1. Estudio comparativo de dos
técnicas para la detección y
tipificación del Virus del
Papiloma Humano
Genómica Clart Papillomavirus 2 y
Cervista™ HPV HR

2. EL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO (HPV)
De la família de los Papovirus: virus pequeños de 55nm de diámetro,
sin envoltura de DNA y con una cápside icosaédrica compuesta de 72
capsómeros que envuelven el genoma. Poseen doble cadena circular
que puede integrarse en el material genético de las células a las que
infecta.

4. La infección por HPV puede
NO SER FORMAR CONDUCIR A
EVIDENTE CONDILOMAS NEOPLASIAS
La infección por
El cáncer de cuello
HPV no ocasiona
Los HPV tipos 6 y 11 uterino está provocado
ninguna reacción
producen un intenso por una infección
celular inflamatoria
ensanchamiento de la persistente del HPV de
en la citología, pero
zona de cornificación
es posible que exista alto riesgo,
superficial que no tienen
una reacción especialmente de los
ningún potencial
simultánea de este tipos 16 y 18.
precanceroso.
tipo por otras
razones.

5. Carcinogénesis controlada

6. Carcinogénesis descontrolada

7. Tipos de virus

8. Tipos de virus
- La actual clasificación se basa en la comparación de la
secuencia de ADN de E6, E7 y L1 con la misma de todos los
VPH conocidos. Una homología inferior al 90% supone un nuevo
tipo, mientras que una superior al 90%, un subtipo del tipo
anteriormente descrito.

9. CAMBIOS CITOLÓGICOS ASOCIADOS
La infección por el HPV suele asociarse a los cambios o
anomalías de las células escamosas de bajo grado (L-SIL):
- Células escamosas maduras con forma poligonal
- Núcleos aumentados 3-4 veces el tamaño del núcleo de una célula intermedia con
ligera variación en tamaño y forma.
- Una interpretación de LSIL/HPV requiere cavitaciones citoplasmáticas
acompañadas de la morfología atípica descrita anteriormente.

10. Las células basales infectadas maduran durante su migración transepidérmica hasta formar células superficiales.
En el estadio de células intermedias y superficiales son segregados fuera del núcleo productos metabólicos virales
que dañan el citoplasma, por lo que se forman halos perinucleares irregulares.

11. Protocolo de cribaje del HPV
Las directrices para el diagnóstico precoz del cáncer de cuello
uterino recomiendan analizar la presencia de tipos HPV de alto
riesgo junto con la citología.
Las recomendaciones principales de las directrices de práctica
profesional incluyen:
1) el diagnóstico precoz de mujeres de más de 30 años
2) tratamiento de mujeres de más de 20 años con ASC-US.

13. CERVISTA HPV HR
El Cervista TM HPV HR es una prueba de diagnóstico cualitativo in vitro para
la detección de ADN de los 14 tipos de HPV de alto riesgo basada en la
amplificación de señal.

14. Finalidad de la prueba
1. Guiar el tratamiento de la paciente junto con la citología cervical en mujeres mayores
de 30 años.
2. Determinar la necesidad de realizar una colposcopia en pacientes cuyos resultados de
la prueba de Papanicolaou son células escamosas atípicas de significado indeterminado
(ASC-US).

15. Principios del protocolo
Cervista TM HPV HR es una prueba de diagnóstico cualitativo in
vitro para la detección de ADN de los 14 tipos de HPV de alto
riesgo, entre los que se encuentran los siguientes: 16, 18, 31, 33,
35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 y 68.
La prueba utiliza la química Invader, un método de amplificación
de señal para la detección de secuencias de ácido nucleico
específicas. El método usa dos reacciones isotérmicas: una
reacción primaria que se realiza en la secuencia de ADN diana y
una reacción secundaria que produce una señal fluorescente.

18. Tipos de muestra
La técnica de Cervista
se realiza con las
muestras
cervicouterinas que se
recogen en el vial con
la solución
PreservCyt, el sistema
de conservación de
ThinPrep para
pruebas de
Papanicolaou.

19. Materiales

20. Reactivos no suministrados

21. Equipos

22. Equipos

23. Equipos

24. Equipos

25. PROTOCOLO
Extracción de DNA

26. Reactivos del kit Genfind

28. PROTOCOLO
Reacción invader

29. Reactivos para la reacción invader

30. HPV Oligo Mix
Tres mezclas de oligonucleótidos, que detectan los 14 tipos de
HPV agrupados según tipos víricos con secuencias de ADN
semejantes concretamente en las regiones L1, E5 y E6.
- HPV Oligo Mix 1: Oligonucleótidos con afinidad por los tipos HPV 51, 56 y 66
- HPV Oligo Mix 2 : Oligonucleótidos con afinidad por los tipos HPV 18, 39, 45,
59 y 68
-HPV Oligo Mix 3 : Oligonucleótidos con afinidad por los tipos HPV 16, 31, 33,
35, 52 y 58

31. Control interno y control negativo
- Los controles internos son oligonucleótidos que se unen al gen
histona humano 2 (H2be, HIST2H2BE) y producen una señal
semicualitativa del ADN genómico presente en la muestra.
-El control sin molde o control negativo está compuesto por
tRNA de levadura.

