Natural Killer -Población Linfocitaria Edgar Matos Benavides Médico Inmunólogo

1. IMPORTANCIA CLINICA DE
CUANTIFICACION DE CELULAS
NATURAL KILLER
SUBPOBLACION LINFOCITARIA
Dr. Edgar Matos Benavides
Médico Inmunólogo

2. Las células NK
participan activamente
en la defensa del
organismo frente a
infecciones,
principalmente de tipo
viral y frente al
crecimiento de células
tumorales.

3. DIFERENCIACIÓN DE LAS
CÉLULAS NK

4.  Las células NK, a diferencia de lo que
ocurre con los linfocitos de la
inmunidad adaptativa circulan en un
estado de activación parcial, listas
para penetrar y actuar en los tejidos
infectados en cuanto los macrófagos
den la alarma

5. Diferencias funcionales entre
Células NK y linfocitos T

6. FUNCION DE CELULAS NK

7. FUNCION DE CELULAS NK
 Hoy se sabe que las células NK mas
positivas para el CD56 (CD56bright)
poseen mayor capacidad para
producir citocinas que las células mas
débiles para esta molécula
(CD56dim).
 A su vez las células NK CD56dim
poseen mayor capacidad citotóxica
que las CD56 bright

8. RECEPTORES DE CÉLULAS NK
la acción final de las células NK
depende del equilibrio entre las
señales inhibidoras y
activadoras procedentes de sus
receptores de superficie.

10. Receptores de tipo activante
en células NK

11. Receptores de tipo
Inhibitorios en células NK

14. INMUNOPATOLOGIA DE LAS
CÉLULAS NK.
 Son de especial importancia en las
primeras fases de la infección,
especialmente frente a virus, de ahí
que cuando estas células no actúan
correctamente, el individuo se hace
más vulnerable a las infecciones
virales. Ejm HIV.

16. INMUNOPATOLOGIA DE LAS
CÉLULAS NK
 De igual manera ha podido ser
comprobado que las células NK
infiltrantes de tumores poseen menor
capacidad citolítica que las células NK
normales, probablemente por un
aumento de expresión de receptores
de tipo inhibidor.

17. INMUNOPATOLOGIA DE LAS
CÉLULAS NK
 Por otra parte una excesiva
capacidad citotóxica de las células
NK puede inducir estados de
pérdida de la tolerancia normal y
contribuir al desarrollo de
enfermedades de tipo autoinmune.

18. INMUNOPATOLOGIA DE LAS
CÉLULAS NK.

19. IMPORTANCIA CLÍNICA
 Se ha visto que las células NK,
pueden ser utilizadas en terapia
antitumoral.
 Para ello después de su extracción del
individuo y cultivo con iL-2, IL-12 o
IL-15, son posteriormente
reinyectadas en el enfermo en forma
de células LAK (citokyne activated
lymphocytes).

20. INMUNOTERAPIA

21. APLICACIÓN DE TUMINMUNE

22. MODELO DE
CONSENTIMIENTO
INFORMADO

24. INCREMENTO DE NK

25.  En enfermos con SIDA, también se
esta tratando de potenciar la
respuesta inmune innata y en
especial estas células NK, mediante
la administración de IL-2, con
resultados que son prometedores

26. SUBPOBLACIONES
LINFOCITARIAS

28. SUBPOBLACIONES
LINFOCITARIAS
 Objetivos: Establecer los Intervalos
de Referencia (IRs) de Linfocitos
CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+,
CD3+CD4+/CD3+CD8+, CD19+ y
CD56+, en adultos sanos de la
ciudad de Lima, Perú.

