Citometría de-flujo-
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Citometria de flujo y analisis de cancer en la sangre
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- 1. La técnica de citometría de flujo como herramienta inmunológica y su aplicación en el diagnóstico clínico Zaida I. Feliciano Aida M. Vega Yainary Segarra David G. Mendoza Biol 4009 LB1 Dr. Anibal J. Valentín
- 2. Objetivos • Explicar la técnica de citometría de flujo • Aplicación de la técnica en LLA • Explicar la importancia de CMF en la detección LLA
- 3. Citometría de flujo • ¿Qué es la citometría de flujo? • Capacidad de medir múltiples párametro celulares • Técnica clásica utilizada. • Amplia utilidad en las ciencias.
- 4. Citometría de flujo Fluorocromos • Absorbe luz a una determinada longitud de onda y emite a una superior • Se utilizan unidos a anticuerpos específicos • Células en suspensión alineadas una a una frente a un haz luminoso • Información: ▫ Originada por la dispersión de la luz ▫ Generada por la emisión de la luz de los fluorocromos
- 5. Citómetro de flujo Partes fundamentales • Rayo láser • Sistema de flujo • Detectores lumínicos y fluorescentes • Sistema electrónico de registro de información
- 7. Análisis de datos • Histograma
- 8. Análisis de datos • Gráficos de puntos (Dot plots)
- 9. Análisis de datos • Gráficos de puntos (Fluorescencia)
- 10. Parámetros Analizados por Citometría de Flujo Rev. Inst. Nal. Enf. Resp. Mex. vol.17 no.1 México mar. 2004
- 11. Aplicaciones Clínicas • Diagnóstico basado en el análisis celular • Aplicaciones pronósticas • Evaluación y monitorización del tratamiento
- 12. Citometría de flujo en la evaluación de enfermedad mínima residual en leucemia linfoblástica aguda
- 13. Citometría de Flujo en la evaluación de EMR • EMR - cantidad pequeña de células malignas circulantes o en ganglios linfáticos. • Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) Resultado: cambios moleculares y celulares Expresan perfiles anormales de marcadores celulares
- 14. Marcadores moleculares • Combinación de marcadores moleculares que identifican los inmunofenotipos en pacientes con LLA Acta Pediátrica de México Volumen 33, Núm. 4, julio-agosto, 2012
- 15. Citometría de Flujo en la evaluación de EMR • Las células se incuban con los anticuerpos monoclonales adecuados. • Se reconocen los antígenos expresados (células leucémicas y células normales) • Expresión diferencial Acta Pediátrica de México Volumen 33, Núm. 4, julio-agosto, 2012
- 16. Acta Pediátrica de México Volumen 33, Núm. 4, julio-agosto, 2012
- 17. Aplicación de otros marcadores en la detección de EMR Marcadores utilizados para detecnción EMR Porcentaje de detección de LLA en células B TDT/ CD10/ CD19 78% CD10/CD20/CD19 64% CD34/CD38/CD19 56% CD34/CD22/CD19 46% CD19/ CD34/ CD45 22%
- 18. Aplicación de otros marcadores en la detección de EMR • TdT/ CD7/cyCD3b – para LLA-T • Permiten vigilar la presencia de EMR en cualquier fase. • Alta especificidad de detección de células leucémicas.
- 19. Importancia de CMF en la detección LLA • Método accesible. • Prueba específica • Cuantificación directa y precisa de las células leucémicas residuales • Identifica células muertas • Evalúa el estado de las células hematopoyéticas normales.
