Este documento presenta las técnicas de tinción de microorganismos utilizadas en el laboratorio, incluyendo coloraciones simples con un solo colorante y coloraciones diferenciales como la tinción de Gram. Explica los procedimientos para realizar extendidos bacterianos y aplicar diferentes colorantes para visualizar las bacterias al microscopio. Además, describe los principios de la tinción de Gram y cómo esta permite distinguir entre bacterias Gram-positivas y Gram-negativas.

1. FUNDACION UNIVERSITARIA DE POPAYAN
LABORATORIO DE SISTEMATICA Y ECOLOGIA
DE MICROORGANISMOS
PRACTICA # 4
Guía No. 4
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Versión 1.1
PRACTICA # 4 TINCION DE MICROORGANISMOS
1. INTRODUCCIÓN
Dado que los microorganismos son invisibles al ojo humano debido a sus tamaños
celulares y el alto contenido del agua, los biólogos han desarrollado métodos de
tinción de las células para facilitar su observación al microscopio. Existen una gran
cantidad de colorantes aplicados en la microbiología, así como diversas técnicas
de tinción, dependiendo del tipo de microorganismo que desea ser estudiados y
los propósitos particulares de cada estudio.
Esta práctica pretende introducir al estudiante a las técnicas y colorantes
frecuentemente empleadas en la microbiología básica. Para observar las
características de las bacterias en el microscopio es necesario hacer
preparaciones (extendidos o frotis) sobre una lámina portaobjetos, que
posteriormente deben ser teñidas para poder observarlas al microscopio.
2. OBJETIVOS
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Aprender las técnicas del montaje de placas con bacterias y empezar a
familiarizarse con el manejo de los cultivos.
3. CONSULTAS PRELIMINARES
El estudiante deberá consultar sobre los colorantes empleados frecuentemente en
biología y microbiología: naturaleza, clasificación, restricciones, riesgos y
disposición de este tipo de compuestos.
4. MATERIALES Y REACTIVOS
4.1 Material que debe llevar cada estudiante
 Tapabocas
 Jabón antibacterial
 tinta china
4.2 Material suministrado por el laboratorio
 Laminas portaobjetos
 Toallas de papel
 Asa bacteriológica
 Bandeja de coloración
 Mechero
 Cultivos bacterianos
 Goteros
4.3 Reactivos
Azul de metileno
Decolorante alcohol – acetona

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Cristal violeta
Fucsina
Lugol de Gram
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Verde malaquita 5%
Safranina 0,5%
Tinta china (nigrosina)
Aceite de inmersión
5. PROCEDIMIENTO
5.1 PREPARACIÓN DEL EXTENDIDO O FROTIS BACTERIANO
5.1.2. A partir de medios sólidos (agares)
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Coloque con el asa una gota de agua en el centro del círculo del
portaobjetos.
Esterilice el asa y enfríela introduciéndola en el borde del medio de cultivo
Con el asa saque una pequeña porción de colonia bacteriana evite siempre
tomar medio de cultivo.
Coloque la muestra sobre la gota de agua del portaobjetos, haga una
extensión delgada. Si usted observa que la suspensión no se extiende en la
superficie del porta objetos, sino que se recoge en gotas, significa que el
porta objetos está engrasado y deberá repetir el proceso en un porta
objetos completamente limpio.
Deje que el extendido se seque al aire
Fije el extendido, esto es, páselo varias veces a través de la llama del
mechero.
Realice extendidos con todos los cultivos de bacterias que se entregaron.
5.2 COLORACIONES SIMPLES
El estudio microscópico de las bacterias se facilita notablemente al tratarlas con
colorantes, ya que en condiciones naturales son difíciles de observar. Los
colorantes, que pueden ser ácidos, básicos y neutros, son compuestos orgánicos
que contienen radicales cromóforos, es decir que producen color. La coloración
simple es un método que consiste en teñir utilizando un solo colorante bien sea
ácido o básico, como por ejemplo el azul de metileno, cristal violeta, safranina y la
fucsina. Estos colorantes se emplean para apreciar la forma, la disposición y el
tamaño pero, no muestran detalles de la estructura interna.
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Coloque la lámina de la práctica anterior, en las que realizó los extendidos
de leche, sobre la bandeja de coloración.
Cubra totalmente el extendido con el colorante. Aplique a un extendido un
solo colorante. Deje actuar los colorantes así: azul de metileno 5min.,
fucsina 30 seg.
Transcurrido el tiempo necesario, lave las placas con agua, escurra y deje
secar al ambiente.