29. SUBPOBLACIONES
LINFOCITARIAS
 Métodos: Se emplearon criterios
basados en la guía (CLSI C28-A3),
318 muestras de donantes de sangre
aptos, con serología negativa a
marcadores de VIH, Hepatitis B,
Hepatitis C, Sífilis, HTLV,
Enfermedad de Chagas y Proteína C
Reactiva,

30. SUBPOBLACIONES
LINFOCITARIAS
 (121 mujeres y 197 varones, edad:
18-55 años). Los recuentos de las
Subpoblaciones Linfocitarias (SPL)
fueron realizados en un citómetro
de flujo de plataforma simple
(Cytomics FC500 MCL-Beckman
Coulter);

31. SUBPOBLACIONES
LINFOCITARIAS
Resultados:

35. INMUNODEFICIENCIAS
PRIMARIAS
Dr. Edgar Matos Benavides
Médico Inmunólogo

36. Para establecer el diagnóstico
de certeza de una IDP, se
necesitan dos factores:
Pensar en esta posibilidad
Contar con un laboratorio de
diagnóstico especializado

38. EVOLUCION DE DIAGNOSTICO
DE IDPS EN LATINOAMERICA
Leiva et al. J.Clin. Inmunol,27(1):101,2012

40. CITOMETRO
DE FLUJO
SECUENCIADOR

41. El sistema inmune tiene 2 tipos
de respuesta
TIEMPO DESPUES DE LA
INFECCION
INNATA

42. TIEMPO DESPUES DE LA
INFECCION
ADAPTATIVA

43. ANALISIS BASICO DE
INMUNODEFICIENCIAS
LINFOCITOS B LINFOCITOS
T
COMPLEMENTO PMN NK
•Cuantificación de
Inmunoglobulinas
•Determinación de subclases
de IG
•Deter Linfocitos B
•anticuerpos específicos
(vacunación pre / post)
anticuerpos Anti-
diphteria/tetanus
•anticuerpos anti-polisacárido
de neumococo
•Isohemaglutininas
Recuento de
Linfocitos Totales
Rx Tórax Lateral
Pruebas cutáneas de
hipersensibilidad
retardada
Determinacion de
CD3, CD4,CD8
OTROS
•Det de CH50
•Determinación C3
•Determinación. C4
•OTROS
•Neutrófilos
Absolutos
•NBT
•123 DHR
•Quimiotaxis
•Fenotipos
leucocitarios
(CD11a/CD18)
•Citometria
de flujo
CD!6
•CD56
•CD19

44. Clasificación de las IDPs Ejemplos
Clasificación de la Unión Internacional de Sociedades de Inmunologia (IUIS) 2011

45. Clasificación de las IDPs Ejemplos
Clasificación de la Unión Internacional de Sociedades de Inmunologia (IUIS) 201

48. Infecciones recidivantes de
las vías respiratorias
superiores y/o inferiores,
tales como: otitis, sinusitis,
neumonía, bronquitis.
Infecciones severas:
meningitis, sepsis
Infecciones recidivantes de
las vías respiratorias
superiores y/o inferiores,
tales como: otitis, sinusitis,
neumonía, bronquitis.
Infecciones severas:
meningitis, sepsis
Los gérmenes capsulados
de mayor relevancia
clínica son:
Streptococcus
pneumoniae,
Haemophilus influenzae,
Neisseria
meningitidis
Los gérmenes capsulados
de mayor relevancia
clínica son:
Streptococcus
pneumoniae,
Haemophilus influenzae,
Neisseria
meningitidis
Existen 90 serotipos
identificados por
tipificación capsular: 10
- 12 son responsables
del 80% de las
infecciones invasivas
Existen 90 serotipos
identificados por
tipificación capsular: 10
- 12 son responsables
del 80% de las
infecciones invasivas
23 VALENTE
1,2,3,4,5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V,
10A, 11A, 12F,14, 15B, 17F,
18C,19A, 19F, 20, 22F, 23F
y 33F
23 VALENTE
1,2,3,4,5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V,
10A, 11A, 12F,14, 15B, 17F,
18C,19A, 19F, 20, 22F, 23F
y 33F
CONJUGADA
4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y
23F + TT o TD
CONJUGADA
4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y
23F + TT o TD
VALORACION DE RESPUESTA INMUNE
HUMORAL

