El explante desarrolla el proceso de callogénesis posterior a la desinfección y siembra, como respuesta a la composición química y hormonal del medio de cultivo. El propósito de este trabajo fue desinfectar la raíz de zanahoria (Daucus Carota) y establecer callogénesis a partir de la misma aplicando procedimientos de desinfección con detergente al 1% durante quince minutos, se enjuago y posterior se sumergió en solución de cloro al 3% con tres gotas de Tween 20 durante 10 minutos. El medio utilizado para la siembra fue MS enriquecido con 3mg/L de 2,4-D y 0,5mg/L de BAP. Se evaluó la formación de callos semanalmente. Los resultados no mostraron contaminación de los cultivos.

1. Desinfección y establecimiento in vitro de callogénesis a
partir de raíz de zanahoria (Daucus Carota)
Paola E. Ayala Canchignia
Carrera de Ingeniería en Biotecnología, Cultivo de Tejidos Vegetales
Departamento de Ciencias de la Vida, Universidad de las Fuerzas Armadas-ESPE
Sangolquí - Ecuador.
Octubre 15, 2013
RESUMEN
El explante desarrolla el proceso de callogénesis posterior a la desinfección y siembra,
como respuesta a la composición química y hormonal del medio de cultivo. El propósito de
este trabajo fue desinfectar la raíz de zanahoria (Daucus Carota) y establecer callogénesis a
partir de la misma aplicando procedimientos de desinfección con detergente al 1% durante
quince minutos, se enjuago y posterior se sumergió en solución de cloro al 3% con tres
gotas de Tween 20 durante 10 minutos.El medio utilizado para la siembra fue MS
enriquecido con 3mg/L de 2,4-D y 0,5mg/L de BAP. Se evaluó la formación de callos
semanalmente. Los resultados no mostraron contaminación de los cultivos.
Palabras clave:Desinfección, callogénesis, cultivo in vitro.
ABSTRACT
Explant callogenesis process develops after seed disinfection and, in response to hormonal
and chemical composition of the culture medium. The purpose of this study was to disinfect
the root of carrot (Daucuscarota) and establish callus formation from the same disinfection
procedures using detergent 1% for fifteen minutes, rinsed and immersed in subsequent
chlorine solution 3% three drops of Tween 20 for 10 minutes. The medium used for seeding
was MS supplemented with 3mg / L 2,4-D and 0.5 mg / L BAP. Was evaluated weekly callus
formation. The results showed no contamination of crops.
Key words: Disinfection, callus formation, in vitro culture.
INTRODUCCIÓN
Uno de los pilares fundamentales de la
biotecnología es la regeneración de
plantas in vitro por organogénesis o
embriogénesis somática. La aplicación de
la biología molecular y celular al
mejoramiento
genético
de
plantas
requiere que las células simples
vegetativas desarrollen una planta
completa (totipotencia). Esta premisa es
útil tanto para inducir variabilidad genética
por variación somaclonal o transformación
genética
directa
como
generar
uniformidad
genética
para
la
multiplicación clonal o la propagación de
material elite (Lorenzo Feijoo, 2007).
Uno de los métodos más eficientes para
poder reproducir masivamente material
vegetal in vitro es a través de la inducción
a callogénesis, a partir de la cual se
puede obtener una organogénesis
indirecta o una embriogénesis somática
indirecta. Mediante callogénesis se
genera tejido de callo a partir de un
explante, de preferencia juvenil, debida a

2. que éste es morfo genéticamente más
viable y con la ayuda de reguladores de
crecimiento se estimula la formación de
órganos (organogénesis indirecta) o de
embriones somáticos (embriogénesis
somática indirecta)(Jácome, 2012).
El objetivo de este trabajo fue desinfectar
y establecer callogénesis a partir de la
raíz de zanahoria (Daucus Carota) el
propósito de evaluar la formación de
callos y si existe o no contaminacióncomo
las causadas por los virus u hongos.
Desde
el
descubrimiento
de
la
embriogénesis somática por Stewart y
Reinert la zanahoria ha sido empleada
como sistema modelo para investigar la
gran cantidad de aspectos bioquímicos,
fisiológicos y genéticos del cultivo de
células (Mc Donald, Jackman, Thorup, &
Dandekar, 1995). Para la inducción de
callos
de
zanahorias
se
utilizan
reguladores de crecimiento como el ácido
2,4 diclorofenoxiacético (2,4D) (George,
Hall, & De Klerk, 2008)
MATERIALES Y METODOS
La composición del medio nutritivo es
importante y los reguladores suelen
utilizarse en bajas concentraciones (0.10.5 mg/L); la auxina puede ser necesario
para la formación de raíces, auxinas y
citoquininas para estimular la división
celular;
A
nivel
celular
el
ácido
2,4
diclorofenoxiacético (2,4 -D) es utilizado
como regulador de crecimiento con
frecuencia para el cultivo in vitro ya que
este es capaz de imitar a las hormonas
naturales del crecimiento de las plantas
causando un crecimiento celular anormal
y acelerado(Bejarano, y otros, 2007); en
general el 2,4-D afecta el metabolismo de
la planta, síntesis de ácidos nucleicos y
proteínas que alteran la actividad
enzimática, respiración y división celular.
El BAP es utilizado como regulador de
crecimiento ya que modifica el crecimiento
y morfogénesis de la planta, en general,
actúa en el crecimiento indiferenciado a
nivel de meristemos de modo que puede
considerarse un inductor de callo en
ciertos tejidos.
Preparación de la muestra: Se adquirió
varias zanahorias de tamaño pequeño
para
fácil
manipulación,
selavó
cuidadosamente y sometió a proceso de
desinfección.
Preparación del medio de cultivo: El
medio utilizado fue Murashige y Skoogcon
6g/l, enriquecido con 30mg/L de azúcar,
0,05 mg/l de BAP y 3,5mg/L de 2,4-D.
Preparación de la sala de siembra: Se
desinfectó el piso de la sala de siembra
con kalipto, se limpiaron las cámaras de
flujo laminar con papel toalla estéril y
sablón. Se introdujo en la cámara todo el
material a utilizar en la siembra: lámparas
de alcohol, juego de pinzas, bisturí,
servilletas estériles, plástico adherente,
ligas, botellas de agua estéril, vasos de
precipitación vacíos. Se prendió las UV
de las cámaras de flujo durante 20 min, se
apagó la UV y encendió el flujo de aire
durante 15 min.
Desinfección del explante: Se preparó
500 ml de una solución al1% de
detergente y se sumergió los explantes,
en agitación constante durante 15
minutos.
Se lavó las muestras dos veces con agua
destilada. Posteriormente se colocó los
discos de zanahoria en 500 ml de una
solución de cloro al 3% más tres gotas de
tween 20 durante 10 a 15 minutos.
Después de este proceso de desinfección,
los explantes fueron trasladados a la
cámara de flujo, donde se realizaron tres
lavados y se retira los signos de necrosis

