fibra son bajos.
Reactivos
•Solución detergente neutra. Agregue a un litro de agua destilada 30 mg de sulfato lauril
sódico USP, 18.61 g de etilendiamino tetra acetato disódico dihidrogenado
dehidratado, 6.81 g de borato de sodio decahidratado y 4.56 g del reactivo fosfato ácido
disódico anhidro. Agítese hasta disolver y mantenga el pH entre 6.9 y 7.1.
•Amilasa (Sigma A 1278) 2g en 90ml H2O mas 10 ml de etilenglicol.
•Acetona grado reactivo.
•Sulfito de sodio anhidro. Se usa únicamente en análisis de subproductos animales.

36. Materiales y Equipo
•Equipo de reflujo. Cualquier equipo estándar adecuado para el análisis de fibra.
•Crisoles de filtración en vidrio. Use crisoles de tipo alto, con porosidad gruesa y placa de
filtración de 40mm de diámetro con capacidad para 40 – 50 ml de líquido.
•Cuando los crisoles se obstruyen después de un uso continuo se prepara una solución
limpiadora de 20% KOH, 5% de Na3PO4 y 0.5% de EDTA de sodio que se hace pasar
caliente en sentido opuesto a través del crisol. Se debe de evitar el uso continuo de la
solución pues tiende a erosionar el vidrio.
Procedimiento
1. Pese aproximadamente 1 g de muestra molida para pasar el tamiz de 1 mm y
deposítela en un matraz de fondo redondo para iniciar el reflujo.
2. Agregue en orden 100 ml de detergente neutro a temperatura ambiente y 2 ml de
amilasa por muestra.
3. Caliente para que la solución hierva en 5 a 10 minutos; en el momento de iniciar la
ebullición reduzca la temperatura para evitar la formación de espuma. Ajuste la
temperatura para que la solución hierva suavemente y mantenga en reflujo por 60
minutos a partir del instante en que empieza a hervir.

37. 4. Agite el matraz para suspender y decante la muestra en un crisol previamente pesado
y preparado para succión al vacío. Pase toda la muestra al crisol utilizando un
mínimo de agua caliente (80°C) para el lavado del matraz. Afloje con cuidado la capa
de muestra en el fondo del crisol sin removerla y agregue agua caliente, repitiendo
el lavado varias veces. Finalmente lave dos veces con acetona sin remover la muestra
del filtro y seque.
5. Seque los crisoles a 105°C durante 12 h y péselos en caliente (esta operación no
debe durar más de 30 seg).
6. El residuo de fibra recuperado se registra en términos de paredes celulares.
7. Calcule el contenido celular (material soluble) substrayendo este valor de 100.
Cálculos
a. Paredes celulares (%) en “base seca” o “como se ofrece”. 100((peso del crisol +
paredes celulares) - (peso del crisol))/peso de la muestra.
b. El porciento del contenido celular se calcula substrayendo de 100 el % de paredes
celulares.
% contenido celular = 100 - % paredes celulares.

38. Determinación del contendido de fibra por el método de detergente neutro

39. MÉTODOS BIOQUÍMICOS
 Métodos enzimáticos
Estos métodos son los más eficientes debido a que el procedimiento analítico se asemeja
al proceso fisiológico de degradación de nutrientes que tienen lugar en el organismo
humano, en el cual participan enzimas. De ahí que los resultados obtenidos con la
aplicación de los métodos enzimáticos son más confiables y cercanos al valor real del
contenido de fibra dietética.
El análisis enzimático o análisis mediante el empleo de enzimas puede ser utilizado en:
La determinación de los sustratos de la reacción enzimática, siendo posible
determinar específicamente cada una de las sustancias de una mezcla sin necesidad de
separar. Para la cuantificación de sustratos se pueden utilizar dos métodos generales:
a. Métodos de cambio total, de equilibrio o de punto final.
b. Métodos cinéticos.

40. Algunas condiciones de incubación en los métodos gravimétricos enzimáticos.

41. Dependiendo del proceso que se siga una vez se han realizado las etapas de incubación
enzimática, se podrá determinar el contenido de fibra dietética soluble (FDS) o fibra
dietética total (FDT).
Al concluir la etapa de incubación enzimática, el extracto se filtra y el residuo sólido que
queda está constituido por la fibra dietética insoluble, mientras que los productos de
hidrólisis de las proteínas (aminoácidos y péptidos) y del almidón (monosacáridos y
disacáridos) estarán contenidos en el filtrado conjuntamente con la fibra dietética soluble.
En los métodos enzimáticos, además de eliminar la interferencia de los minerales (por
incineración), se realiza una corrección adicional para eliminar también las interferencias
por las proteínas no solubilizadas por la acción enzimática (proteínas no digeribles), las
cuales no se incluyen entre los componentes de la fibra dietética.
En esta corrección, se determina el contenido de proteínas (método Kjeldahl) al residuo
seco obtenido de la filtración del extracto. El valor de proteínas resultante se resta al
valor de fibra calculado.