49. VALORACION DE RESPUESTA
INMUNE HUMORAL

50. VALORACION DE RESPUESTA
INMUNE HUMORAL

51. DEFECTOS EN LA RESPUESTA
INMUNE CELULAR O DE LT
 Hay que tomar en cuenta que la
biometría hemática completa o
hemograma normal, no descarta la
IDPs.
 Por lo anterior, el médico deberá
solicitar citometría de flujo
de algunas proteínas
celulares reportadas
como CD

61. DEFECTOS EN LA RESPUESTA
INMUNE CELULAR O DE LT
Para medir la función de los
neutrófilos la primera
prueba de laboratorio es la
prueba de nitroazul de
tetrazolium o NBT (del
inglés Nitroblue
Tetrazolium).

62. DEFECTOS EN LA RESPUESTA
INMUNE CELULAR O DE LT
Esta prueba determina
la habilidad de los
neutrófilos activados
para producir radicales
de oxígeno que
reducen al NBT a una
tinción azul insoluble,
que puede ser vista al
microscopio en los
neutrófilos.

63. DEFECTOS EN LA RESPUESTA
INMUNE CELULAR O DE LT
En neutrófilos, durante la
destrucción de los microorganismos
fagocitados, se produce la formación
de moléculas altamente reactivas
(ion superóxido y peróxido de
hidrógeno), en gran parte gracias a
la actividad catalítica de la NADPH
oxidasa, fenómeno denominado
estallido respiratorio (ER).

64. Oxigeno Molecular O2
Radical superoxido
O2-
H2O2
HOCl
OH-
Destruccion de
Bacterias y
hongos
fagocitado

65. RESULTADOS:
PMN (Eventos contados) MFI
Muestra basal: 5000 225
Muestra con 1,2,3 DHR: 5000 29
955
Muestra con estimulo PMA: 5000 993 441
NOI (Indice Oxidativo de los Neutrofilos): 33
Muestra
Normal
Muestra
Normal

66. PMN (Eventos contados) MFI
Muestra Basal: 5000 1 151
Muestra con 1,2,3 DHR: 5000 8 214
Muestra con estimulo PMA: 5000 11 827
NOI (Indice Oxidativo de los Neutrofilos): 1.4
Muestra de
Paciente con
EGC
Muestra de
Paciente con
EGC

67. 1. Las IDP son patologías que ameritan
mayor atención por los gobiernos y
las instituciones académicas y
asistenciales en el Perú.
2. El diagnóstico temprano y manejo
adecuado de las IDP resulta en una
mejora de la calidad de vida de los
pacientes afectados y en una
disminución de los gastos para el
sistema de salud.

68.  Estimular a LASID para el
establecimiento de una red de
laboratorios que realicen pruebas
diagnósticas no realizadas en el país

69. DIAGNOSTICO DE
INFERTILIDAD POR
CITOMETRIA DE FLUJO
Dr. Edgar Matos Benavides
Médico Inmunologo

70. La infertilidad es la
incapacidad de la pareja de lograr
una gestación que lleve al
nacimiento de un hijo, después
de un año de mantener
relaciones sexuales sin métodos
de planificación.

