Practicas de Microbiologia

1. Introducción general
Equipo:
 Argueta Ayala Zaira
 Guillen Palma Irais
 Lozano Salazar Yannin Arizbeth
 Muñoz Aquiáhuatl Susan Elena
Profesora: Martha Corona Tinoco
Grupo: 612 Sección A
Escuela Nacional Preparatoria
Plantel 5: “José Vasconcelos”

2. La microbiología, es la ciencia que estudia los microorganismos en su naturaleza, vida y acción. El término, etimológicamente, es de amplio significado, pero suele utilizarse en sentido limitado para comprender determinadas formas microscópicas de vida.
Su campo incluye las bacterias, las rickettsias, los virus, las levaduras, los mohos y los protozoos en relación con el hombre y sus actividades, los animales, las plantas y entre ellos mismos.
Los microorganismos pueden estar constituidos por una sola célula (unicelulares), así como pequeños agregados celulares formados por células equivalentes ; estos pueden ser eucariotas (células con núcleo) tales como hongos y protistas o procariotas (células sin núcleo definido) como las bacterias.
La existencia de este mundo microbiano se desconocía hasta la invención del microscopio (principios del siglo XVII), instrumentos ópticos que sirven para ampliar objetos que son tan pequeños que no se puede ver claramente por el ojo humano sin ayuda, abriendo el reino biológico de lo muy pequeño a la exploración científica sistemática. La mayoría de los microorganismos son de vida libre.
La microbiología permite conocer los microorganismos con sus características morfológicas, biológicas y antigénicas; su relación con la infección y con la enfermedad en el hombre; las vías de penetración del hospedero, las acciones y los cambios quimiofisiológicos y celulares que ocasionan; la resistencia natural adquirida que ofrece el organismo, así como otros estados inmunitarios a que dan lugar.
Ésta práctica está dividida en tres partes correspondientes a: bacterias, hongos y protistas, pues resulta más fácil explicar y entender el desarrollo de cada uno.

3. Objetivo:
 Preparar adecuadamente los medios de cultivo para bacterias.
 Observar e identificar la morfología de bacterias que se desarrollan en alimentos como frutas y verduras jugosas.
 Distinguir su composición de pared celular, mediante tinción Gram y así dar clasificación taxonómica.
Planteamiento del problema:
La diferencia de composición bioquímica de las paredes de las bacterias es responsable de su diferente comportamiento frente a un colorante, con base a ello dar clasificación a las bacterias encontradas dentro de los 4 grupos donde están agrupadas: firmicutes, gracilicutes, mendosicutes y tenericutes.
Hipótesis:
Si la preparación de los medios de cultivo se tiñe de morado entonces serán bacterias Gram positivas y pertenecerán al grupo firmicutes.

4. Marco Teórico: 2
Las bacterias (del griego bakterion, pequeño bastón) constituyen uno de los grupos de seres unicelulares más pequeños (siendo entonces células procariotas) y abundantes de la naturaleza debido a la gran variedad de metabolismos que pueden presentar.
Su tamaño va desde 0.1 μm a 1 μm de ancho y de espesor, con una longitud de 0.5 μm a 10 μm.
Pueden vivir aisladas o en colonias. Tienen como único medio de locomoción flagelos cuyo número es variable.
Normalmente se reproducen asexualmente por bipartición.
Para la nutrición la mayoría de las bacterias utilizan sustancias químicas orgánicas, que en la naturaleza pueden provenir de organismos vivos ó muertos. Algunas bacterias pueden producir sus propios alimentos mediante la fotosíntesis y algunas pueden nutrirse a partir de sustancias inorgánicas.

5. Clasificaciones Forma y agrupación:
Se clasifican en tres grupos: bacilos, cocos y espirilos. Pueden presentarse aisladas, en grupos de dos o formando cadenas largas, así como constituyendo racimos, dependiendo esto de la especie y condiciones del medio ambiente.
 Los bacilos se dividen únicamente en un plano pero en algunas ocasiones pueden encontrarse células unidas por los extremos o por los lados debido a la etapa del desarrollo en que se encuentren o a las condiciones del cultivo.
 Las bacterias en espiral generalmente no se agrupan, crecen individuales y aisladas.

6. Pared Celular
Están recubiertas por paredes celulares que en gran parte están constituidas por un complejo de hidrato de carbono y proteína denominado peptidoglucano.
 Da forma a la bacteria y sobre todo soporta fuertes presiones osmóticas de su interior.
Según la composición de ésta y la tinción que adquieren se dividen en:
Gram Negativas (G-)
Su pared es estrecha y compleja.
Tienen sobre los peptidoglucanos una capa externa de lipopolisacáridos y proteínas, muchas de ellas enzimas.
Gram Positivas (G+)
Su pared es ancha, carecen de capa externa, poseen numerosas capas de peptidoglucano y sobre ellos tienen una capa con ácidos teicoicos (compuesto complejo que incluye azúcares, fosfato y aminoácidos) como componente más típico.
 Un método muy utilizado en microbiología para la tinción de bacterias es la tinción de Gram.
En esta tinción se forma un complejo violeta-yodo, insoluble dentro de la célula, que sólo es extraído por el alcohol en las bacterias Gram negativas, su apariencia es rosácea. Las Gram positivas tienen unas paredes celulares muy gruesas que se deshidratan por el alcohol, lo que cierra sus poros evitando que los complejos violeta- yodo salgan de las células y por ello se ven moradas.