- 20. Conclusión • Técnica rápida, altamente sensible y específica • Permite la cuantificación directa y precisa de las células leucémicas residuales • Es posible realizarla en todos los casos estudiados
- 21. Referencias • Juárez-Velázquez R, Pérez-Vera P.Citometría de flujo en la evaluación de enfermedad mínima residual en leucemia linfoblástica aguda. Acta Pediatr Mex 2012;33(4):198- 206. • http://www.medigraphic.com/pdfs/iner/in-2004/in041g.pdf • Koh DN, Park M, Kim BE, Im HJ, Park CJ, Jang S y cols. Prognostic significance of minimal residual disease detected by a simplified flow cytometric assay during remission induction chemotherapy in children with acute lymphoblastic leukemia. Korean J Pediatr 2010;53(11):957-64. • http://www.medigraphic.com/pdfs/actpedmex/apm-2012/apm124g.pdf • Grimwade D, Vyas P, Freeman S. Assessment of minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Curr Opin Oncol 2010;22(6):656-63. • van der Velden VH, van der Sluijs-Geling A, Gibson BE, te Marvelde JG, Hoogeveen PG, Hop WC y cols. Clinical significance of flow cytometric minimal residual disease detection in pediatric acute myeloid leukemia patients treated according to the DCOG ANLL97/MRC AML12 protocol. Leukemia 2010;24(9):1599-606.
Notas del editor
- Es una molécula química que absorbe la luz a una determinada longitud de onda y emite a una longitud superior. Interacciona con la luz de excitación procedente del láser. Se utiliza unido a anticuerpos específicos (monoclonales) para antígenos de la célula. La cantidad de fluorescencia con la cual una célula se tiñe es proporcional a la cantidad de sitios de unión. Los fluorocromos ofrecen un método sensible para obtener información acerca de la estructura, función y vitalidad de las células. Son productos químico que al ser estimulados con fotones con longitud de onda comprendida entre determinados rangos emiten a su vez otro fotón de longitud de onda mayor. Existen dos modos de uso: Unión covalente del fluorocromo a moléculas que se unen específicamente a componentes celulares Reaccionan y se usan para marcar proteínas, lípidos u otras moléculas biológicas. Deben ser selectivos. Fluorocromos que varian sus características en función del microambiente que les rodea Se unen no cavalentemente a estructuras celulares Estos fluorocromos debido a su composición molecular se unen a determinados componentes celulares. Ciertos fluorocromos pueden ser empleados para estimar las propiedades del ambiente en el que se encuentran, puesto que varían su espectro de absorción o emisión en función de las características del microambiente que les rodea.
- El análisis basado en citometría de flujo es rápido y permite cuantificar con precisión una EMR; al mismo tiempo proporciona información del estado de las células hematopoyéticas normales. El número de anticuerpos combinados para la identificación de las células leucémicas y la estabilidad de los marcadores, son factores importantes para la confiabilidad de este abordaje. Cuadro 1 se resume la combinación de los marcadores que identifican los inmunofenotipos aberrantes más frecuentemente detectados en los pacientes pediátricos con LLA, acorde a la experiencia del hospital pediátrico St. Jude en Estados Unidos, para el estudio de EMR y su aplicabilidad. Al utilizar citometría de flujo, se aplican los marcadores existentes (Cuadro 1) sin que se afecte la sensibilidad del método. La elección de los marcadores específicos para cada paciente al momento del diagnóstico, dependerá de que sean característicos y expresen las células leucémicas en cada caso. Existen diferencias en la aplicabilidad de las diferentes combinaciones de marcadores, de tal forma que se pueden utilizar algunas con mayor frecuencia; por ejemplo, el marcador más utilizado en LLA-B pediátrica es el CD19/CD34/CD10/CD58, que se detecta con una frecuencia de 40% a 60% de los casos. Utilizar la tecnica de citometría de flujo ha sido muy beneficioso para los pacientes de LLA ya que permite saber en poco tiempo si el tratamiento es efectivo.
- Otros marcadores que se han utilizado para el estudio de EMR en LLA .EN el 2001 las edades entre ocho meses a 83 anos , se utilizaron esta combinacion de marcadores para detectar la linfocitos b afectados (leucemicos) . 264 pacientes Pero un estudio en el 2009 informaron que la combinacion de marcadores CD10/CD81/CD34/CD 19 fue muy bueno para detectar LLA de celulas B en un 75 %
- En otro estudio realcida en el 200 encontraron que pacientes entre las edades de 52 anos con una LLA de celulas T