71. “La infertilidad es un
problema de pareja y no es
una enfermedad, sino
consecuencia de una o varias
enfermedades”

72.  Afecta 10-15 % de la población.
 1 de cada 6 o 7 parejas consultan
por esterilidad
 50 % de las parejas presentan un
factor masculino aislado o asociado
a un factor femenino
complementario
American Journal of Obstetrics & Gynecology 2012 Vol 234 ,45

73. Una pareja sana tiene el 20% de
probabilidad mensual de lograr
embarazo que al cabo de un año se
transforma en una probabilidad
acumulativa del 97%
100 PAREJAS EXPUESTAS A EMBARAZO
50 EMBARAZAN EN PRIMER SEMESTRE
30 EN EL SEGUNDO
20 DESPUES DEL AÑO
American Journal of Obstetrics & Gynecology 2012 Vol 234 ,45

74. ¿Cuando comenzar el estudio ?
 Luego de un año de relaciones
regulares sin ningún método
anticonceptivo
 Luego de 6 meses de búsqueda
en mujeres mayores de 35
años

76. PACIENTES QUE REQUIEREN
MANEJO POR INMUNOLOGIA
La siguiente tabla es una
prueba que determina
que pacientes requieren
de inmunoterapia.

79. CALIFICACION
1.- 0 a 5 puntos: Sin riesgo.
2.- 5 a 10 puntos: Riesgo leve
3.- 10 a 15 Puntos: Riesgo moderado
4.- > 15 puntos: Alto riesgo

80. PERDIDA GESTACIONAL
RECURRENTE DE ORIGEN INMUNE
Existen 5 categorías de problemas
inmunológicos que pueden causar
pérdidas recurrentes de la gestación,
falla en ciclos de IVF e infertilidad. La
categoría I es la menos severa y la
categoría 5 es la más grave. Sin
tratamiento un paciente en categoría
I presentará abortos recurrentes lo
cual puede activar otras categorías
como 2, 3, 4 o 5.

81. Categoría I
Compatibilidad al HLA como causa de pérdida
gestacional recurrente

82. Categoría 2
de Problemas Inmunológicos.Anticuerpos
antifosfolípidos (APA).
 Abortos recurrentes, fallas en IVF,
endometriosis y otras causas, pueden
inducir la formación de anticuerpos
contra los fosfolípidos.
 Los APA evitan la formación del
sincitiotrofoblasto lo cual retarda el
crecimiento del bebe produciendo
muerte fetal temprana hasta en un
97%

83.  de los casos, pero también puede
causar muerte fetal en etapas tardías
de la gestación.

84. Categoría 3
de problemas inmunológicos: Ac contra DNA

85. • Los anticuerpos contra DNA, histonas y
polinulceotidos pueden ser detctados en
una muestra de sangre.
• Los títulos por arriba de 1:40 son
significantes. Los patrones obtenidos son
reportados de la siguiente manera:
– Homogéneo:Atc contra SS-DNA y dd-DNA
– Nucleolar: Atc contra polinucleotidos.
– Moteado: Atc contra Histónas.

86. Categoría 4
Respuesta autoimmune a los antígenos
espermáticos.
• El 10 % de la mujeres con
problemas de infertilidad, falla
de implantación y perdidas
recurrentes del embarazo,
producen anticuerpos
espermáticos, Cuando esto
sucede , la pareja es incapaz
de concebir normalmente

87.  Cuando la mujer desarrolla
anticuerpos antiesperma estos
pueden estar inactivos o atacar los
espermas del esposo o de un
donador. Estos anticuerpos pueden
ser detectados en una muestra de
sangre
 immunobead binding antisperm
antibody assay, y Citometría de flujo
para detección de Atc. AE que se
considera el GE

89. Categoría 5 de problema
inmunológico.
Existen múltiples variedades de
linfocitos designados con las siglas
CD, que conforman el sistema
inmune. Una función balanceada se
tienen en una persona sana. Dos de
ellas pueden producir infertilidad,
falla de implantación y aborto. La
mujer nace con ellas .En algunas
mujeres incrementas su numero y
actividad resultando en falla
reproductiva.

91. Disregulacion Linfocitaria
 TH-2 ("T Helper 2")
La respuesta es balanceada correctamente
durante el Embarazo
 TH-1 ("T Helper 1")
La respuesta es citotoxica autoimmune,
respuesta que nos lleva a la infertilidad, falla de
implantación y aborto
 CD3, CD4, CD8
Producen anticuerpos bloqueadores y una
respuesta correcta.

