Se aplicará esta técnica para separar una mezcla de Azul de metileno-Anaranjado de metilo, también se observará la acción de las resinas de intercambio iónico, las cuales deben ser activadas en día anterior.

1. Cromatografía en
columna, en capa
fina y sobre papel
Sexta práctica de Lab. Química Orgánica
Se aplicará esta técnica para separar una mezcla de Azul me metileno-Anaranjado de metilo,
también se observará la acción de las resinas de intercambio iónico, las cuales deben ser activadas
en día anterior.
Cap. 6-7. Química Orgánica 2010 II_UNALM
Autor: Eltsyn Jozsef Uchuypoma

2. CROMATOGRAFÍA
1. Introducción
La cromatografía, es la técnica de análisis químico utilizada para separar sustancias
puras de mezclas complejas. Esta técnica depende del principio de adsorción selectiva
(no confundir con absorción). La cromatografía fue descubierta por el botánico ruso, de
origen italiano, Mijaíl Tswett en 1906, pero su uso no se generalizó hasta la década de
1930. Tswett separó los pigmentos de las plantas (clorofila) vertiendo extracto de hojas
verdes en éter de petróleo sobre una columna de carbonato de calcio en polvo en el
interior de una probeta. A medida que la disolución va filtrándose por la columna, cada
componente de la mezcla precipita a diferente velocidad, quedando la columna marcada
por bandas horizontales de colores, denominadas cromatogramas. Cada banda
corresponde a un pigmento diferente.
2. Objetivo
• Aplicar la técnica de cromatografía en columna para separar una mezcla de azul de
metileno – anaranjado de metilo.
• Trabajar con placas de cromatografía en capa fina (c.c.f.) y de papel de dimensiones
particularmente menores. Para el analizar la relación de frente. Y observar el
comportamiento en esta técnica cromatografía.
• Conocer que es la electroforesis y sus aplicaciones en la biología.
• Diferenciar entre la c.c.f. y la de papel.
• Interpretar los valores de Rf
3. Metodología
A. CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
Materiales:
• Algodón
• Columna cromatografía
• Etanol (solvente)
• Silicagel
• Mezcla (azul metileno + anaranjado de metilo)
Procedimiento:
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3. B. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (THIN LAYER
CHROMATOGRAPHY)
Materiales:
• Dos placas portaobjetos.
• Mezcla de silicagel y cloroformo
• Mezcla de anaranjado de metilo + azul de metileno
• Anaranjado de metilo
• Recipiente (cámara de desarrollo)
• Solvente (1 propanol – butanona – agua)
Procedimientos:
A. PREPARACIÓN DE LA COLUMNA:
•Introducir un trozo de algodón hasta el fondo de la columna.
•Adicionarle etanol hasta las3/4 parte.
•Agregar una suspesion formada al agitar 10g de Silicagel y etanol.
•Abrir la llave hasta que la altura del solvente sea de 1cm por encima de la
superficie del adsorbente.
B. SIEMBRA:
•Depositar 20 gotas de la mezcla a separar.
•Abrir la llave hasta que todo el colorante sea absorbido por la fase fija.
C. ELUCIÓN:
•Ir adicionando mas etanol hasta que se eluya todo el naranja de metilo.
•Cambie de recipiente y eluya el azul de metileno; agregando el solvente agua
acidulada para eluir este segundo coloarnate.
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4. Preparamos las placas
introduciendo 2 láminas
portaobjetos (juntas) en una
mezcla (Silicagel + Cloroformo).
Dejar secar y señalar 2 puntos
(equidistantes de los bordes
entre sí) en una línea imaginaria
a 1cm del borde inferior.
En uno de los puntos se siembra
3 gotas de la mezcla (anaranjado
de metilo + azul de metileno) y
el otro anarajando de metilo.
Introducir la placa en una
cámara de desarrollo que
contiene la fase móvil (1-
propanol-butanona-agua
4:1:1)
Cuando el solvente está por llegar al
borde superior de la plaquita, retire
está, marque el frente del solvente,
dejar secar y calcule el Rf.
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5. C. CROMATOGRAFÍA SOBRE PAPEL
Materiales:
• Tubo de ensayo
• Papel filtro
• Azul de metileno
• Mezcla ( Azul de metileno y anaranjado de metilo)
• Tubo capilar
Procedimiento:
1. Sobre un papel filtro.
Establecer dos puntos
equidistantes (de los
bordes entre sí) que se
encuentre en una línea
imaginaria a 1cm del
borde inferior.
2. Señalar los puntos
de siembra. En uno
de los puntos con un
tubo capilar,
depositar 3 gotas de
la muestra, en la otra
3 gotas del azul de
metilo.
3. Dejar unos minutos
para que se evapore el
solvente de siembra.
Introducir la tira en un
tubo de ensayo que
contiene la fase movil
(1- propanol -
butanona).
4. Cuando la fase
móvil haya ascendido
unos 8-10 cm, retire
el papel y marque el
frente del solvente.
