Cultivo de células stem de cordón umbilical humano.

1. OBTENCION Y CARACTERIZACION
OBTENCION Y CARACTERIZACION
DE CELULAS MESENQUIMATOSAS
DE CELULAS MESENQUIMATOSAS
DEL CORDON UMBILICAL HUMANO
DEL CORDON UMBILICAL HUMANO
Juan C. Munévar; J. Castellanos; M. Martínez; H Hurtado; G. Lafaurie.

2. Introducción
MESENQUIMA
Neoplasias
Ingeniería
Síndromes Tisular Trauma
Células Madre
Violencia

3. CORDON UMBILICAL Circulación feto placentaria
Epitelio Amniótico
Arterias
Adventicia
Vena
Gelatina de Wharton
 Estructuralmente el C.U.H. esta formado por Matriz
extracelular mucoide (M.E.C.), células mesenquimatosas,
células semejantes a fibroblastos, células musculares,
endotelio. Takechi y col, 1993

4. • Presencia de células con morfología similar al
fibroblasto que expresan colágeno tipo V y VII en
la gelatina de Wharton.
Nanaev y Col 1997, Rayynanen y Col 1993
• Cultivo in vitro de células semejantes a los
fibroblastos aisladas de la gelatina de Wharton.
Pelletier y col, 1986, McElreavey y col, 1991
• Revestimiento biológico en quemados; acelera la
cicatrización, favorece el control de
infecciones. Banerjee,
1987

5. Mesenquima.
Mesenquima.
• Células mesodérmicas multipotenciales indiferenciadas
• MORFOLOGIA ESTRELLADA
• EMBEBIDAS EN UNA Sustancia
Fundamental Amorfa
• CAPACIDAD DE PRODUCIR EN
EL ADULTO TEJIDO DE
REPARACION DIFERENCIADO
NO SECRETAN UNA M.E.C. ESPECIFICA
••
NO SECRETAN UNA M.E.C. ESPECIFICA
Bruder S y col. J Cell Biochem. 64: 278- 94 (1997)

6. Materiales y Métodos
Consentimiento informado
Cultivo Primario
Primer Subcultivo
Segundo Subcultivo

7. Inmunocitoquímica FGFR3
Permeabilización
Anti FGFR3 Ig G anticonejo
Coloración Revelado

8. Inmunocitoquímica BrdU
BrdU
HCL Bórax
Permeabilizar Anti BrdU AcMo 2ª
Coloración Revelado

9. Resultados
Resultados
Gelatina de Wharton Inmunohistoquímica.
H.E. 100 x anti FGFR 3. 400 x

10. CULTIVO PRIMARIO PRIMER SUBCULTIVO
SEGUNDO SUBCULTIVO

11. Expresión de FGFR 3
Expresión de FGFR 3
en cultivos de C.U.H.
en cultivos de C.U.H.
Control
Núcleo celular
Núcleo/Citoplasma

12. Incorporación BrdU
Incorporación BrdU
Control

13. Cinética celular
COMPARACIÓN ENTRE CULTIVOS EN EL MARCAJE
CON BrdU
NEGATIVOS SEGUNDO
SUBCULTIVO%
PRIMER
SUBCULTIVO%
POSITIVOS CULTIVO PRIMARIO%
0 20 40 60 80 100

14. Inmunocaracterización
COMPARACIÓN ENTRE CULTIVOS EN EL
MARCAJE DEL FGFR3
80
60
40
20
0
NUCLEO CITOPLASMA
PRIMARIO % PRIMER SUBCULTIVO % SEGUNDO SUBCULTIVO %

15. Discusión
• Alta expresión del FGFR3, en el conjunto
núcleo / citoplasma (73,9 %). La distribución
de la expresión en el núcleo fue
aproximadamente cuatro veces mayor. En el
citoplasma la expresión fue demasiado baja.
• Cuando se compararon los tres cultivos
(primario, primer y segundo pasajes) se
encontró una tendencia similar.

16. Discusión
• La tasa de síntesis de ADN fue bastante baja
(19,07%) en los cultivos primarios, esto
concuerda con la baja capacidad de
proliferación que caracteriza a las células
mesenquimatosas indiferenciadas.
Pelletier y col, 1986.
en
• Se podría decir que general las células del
cultivo primario aisladas del cordón umbilical
humano no poseen una alta tasa replicación.

17. Discusión
♦ Aumento de la proliferación celular en el primer
pasaje de cultivo celular (45%)
♦ Inmunomarcaje con FGFR-3.
- 2 tipos de marcaje predominantes
- Nuclear y núcleo/citoplasma.
♦ Según la literatura las células FGFR-3 + son
precursoras (¿precondrocitos?)
Robinson D, Zvi Nevo, Clin Orthop. 1999

18. Conclusiones
• Distribución del FGFR3 (Núcleo/Citoplasma)
• Baja tasa de replicación
• Las células aisladas del C.U.H. se pueden
considerar precursoras conjuntivas.
• Las células mantienen el estado de diferenciación
durante los subcultivos.
• ¿Existirían diferentes estadios de diferenciación o
actividad celular in -vitro?
• Estudios adicionales para reafirmar esta posición
utilizando por ejemplo factores solubles que
estimulen la diferenciación.