Breve descripción visual de la técnica de citometría de flujo y los parámetros mas importantes a tener en cuenta

1. Introducción a la Citometría de Flujo
12/3/2015

2. Método analítico por el que se mide la emisión de múltiples
fluorescencias y la dispersión de luz (light scatter) de células
o partículas microscópicas, alineadas secuencialmente
mediante una corriente líquida laminar, cuando son
presentadas de una en una y a gran velocidad (hasta miles
de células/segundo) frente a un haz de luz láser de longitud
de onda adecuada

3. Qué se puede medir con un Citometro ?

4. Parámetros Biológicos en Citometría de Flujo

5. Cómo funciona un Citometro ?

6. La muestra es inyectada a presión en el centro de un fluido
envolvente laminar estable que se mueve a gran velocidad
ordenando a las células que circulan una a una frente a la
fuente de excitación
Flujo de muestra: Enfoque hidrodinámico

7. Sistema de iluminación: Láser

8. Sistema de iluminación: Filtros ópticos

9. Forward Scatter Detector
• Es un fotodiodo de sílice
• La luz dispersada frontalmente es muy intensa, por lo cual no se requiere
un PMT
• Un fotodiodo produce corriente cuando es expuesto a la luz

10. •Los detectores para Side Scatter y para fluorescencia son Fotomultiplicadores PMTs:
fotocatodo, dinodo y anodo
•El fotocatodo es de un material fotosensible que emite electrones cuando es expuesto a
la luz
•Un foton incide sobre el fotocatodo, los electrones del fotocatodo son acelerados en un
campo eléctrico hasta el primer dinodo. El dinodo emite más electrones que son
acelerados hasta el segundo dinodo, el cual emite incluso más electrones para pasar por
la cadena de dinodos hasta el anodo (etapas fotomultiplicadoras).
Fotomultiplicadores
•La cantidad de electrones que cada dinodo emite está determinada por el
potencial entre los dinodos. El potencial aplicado al conjunto del PMT es el Voltaje
del PMT
•A mayor voltaje del PMT mayor es la sensibilidad del detector
•Ajustamos el voltaje en función de la necesidad de sensibilidad de la muestra

11. Procesamiento de la señal

12. Procesamiento de la señal

13. •Cada señal (pico o área) se integra
•Se amplifica: lineal o logarítmicamente
•Los citómetros de flujo amplifican las señales
en un rango de valores entre 0 y 10 voltios
antes de la conversión analógica-digital
t
v
Integración de la señal

14. Conversor analógico/digital
•Debido a que las señales analógicas sólo duran unos milisegundos,
han de ser convertidas en digitales para su almacenamiento y
posterior análisis en ordenadores. Esto se consigue gracias a los
conversores analógico-digital.
•Un conversor analógico-digital (o también ADC del inglés
"Analog-to-Digital Converter") es un dispositivo electrónico capaz de
convertir una señal analógica de voltaje en un valor de salida binario.
• El ADC establece una relación entre su valor de entrada (señal
analógica, en voltios) y su valor de salida (señal digital, en 2n bits), es
decir: voltios/ 2n bits.

15. Conversor analógico/digital
•En un ADC de 8 bits tenemos un valor de salida (canales) de 2n bits, es decir 28 =
256 canales.
•Supongamos que queremos convertir en digital una señal analógica amplificada
linealmente usando un ADC de 8 bits.
•En este caso tendríamos 256 canales para un rango de señal de 0 a 10 voltios.
•Por lo tanto la señal correspondiente a cada canal vendría definida por el ratio a
10V/256 canales, es decir 0,04 V (40 mV) por canal.
0 50 100 150 200 250
10 V1 mV
Channels
Log
1 V100 mV10 mV
0 50 100 150 200 250
10V
1V
100mV
Channels
Linear

16. Qué parámetros puedo medir con un Citometro?

17. • Luz dispersada frontalmente cuando el haz de un láser impacta en una
partícula.
• La señal de Forward Scatter es una estimación del tamaño de una partícula
Forward Scatter

18. Forward Scatter

19. Side Scatter
• Luz dispersada en todas direcciones cuando el haz de un láser impacta en
una partícula.
• La señal de Side Scatter es una estimación de la complejidad interna de
una partícula.

20. Side Scatter

21. Fluorescencia

22. Trigger Chanel

23. Análisis de Resultados

24. Representación Monoparamétrica:
histograma de Frecuencias

25. FluorescenciaNaranja
Fluorescencia Verde
Representación Biparamétrica

26. Representación Lineal o Logarítmica

27. Compensación

28. Compensación

29. Compensación

30. TÁNDEM DYES

31. WEB: ACEA Inspired to Advance Your Discovery
VIDEO: ACEA NovoCyte Video

32. MARCAS en EXCLUSIVA
para citometría de flujo