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Deje escurrir las placas sobre una toalla de papel
Observe al microscopio. Haga esquemas de forma y distribución.
5.3 COLORACION DIFERENCIALES
Las coloraciones diferenciales utilizan dos o más colorantes, que permiten
contrastar o diferencias los organismos según el color que adquieren. Existe una
gran variedad de técnicas de coloración, siendo las de Gram y Ziehl Neelsen las
más empleadas en bacteriología.
5.3.1. TINCIÓN DE GRAM
Fue elaborada por el Danés Hans Gram en 1884, y permite distinguir entre
diferentes bacterias que puedan mostrar una morfología similar. Al examen
microscópico de un extendido coloreado por el método de Gram que contenga una
flora bacteriana mixta, aparecen las características diferenciales del método.
Muchas bacterias conservan la combinación violeta-yodo y se teñirán de púrpura
(Gram positivas), otras se colorean de rojo por la safranina o el colorante que se
emplee en la contra-coloración (Gram-negativas). De esta manera, con este
procedimiento no sólo se hace visible la forma, tamaño y otros detalles
estructurales, sino que pueden agruparse los microorganismos presentes en tipos
Gram-positivos y Gram-negativos, por sus reacciones frente a los colorantes.
La diferencia en la reacción de coloración entre las positivas y las negativas se
atribuye a la diferencia en su composición química. Las paredes de las células
Gram-negativas tienen un contenido lipídico más elevado que las positivas, y
aunque en ambas se forma un complejo cristal violeta-yodo, el alcohol extrae el
lípido de las células Gram-negativas y aumenta por lo tanto la permeabilidad
celular. Esto da como resultado la pérdida del complejo de colorantes y se
colorean de rojo con la safranina o la fucsina. El mismo es retenido por las células
Gram-positivas, en las cuales la deshidratación por el alcohol ocasiona una
disminución de la permeabilidad, reteniendo el cristal violeta tras la decoloración y
se observan de color violeta.
Un microorganismo Gram-positivo puede presentar una pared sana, al sufrir daño
en esta, se vuelve Gram-negativo; lo cual indica la importancia de la pared para la
retención o escape del colorante. Las características de coloración de Gram
pueden ser atípicas en cultivos muy jóvenes o muy viejos.
Procedimiento:
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Con el asa tomar una porción del cultivo bacteriano
Hacer frotis, secar y fijar al calor

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Teñir el frotis durante 1 minuto con cristal violeta
Lavar con agua destilada
Añadir la solución de yodo y dejar reposar durante 1 minuto
Lavar con agua destilada
Decolorar con acetona o una mezcla de partes iguales de acetona y alcohol.
Por 10 segundos
Lavar con agua destilada
Hacer la coloración de contraste con safranina durante 1 minuto
Lavar con agua destilada
Secar y observar al microscopio,
Cuadro 1. Resumen de los pasos a seguir en la coloración de Gram
RESULTADOS
PASO
Colorante Básico
Mordiente
Decoloración
Contraste
TIEMPO
GRAM +
GRAM -
Cristal Violeta 1 minuto
Se
tiñen
deSe tiñen de
violeta
violeta
Lugol 1 minuto
Siguen Violeta Siguen Violeta
Alcohol-Acetona 10 seg. Permanecen
Se decoloran
violeta
Safranina 1 minuto
Permanecen
Se
tiñen
violeta
rosado
5.4 TINCION NEGATIVA
Consiste en mezclar bacterias en una pequeña cantidad de nigrosina o tinta china
y extender la mezcla sobre la superficie de un portaobjetos. Esas dos sustancias
no son colorantes realmente, debido a que no penetran al interior de la célula; por
el contrario, crean un campo de contraste permitiendo que las bacterias
transparentes se hagan visibles en un fondo oscuro. Esta técnica es útil para
determinar morfología celular y tamaño. También es útil para ciertas bacterias,
como espiroquetas que son difíciles de teñir.
El procedimiento a seguir es:
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Coloque en el extremo de un portaobjetos una gota de tinta china. Tome
con el asa una muestra de cualquiera de las bacterias entregadas y
mézclela suavemente con la gota.
Utilizando un portaobjetos limpio, extienda la gota para que se forme una
película delgada.
Deje secar el extendido al aire. No aplique calor. Observe.

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6. RESULTADOS
Anote sus observaciones en un cuadro como el que se indica a continuación:
Resultados de las coloraciones.
Microorganismo Técnica
Colorantes
Esquemas y Observaciones
Desarrolle los siguientes interrogantes:
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¿Porque son más difíciles de colorear las esporas que las células
vegetativas?
¿A qué se debe la coloración de células?. ¿Cómo actúa un colorante
ácido? ¿.uno básico?.
¿Los frotis de bacterias capsuladas no se lavan con agua ni se calientan.
¿Por qué?.
¿Cómo puede incrementarse el contenido del material capsular?.
¿Cómo se correlaciona la presencia de cápsula con la virulencia de una
bacteria patogénica?.
Describa un método por el cual se puedan obtener muestras de pared
celular para analizar composición química.
Clasifique las siguientes bacterias como Gram positivas o Gram negativas.
7. BIBLIOGRAFIA
MADIGAN M. T., MARTINKO J.M. y PARKER J. BROCK.
microorganismos. Octava edición. Prentice Hall Iberia, Madrid, 1999.
Adaptado por:
Adriana Marcela Peña Quina
Bióloga – Docente programa
Ecología
Biología de los
Revisado por:
Arnol Arias
de Biólogo – Coordinador de laboratorio