3. Explante
Contaminació
n
Semana
1
Semana
2
Semana
3
Raíz
1
1
1
Raíz
2
Ninguna
0
1
1
Raíz
3
Ninguna
0
1
1
Raíz
4
N° frasco
0
Ninguna
0
1
1
Ninguna
0
0
1
Raíz
2
Antes de sellar el frasco se flameó la
boca. Finalmente se selló el frasco con 2
capas de plástico adherente, se aseguró
con una liga y se rotuló cada frasco. Se
colocó los frascos en la estantería
cubiertos con plástico negro.
Ninguna
Ninguna
0
1
1
Raíz
3
0 ningún cambio
1 inicio de Desdiferenciación
2 formación parcial de callo
3 formación completa de callo
Ninguna
0
1
1
Raíz
4
Siembra del explante: Se cortó los
segmentos de material vegetal necrosado
a causa del cloro. Se trabajó con el
explante sobre una servilleta estéril y
cerca del flujo de aire de la cámara. Se
flameó las pinzas y bisturí con savlón
antes y después de manipular cada
explante y se colocó un explante por
frasco.
Escala:
Raíz
1
en el tejido superficial y quedan los discos
listos para la siembra.
Ninguna
0
0
1
Desdiferenciación
1
Se evaluó aparición de contaminantes,
brotes encontrados en los discos y
variaciones en forma y color.
RESULTADOS
2
Tabla 1 Evaluación semana de explantes.
Fotografía 1
Fotografía 2
La presencia de contaminantes tales
como hongos y bacterias tuvo un
porcentaje de 0% lo que indica que los
medios y el explantes estaban libres de
contaminantes
(Tabla
1)
esta
determinación de contaminantes se lo
obtuvo mediante observación a los
medios (Fotografía 1).

4. DISCUSIÓN
Según (Jiménez & Bangerth, 2001)
establecen
que
la
iniciación
de
suspensión de células en zanahoria es
sencilla a partir de casi cualquier parte de
la planta cultivada en 2,4D, se ha
observado que en este medio se agregó
también BAP, y es conocido previamente
que el 2,4D es uno de los mejores
inductores de callo.
Se puede atribuir el retardo en la
callogénesis por posible exceso en el
tiempo de inmersión del tejido y las
concentraciones utilizadas, ya que
algunos autores sugieren un máximo de
3% de NaClO y se utilizó 3% de cloro más
tres gotas de Tween.
Para las contaminaciones observadas en
otros frascos se puede atribuir a tres
fuentes importantes de contaminación, la
cristalería (en los bordes de los frascos o
mala manipulación de los mismos), mala
manipulación dentro de la cámara y sobre
el tejido vegetal.
CONCLUSIONES y RECOMENDACIONES:
Los procedimientos de desinfección y
manipulación fueron exitosos porque
ninguno de los ocho explantes
sembrados presento contaminación.
Pero hay que evitar la muerte del
tejido por causa del proceso de
desinfección,
por
lo
cual
se
recomienda mantener periodos de
inmersión cortos y concentraciones
bajas alrededor del 1% para el etanol
y no más de 3% para el hipoclorito de
sodio.
Evaluar detalles como desinfección
apropiada de cristalería y equipo de
trabajo para minimizar las pérdidas por
contaminación.
BILIBOGRAFÍA:
Atehortúa Garcés, L. (2009). Bioagricultura
urbana y cambio climático. Colombia:
Corporación Universitaria Lasallista .
Bejarano, F., Harikrishan, V., Souza, J.,
Rozas, M., Nivia, E., Ramírez, F., y
otros. (2007). 2,4 D Razones para su
prohibición mundial. México: Tlatolli.
George, E. F., Hall, M. A., & De Klerk, G.
(2008). Plant Propagation by Tissue
Culture (Tercera ed., Vol. Primer). The
Background.
Jácome, J. (Agosto de 2012). Repositorio
ESPE. Recuperado el Octubre de
2013, de Establecimiento, inducción y
evaluación a callogénesis in vitro de
Romerillo:
http://repositorio.espe.edu.ec/bitstrea
m/21000/5678/1/AC-BIO-ESPE033915.pdf
Jiménez, V. M., & Bangerth, F. (2001).
Endogenous hormone levels in
explants and in embryogenic and nonembryogenic cultures of
carrot.Physiologia Plantarum.
Lorenzo Feijoo, J. C. (2007). Biotecnología de
la caña de azúcar.Cuba: Universitaria.
Mc Donald, K., Jackman, A., Thorup, J., &
Dandekar, A. (1995). Applied
Biochemestry and Biotechnology.