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6. 4. Conclusiones
• En la cromatografía en columna observamos que la cromatografía se basa en la
diferencia de velocidad con que se desplazan los componentes de una mezcla de
compuestos que se encuentran entre dos fases en íntimo contacto. El azul de
metileno que es mas polar queda retenido y se necita un solvente mas polar
como el agua acidulada para su adsorción; mientras que el anaranjado de metilo
es menos polar por lo que sale más rápido y solo necesita de etanol debido a
que es menos polar para su disolución.
• En la cromatografía en capa fina (Thin Layer Chromatography) el uso de un
adsorbente eficiente como el Silicagel que se aplica en al portaobjetos formando
una capa delgada y uniforme; esto hace de la c.c.f. un método versátil, sensible,
rápido y eficiente. La distancia recorrida por el anaranjado de metilo es 1cm y
la distancia recorrida por la mezcla (naranja de metilo + azul de metileno) es
2cm.
• En la cromatografía sobre papel, se da el fenómeno de adsorción. Se utiliza el
papel filtro como soporte de la fase fija (que puede ser normalmente el agua que
contiene en un 22% u otro líquido con el que se ha impregnado el papel). Y la
fase móvil es (1-propanol-butanona-agua). La relación de frente respecto al azul
de metileno fue de 2,2/8; y la relación de frente de la mezcla fue de 2,6/8.
5. Bibliografía
• Lederer E. y Lederer M. Cromatografía: Revisión de sus principios y
aplicaciones. Editorial EL ATENEO. Buenos Aires. Argentina.
• Harris D.C., Análisis Químico Cuantitativo, 2° edición. Editorial Reverté.
España. 2001
• Campbell N., Mitchell L. y Reece J., Biología conceptos y relaciones. 3°
edición. Editorial Prentice Hall. México.
CUESTIONARIO 1
1.- ¿Cuál es la principal utilidad de la cromatografía en columna?
La importancia de esta técnica radica en:
Podemos separar mezclas, por adsorción, partición y separación iónica.
Además esta técnica se realiza en forma descendente
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7. 2.- ¿Qué fenómenos físicos intervienen en una columna cromatografía que utiliza
silica gel como fase fija?
• Adsorción
• Desorción
• Dilución
• Solubilidad
3.- ¿Cuáles son las principales diferencias entre el HPCL y una columna
cromatografía simple?
• La cromatografía HPLC es más eficiente y de resolución que la de columna simple.
• En la cromatografía de columna simple se pude separar mezclas por adsorción,
reparto, intercambió iónico.
• En cromatografía HPLC se pude usar distintos tipos de relleno de la columna:
• Adsorbentes de distinto grado de polaridad materiales no polares, resinas de
intercambio iónicos soportes de selección por tamaño molecular y otros materiales
especiales.
• Además la cromatografía HPLC puede ser automatizada, pero esta implica un costo
muy elevado.
4.- ¿Cuál es el principal factor que hace que la HPLC sea mucho más eficiente que
una columna cromatografía simple?
La eficiencia de la columna cromatografía HPLC se debe a que la fase estacionaria está
formada por partículas esféricas muy pequeñas y de tamaño uniforma. Así, se usan a
menudo micro esferas con un tamaño de 5 a 10 micrones
5.- Estamos operando una columna cromatografía usando como absorbente silica gel
y casi todos los compuestos se han eluido, excepto un compuesto que no es eluido con
este solvente ¿Qué cambios introducirá para poder eluirlo?
Si el solvente elegido no consigue eluir todas las sustancias de la mezcla es recomendable
agregar 2 ó 3 gotas de solventes de distinta polaridad, que resultan ser más eficientes que
solventes puros.
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8. 6.- ¿Como se puede trabajar con sustancias incoloras en una columna cromatografía,
sino es posible localizar las sustancia dentro de la columna?
Podemos realizar el análisis del eluato por cromatografía en capa fina o sobre papel, por lo
que se hace necesario el uso de un revelador para la localización de las sustancias.
7.- ¿que tipo de cromatografía utilizara para eliminar sales minerales que están
contaminando una muestra de cafeína?
Usaremos la cromatografía de intercambio iónico.
8 - ¿Que es un colector de fracciones y cuál es su principal utilidad?
Es un instrumento que se usa para el análisis del eluato al final de la cromatografía.
El colector de fracciones nos permite un alto grado de automatización de nuestro sistema de
separación cromatografía, aumentando la precisión, el rendimiento así como la comodidad
de funcionamiento.
9 - ¿Qué diferencias encuentra usted entre la cromatografía de gases y la
cromatografía en columna?
Una de las diferencias seria que la cromatografía en columna se hace con fase fija en estado
solidó o líquido a cambio la cromatografía de gases se realiza con fase fija necesariamente
tiene que ser un gas.
Además la cromatografía en gases se realiza ah una temperatura superior a la del medio
ambiente.
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9. 10 - ¿Que son las resinas de intercambio iónico y cuál es su utilidad?