92. Disregulacion Linfocitaria
 CD19+
5+
Produce anticuerpos antifosfolipidos
 CD19+
5+
, CD3, CD8
Producen anti DNA y anticuerpos histonas
 CD19+
5+
Producen anticuerpos antiespermas.
 CD56, CD57 CD16
son células asesinas naturales.

93. • Un aumento del 2 -12% es normal. Por arriba
del 12% produce infertilidad y perdida
gestacional.
• La citotoxicidad se valora mediante
Determinacion de NK por citometria de flujo.
• La Citotoxicidad mayor del 15% o en una
dilución 50:1 pueden dañar el embrión.
• Producen citoquinas toxicas (TH-1 citoquinas)
incluyendo el factor de necrosis tumoral alfa.

94.  La mayor edad paterna esta
implicada en alteraciones,
reproductivas y genéticas, que
incluyen:
 Disminución de la calidad seminal,
 Aumento de la fragmentación del
ADN en los espermatozoides
eyaculados,
 Disminución de la fertilidad,

95.  Aumento de la frecuencia de abortos
espontáneos
 Mayor incidencia de algunas
enfermedades genéticas


96.  Un creciente número de trabajos
reportan una asociación entre la
mayor edad en el varón y el aumento
de espermatozoides eyaculados que
presentan daño en el ADN nuclear..
Se sugiere, como posibles factores
involucrados, a las alteraciones de la
apoptosis testicular y a la disminución
de los mecanismos de defensa
antioxidante

97.  Se han desarrollado varios
procedimientos para detectar
rupturas de hebra simple o doble en
el ADN espermático.
 Estas incluyen métodos
Directos,
 TÚNEL
 Cometa

98. Indirectos
como el análisis de la estructura de la
cromatina (SCSA). evalúa la
susceptibilidad de los espermatozoides a
la denaturación acida.
 En general, estos procedimientos son
complejas y se realizan por citometría
de Flujo

101. ¿Qué es La
Alergia?

102. PROCESO
INMUNOLOGICO
22°Fase Formación de°Fase Formación de
AnticuerposAnticuerpos
1° Fase de1° Fase de
ReconocimientoReconocimiento
3°Fase Reacción3°Fase Reacción
Ag-AcAg-Ac
4° fase4° fase
procesoproceso
ProinflamatoriaProinflamatoria
ReaccionReaccion
dede
HipersensiHipersensi
bilidadbilidad
Tipo 1Tipo 1

103. Componentes principales que se requieren
para que la reacción alérgica se
desencadene
IgEIgE
ALERGENOSALERGENOS
MastocitosMastocitos HistaminaHistamina
LeucotrienosLeucotrienos

104. COMO SE Dx ALERGIAS
22°PRUEBAS°PRUEBAS
CUTANEASCUTANEAS
Ig E SéricaIg E Sérica
1° HISTORIA1° HISTORIA
CLINICACLINICA
3°PRUEBAS DE PROVOCACION3°PRUEBAS DE PROVOCACION
TEST DE ACTIVACION BASOFILOSTEST DE ACTIVACION BASOFILOS
BASOFILOSBASOFILOS
TABTAB

105. CITOMETRIA
DE FLUJO

106. CITOMETRIA DE FLUJO
Procedimiento que
mide características de
dispersión y
fluorescencia que
poseen las células
conforme pasan por un
rayo de luz
Las células
interaccionan con un
rayo de luz causando
dispersión
dependiendo del

107. CITOMETRIA DE FLUJO
DIGITALIZACION
REPRESENTACION
GRAFICA
ANALISIS
LABORATORIO
DE CITOMETRIA
DE FLUJO Y
BIOLOGIA
MOLECULAR
IHEMATEC

110. Test de Activacion de
Basofilos (TAB)
Es una herramienta útil en el
diagnóstico in vitro de las
reacciones de hipersensibilidad
inmediata a los Alergenos,
Medicamentos, si estas son
causados por mecanismos
dependientes de IgE u otros
mecanismos que conduzcan a
la liberación de histamina.