42. Esquema analítico de determinación de FDI, FDS y FDT.

43. En el método de la AOAC sugerido por Prosky y colaboradores (1.984) para la
determinación de fibra dietética total, se mantiene la etapa de gelatinización inicial con
amilasa termoestable (15-30 min), pero las enzimas fisiológicas son reemplazadas por una
proteasa de B. subtilis (30 min) y aminoglucosidasa (30 min).
Esquema analítico de determinación de FDT

44. Determinación enzimática de glucosa y sacarosa en alimentos
Fundamentos
Aunque la glucosa puede determinarse por métodos químicos, estos en su mayoría carecen
de especificidad y no pueden distinguir la glucosa de otros monosacáridos. Tanto en
análisis clínicos como en la industria alimentaria se utilizan métodos enzimáticos para la
determinación de glucosa. Así la glucosa oxidasa es una flavoproteina altamente específica
que cataliza la oxidación de la glucosa aβ-D- gluconolactona, sin que ningún otro azúcar
natural reaccione en extensión apreciable.
GOD
C6 H12 O6 + O2 C6 H10 O6 + H2 O2
Esta reacción en la que se consume oxígeno podría seguirse manométricamente o mediante
un electrodo de oxígeno. Sin embargo, para poder seguir el curso de esta reacción
espectrofotométricamente es necesario acoplar a la misma una segunda reacción
enzimática indicadora adecuada. Para la determinación colorimétrica de glucosa por el
método de la oxidasa, se añade al medio peroxidasa de rábano silvestre (HRP), que elimina
el peróxido de hidrógeno a medida que se forma, a la vez que se genera un colorante
adecuado según el siguiente esquema de reacción:
H2 O2 +Aceptor de oxígeno Producto coloreado+ H2 O
(DH2) (D)

45. MATERIAL, REACTIVOS, INSTRUMENTACIÓN
a. Instrumentación
− Espectrofotómetro monohaz Spectronic 20 con cubetas de 1 cm de paso de luz.
b. Material
• 4 matraces de 100 ml
• 8 matraces de 50 ml
• 1 vaso de 250 ml, 2 vasos de 100 ml
• 1 embudo, papel de filtro, vidrio de reloj.
• Cronómetro
c. Reactivos
Reactivo Trinder: Disolución que contiene todos los reactivos necesarios para la
determinación de la glucosa por el método propuesto en las concentraciones que se
indican a continuación:
•4-aminoantipirina 0,3 mmol/L
•Fenol 8,5 mmol/L
• Glucosa oxidasa (GOD) obtenida de Aspergillus Niger 10 U/mL
• Peroxidasa de rábano silvestre (Horseradish peroxidase, HRP) 0,3 U/mL

46. Estos reactivos, en las cantidades adecuadas, se suministran en una disolución reguladora
de pH 6,6 lista para su uso. Esta disolución debe almacenarse en botellas color topacio y
en el refrigerador. Si se mantiene entre 2 –8 ºC la disolución estable durante 2 meses.
Disolución de invertasa 100 U/ml en tampón de citrato 0,1 M de pH 4,6. Preparar 50 ml
Disolución patrón de glucosa 0,01 M
Disolución Carrez I. Disolver en agua 3,6 g de ferrocianuro potásico y llevar a 100 ml
Disolución Carrez II. Disolver en agua 7,2 g de acetato de zinc y llevar a 100 ml
PROCEDIMIENTO
Se empleará un método de tiempo fijo para la cuantificación de glucosa y sacarosa en una
muestra de zumo comercial.
Para la construcción de la línea de calibrado deben prepararse cinco disoluciones de
glucosa de concentraciones comprendidas entre 5×10-5 M y 5×10-4 M por dilución del
patrón de glucosa. Añadir a la cubeta del espectrofotómetro 1 mL de reactivo Trinder y
250 µL de patrón, mezclar e incubar exactamente 5 minutos a temperatura ambiente.
Medir a continuación la absorbancia de la mezcla de reacción a 505 nm frente a un blanco
de reactivos.

47. Para la determinación de glucosa y sacarosa en la muestra, esta se diluirá con agua en la
proporción adecuada según el contenido de glucosa y sacarosa esperado. Las muestras
turbias deben tratarse con los reactivos Carrez y filtrarse. Para ello pipetear 2 ml de
muestra en un vaso que contenga unos 30 ml de agua, añadir 2,5 ml de disolución
Carrez I y 2,5 ml de disolución Carrez II. Filtrar, recoger cuantitativamente en un
matraz de 100 ml y llevar a volumen.
Para la determinación del contenido de glucosa, se procederá con la disolución diluida de
la misma manera que con los patrones de glucosa.
Para determinar el contenido de sacarosa se llevará a cabo en primer lugar su hidrólisis
enzimática a glucosa y fructosa (inversión) con invertasa. Para ello se toman 2 ml de la
disolución de muestra (con un contenido máximo de sacarosa de 1 g/L) y se mezclan
con 8 ml de la disolución de invertasa. Se incuban 15 minutos a 55 ºC. La suspensión fría
se filtra, se lava el filtro y se recoge cuantitativamente en un matraz aforado enrasando
con agua hasta la marca, realizando a continuación la determinación del contenido total
de glucosa según el procedimiento anteriormente descrito. El contenido de sacarosa se
obtiene por diferencia entre las concentraciones de glucosa obtenidas antes y después de
la inversión enzimática. Expresar el contenido de glucosa y sacarosa en la muestra en
g/L.

48. Espectrofotómetro monohaz Spectronic