Son sustancias insolubles con un alto peso molecular que tienen grupos iónicos en su
molécula que pueden ser intercambiados cuando están en una solución que tenga sales. Al
entrar en contacto con la solución cambia su ion (H+) por un catión de la solución y su
(OH-) por un anión de la solución.
CUESTIONARIO 2
1. ¿Qué entiende Por Rx?
Las reacciones son procesos por los cuales una o más sustancias se transforman en otras
cuyas propiedades son diferentes. Para que exista una reacción debe existir una sustancia
que reacciona y otra que se transforma.
Generalmente, se puede decir que ha ocurrido una reacción si se observa que al interactuar
los "supuestos" reaccionantes se da la formación de un precipitado, algún cambio de
temperatura, formación de algún gas, cambio de olor o cambio de color durante la reacción.
2. ¿Cuáles son las diferencias entre la c.c.f. y la de papel?
Cromatografía en Capa fina Cromatografía en Papel
Uso de portaobjeto Uso de papel filtro
Cámara de desarrollo Tubo de ensayo
Uso de silicagel + Cloroformo Solo uso de las muestras
3. Cite algunas aplicaciones de la cromatografía en su especialidad
La cromatografía es un método que sirve para hacer análisis cualitativos de tierras y
compostas y que puede ser realizado en cualquier lugar a bajo costo y de forma rápida.
Separación de pigmentos vegetales mediante cromatografía en papel.
4. Interprete los valores de Rf 0.05; 0.6 y 0.98
Rf: 0.05 = La distancia recorrida por la sustancia es la 20ava parte de la distancia
recorrida del solvente.
Rf 0.6 = La diferencia de las distancias recorridas entre las sustancia y el disolvente es
mínima y cercana.
Rf 0.98 = La distancia recorrida por la sustancia es cercana a la del disolvente.
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10. 5. Introduciría algún cambio cuando se tiene un Rf. de 0.05, ¿por qué?
Al tener un Rf de 0.05 no introduciría ningún cambio, ya que la distancia entra la
sustancia y el disolvente es amplio y así podríamos identificar mejor la muestra.
6. Explique algún método para localizar las bandas de adsorción cuando se trabaja
con sustancias incoloras en una columna.
PRIMER METODO:
Adición de indicadores coloreados
Graff y Skau han coloreado una columna de magnesia pesada con rojo de fenol, como
método para seguir la separación de mezclas de ácidos grasos de la cadena larga.
Criddle y Le Tourneau describieron un método con un indicador fluorescente para la
determinación de hidrocarburos en el petróleo; la muestra que contiene trazas de colorantes
fluorescentes, se cromatografía sobre silicagel, con alcohol como agente deslizante. Los
componentes de la muestra se disponen en la columna según su adsorbilidad, primero las
parafinas, después las olefinas, a continuación las aromáticas y, finalmente los alcohólicos.
Los límites entre las zonas se visualizan con luz ultravioleta por los colorantes
fluorescentes, y la composición de la muestra ser establecida midiendo las zonas cuya
longitud es proporcional a la concentración de los componentes de la muestra.
SEGUDO METODO:
Técnica de la franja
Este método, propuesto por Zechmeister, consiste en pintar una franja delgada de un
reactivo adecuado, con un pincel, a lo largo de la columna después de que ha sido extraída
del tubo. Bell demostró la posición la posición de los azucares metilados sobre una
columna de silicagel, aplicando una solución alcohólica de naftol seguida por acido
sulfúrico concentrado (reacción de Molisch).
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11. 7. ¿Qué es la “electroforesis” y cuál es su principal aplicación en los compuestos
biológicos?
La electroforesis es la migración de iones existentes en una disolución por acción de un
campo eléctrico. Los cationes se mueven hacia el cátodo y los aniones hacia el ánodo.
A. Electroforesis capilar: separación de una mezcla en sus componentes usando
un campo eléctrico intenso, impuesto entre los dos extremos de un tubo capilar
estrecho lleno de la disolución de electrolito.
B. Electroforesis capilar de gel: forma de electroforesis capilar en la que el tubo
se llena con un gel de un polímero, que sirve como tamiz de macromoléculas.
Las macromoléculas más grandes migran más lentamente a través del gel.
Aplicación en la Biología: la electroforesis se usa:
• Para hallar el numero relativo de aminoácidos en la proteína.
• Se usa para separar físicamente macromoléculas, proteína o ácidos
nucleícos; sobre la base de su carga eléctrica y tamaño.
• La electroforesis en gel separa las macromoléculas de ADN por tamaño,
resultando una serie de bandas en cada fila del gel. Cada banda consiste en
moléculas de ADN de un tamaño determinado. A menos que usted tenga un
gemelo idéntico, su ADN es diferenciable del de cualquier otra persona;
nuestra secuencia total de nucleótidos es única.
• Los genetistas podrían identificar rasgos singulares de la secuencia de ADN
y rasgos particulares de la secuencia de ADN que comparten los miembros
de una familia.
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