111. MARCADORES CELULARES
CD63 CD203c
•Es una proteína granular
tetraespan de 53 Kda
•Está anclada en los
gránulos de la membrana
de los basófilos
•Por CM se detecta Anti
CD63 PE y anti IgE FITC
•Es un Ag de superficie,
expresado en basófilos
humanos recientemente
reconocida por el Acm 97A6
•Es una ectoenzima
multifuncional llamada
pirofosfatasa ectonucleotide
phophodiesterase 3 (E-
NPP3)

112.  Fuente: Expert Rev Clin Immunol
2011 Expert Reviews Ltd
Fuente: Expert Rev Clin Immunol 2011
A Se observa el entrecruzamiento de la IgE unido a la membrana, del basófilos
en estado de inactivación B Activación específica de basófilos y sobreexpresión
de CD63 y CD203.c,
A B

113. La población celular de interés se marca con anticuerpos monoclonales en presencia del
alérgeno. Previamente al análisis por citometría de flujo, los eritrocitos se someten a
lisis. A continuación se excluyen los linfocitos T (células positivas CD3) y después se
analizan los basófilos utilizando la expresión de CRTH2 y CD203c.
Los basófilos no activados y en reposo se identifican como CRTH2posCD203cdimCD3neg,
mientras que los basófilos activados in vitro se identifican como
CRTH2posCD203cbrightCD3neg.
FUNDAMENTO

115. muestra
HISTOGRAMA DE MUESTRA
SANGUINEA
MUESTRA CON METAMIZOL
1mg/2ml
CONTROL POSITIVO CONTROL NEGATIVO

116. MODELO DE
RESULTADO DE TAB

117. En un estudio multicéntrico realizado
por la Red Europea de Alergia a
Medicamentos (ENDA), fueron
analizados los resultados de 181
pacientes con una historia de reacción
alérgica tipo inmediata a beta-
lactámicos y 81 controles. La
sensibilidad de BAT fue del 60% y la
especificidad varió de 89 a 97%.
María L. Sanz et al. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2009; 9: 298-304

118. . Se comparó la activación de los
basofilos usando el CD 203 y CD63 en
el diagnostico de alergia al látex ,se
encontró que la sensibilidad fue
considerablemente mayor con CD203c
(75% frente al 50% con CD63).
Boumiza R, Monneret G, Foreseer MF, Savoye J, Gutowski MC, Powell WS, Bienvenu J: Marked
improvement of the basophil activation test by detecting CD203c instead of CD63. Clin Exp Allergy
2003, 33:259-265

119. DISCUSION
 La BAT constituye una herramienta
diagnóstica valiosa de interés en el
estudio de reacciones de
hipersensibilidad inmediata a los
medicamentos.
 Reproduce in vitro mecanismos de
hipersensibilidad involucrados en
reacciones alérgicas inmediatas.

120.  También permite el diagnóstico de
reacciones alérgicas y
pseudoalérgicas, particularmente
por medicamentos que a menudo
no son detectables por técnicas
serológicas como la determinación
de IgE específica.

121. DISCUSION
La reproducibilidad intra-ensayo es
muy notable en la alergia a
medicamentos con coeficiente de
variación intra-ensayo de 0.89 (P
<0.0001) para beta-lactámicos, 0.99
(P <0.0001) para metamizol y 0.92
(P <0.0001) para determinados
AINES

122. DISCUSION
Además, varios medicamentos
pueden ser probados
simultáneamente, con una
pequeña cantidad de sangre
La colaboración internacional
será útil para facilitar un
consenso sobre el uso de BAT en
la evaluación de alergia
inmediata a medicamentos.

123. GRACIAS