32. Colocación de los controles positivos y negativos, y de las
muestras, en una placa de 96 pocillos.

34. RESULTADOS
Lectura de la placa

36. GENÓMICA CLART
PAPILOMAVIRUS 2
El kit está basado en la amplificación de fragmentos específicos del genoma
vírico y su posterior hibridación con sondas específicas para cada tipo de HPV.

37. Principios del protocolo
- Detecta la presencia de 35 virus de HPV (6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43,
44, 45, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 62, 66, 68, 70, 71, 72, 73, 81, 82, 83, 84, 85 y 89)
- Amplificación de un fragmento de unos 450 pb dentro de la región L1 del virus por
tratarse de una secuencia que está altamente conservada entre los distintos tipos de
HPV
- Visualización del producto amplificado por PCR mediante microarrays de baja
densidad

40. Tipos de muestra
- Torundas o cepillos
- Suspensiones celulares en
viales de ThinPrep
- Tejido fijado en formol e
incluido en parafina.

41. Materiales

42. Equipos

43. Equipos

44. Equipos

46. PROTOCOLO
Pretratamiento

47. Pretratamiento

48. PROTOCOLO
Extracción, purificación y amplificación

49. Reactivos

52. PROTOCOLO
Visualización

53. Reactivos

54. Hibridación y conjugado

55. Revelado

56. Resultados
- El análisis de los microarrays se realiza de forma automatizada con SAICLART, el
software de procesamiento de microarrays de GENOMICA.
- Se detectan e interpretan automáticamente los genotipos presentes en la imagen.
- Los resultados del análisis son procesados por un lector con un software específico
que automáticamente detecta e interpreta los genotipos presentes, obteniendo un
informe de cada una de las pruebas.

60. Controles de calidad
Introducción de dos controles internos en el mismo tubo de reacción donde se analiza la muestra para eliminar
falsos negativos:
- Oligos que amplifican un fragmento del gen CFTR como control del ADN de la muestra .
- Oligos que amplifican un plásmido modificado como control de la reacción de amplificación.
Los dos controles internos se amplifican simultáneamente junto con el HPV en un único tubo de reacción.
- Oligos específicos de HPV como control de calidad de la extracción. Se añade a cada experimento un
control externo. La muestra debe haber sido testada anteriormente para controlar la calidad del DNA genómico,
pero no necesariamente debe ser HPV positiva.

61. CASOS REALES
Comparación entre las dos técnicas

63. Caso 1

64. Caso 2

65. VENTAJAS E
INCONVENIENTES
Cervista vs. Genómica

66. CERVISTA GENÓMICA
VENTAJAS - ELEVADA SENSIBILIDAD (L1, - ALTA ESPECIFICIDAD
E5,E6) - DETECTA HPV DE ALTO
- VALOR PREDICTICO Y BAJO RIESGO
NEGATIVO 99% - PUEDE HACERSE CON
- NO REACTIVIDAD CRUZADA BIOPSIAS,
CON HPV BAJO RIESGO SUSPENSIONES
- CONTROL HISTONA HUMANA CELULARES, TORUNDAS
2 O CEPILLOS
- ALTA REPRODUCTIBILIDAD
-RÁPIDA
INCONVENIENTES - NO DETECTA HPV BAJO - BAJA SENSIBILIDAD
RIESGO - FALSOS NEGATIVOS
- REACTIVIDAD CRUZADA CON
HPV RIESGO DESCONOCIDO
- FALSOS NEGATIVOS POR
NIVELES BAJOS DE INFECCIÓN
- CASOS "BORDERLINE"
- SOLO MUESTRAS THINPREP

67. CERVISTA GENÓMICA
EXTRACCIÓN PERLAS MAGNÉTICAS COLUMNA
MARCAJE DEL DNA REACCIÓN DE AMPLIFICACIÓN PCR QUE MARCA EL
VÍRICO QUE MARCA EL DNA VÍRICO DNA VÍRICO CON
CON MOLÉCULAS BIOTINA
FLUORESCENTES
VISUALIZACIÓN LECTOR DE FLUORESCENCIA TUBOS DE ARRAY CON
SONDAS

68. OTRAS TÉCNICAS DE
DETECCIÓN DEL HPV

69. -Pruebas de HPV (captura de híbridos II, PCR de consenso,
Amplicor Human Papillomavirus Test)
-Genotipado de HPV (genotipado con PCR de consenso,
microarrays, PCR específica, genotipado con captura híbrida)
- PCR a tiempo real
- Transcripción de ARNm
-Determinación de oncoproteínas por IHQ
-Determinación de p16INK4a
-Cribado con citología
-Cribado con prueba de HPV

70. CONCLUSIÓN