7. Taxonomía:
La clasificación taxonómica más utilizada divide a las bacterias en cuatro grandes grupos según las características de la pared celular.
 Gracilicutes: Son bacterias con pared celular delgada (Gram negativas); por lo que se tiñen de rosa.
 Firmicutes: Sus paredes celulares son gruesas, son Gram positivas y se tiñen de morado.
 Tenericutes: Sin pared celular, por tanto no se tiñen.
 Mendosicutes: Bacterias con ausencia de ácido murámico (azúcar del peptidoglucano) en su pared celular y se tiñen de morado-rosa.
El ser humano se encuentra en todo momento expuesto al medio ambiente, de donde adquiere microorganismos. Por lo general, mantiene un equilibrio conviviendo con ellos e incluso obtiene algunos beneficios; sin embargo algunos organismos como las bacterias pueden proliferar y causarle entonces una enfermedad, utilizando los productos de su metabolismo, por lo cual es importante conocer e identificar a las bacterias y las estructuras que las componen, ya que tales conocimientos son de gran utilidad para tratar de forma preventiva o curativa las enfermedades. Si bien no está de más recordar que las bacterias no sólo causan daño sino que también son de gran utilidad en la industria de fármacos, en la elaboración de algunos alimentos, en general en la investigación, todo en función de sus componentes y cualidades.

8. Diseño Experimental:
Material:
Uso de bata en todo el procedimiento del diseño experimental.
Cabello recogido.
Esterilizar área de trabajo al inicio y final de la práctica. Para medio de cultivo: Siembra: Tinción Gram:
Agar Mac Conkey
Agar Bacteriológico
Pesa de monoplano
Vidrio de reloj
Guantes
Agua destilada
Algodón
Matraz Erlenmeyer
Mechero de Bunsen
Hisopo
Tubos de ensayo
Marcador indeleble
Encendedor
Medios de cultivo natural (frutas ó/y verduras jugosas)
Caja de petri
Tubos de ensayo
Asa
Algodón
Lámpara de alcohol
Cristal violeta
Azul de metilo
Portaobjetos
Agua
Alcohol
Safranina
Lugol
Guantes
Cubre boca
Microscopio óptico

9. Procedimientos:
Para medio de cultivo:
Para ello se requerirá ocupar Agar bacteriológico y Agar Mac Conkey de a cuerdo al modo de preparación de cada uno. Agar Bacteriológico Agar Mac Conkey
Procesado especialmente para ser utilizado como agente solidificante en
medios de cultivo microbiológicos.
Ajustar y/o suplementar como se requiera para cumplir los criterios de funcionalidad.
 Sobre la pesa de monoplano colocar el vidrio de reloj y medir 50g de Agar Mc Conkey.  Vaciar al matraz erlenmeyer y suspender los 50g del medio en 1L de agua purificada.  Calentar con agitación suave hasta su completa
disolución y hervir durante un minuto.  Retirar del fuego y con algodón se tapará la boca del matraz. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.  Enfriar a una temperatura entre 45-50°C.  Vaciar en placas de Petri y tubos de ensayo estériles.

10. Tanto para los tubos de ensayo como cajas petri, se verterá Agar Mac Conkey de la siguiente manera:  Encender la lámpara de alcohol.  Se retira el algodón que tiene el matraz erlenmeyer para poder esterilizar la boca de este.
Se esteriliza también la boca del tubo de ensayo y las cajas petri y se vacía el Agar.

11.  A los tubos de ensayo se les pone como tapón un poco de algodón y se colocan en horizontal, recargándolos con su boca sobre el recipiente.
 Se concluye la preparación para los medio de cultivo cuando los tubos de ensayo que se inclinaron estén fríos y el medio de cultivo se haya solidificado, se procede a sembrarlos.

12. Para siembra:
Se empleará siembra en estría simple y siembra cuadrante cruzada.
Siembra cuadrante cruzada
 Se enciende la lámpara de alcohol y se coloca cerca la caja de petri para la siembra (siembra en cuadrante cruzada) y los tubos de ensayo (siembra en estría simple).
 El asa para sembrar debe tener el extremo del alambre formando un círculo (pequeño).
 Se toma el asa por la extremidad del mango con los dedos pulgar, índice y medio de la mano derecha. En seguida se flamea al rojo vivo del alambre del asa, se deja enfriar sobre un poco de Agar solidificado.
 Se coloca la punta del asa sobre la colonia de bacterias que se elija, pare que tocando la superficie se adhieran gran número de bacterias.  Se destapa la boca del tubo de ensayo y se esteriliza (se flamea un poco con la lámpara de alcohol) para luego introducir el asa, haciéndola pasar suavemente por la superficie del medio

13. solidificado, haciendo una estría simple, que se inicia en la parte más interna del tubo, teniendo cuidado de no romper el Agar al hacer la siembra.
 Se saca el asa del tubo, se tapa el tubo y el asa se flamea al rojo vivo, quedando lista para otra siembra; en este caso la siembra en cuadrante cruzada que tendrá el mismo procedimiento.
 Finalmente se marcarán las cajas de petri con el grupo que las sembró.

14. Para tinción:  Con un asa previamente esterilizada se coloca en un portaobjetos una pequeña cantidad algún cultivo bacteriano, anteriormente hecho.  Se hace fijación de las bacterias al portaobjetos (Frotis): Se coloca una pequeña gota de agua al portaobjetos inmediatamente pasar tres veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos. Dejar enfriar el portaobjetos entre los pases.  Una vez seco, se agrega cristal violeta reposar 1min.  Luego se sustituye cristal violeta por azul de metilo 1 min.  Se elimina el exceso: lavado.  Se cubre la preparación con una solución yodo-yodurada: Lugol 1min.  Se elimina exceso: lavado  Se agrega alcohol para decolorar (5-10 gotas), con esto las células Gram positivas retienen el compuesto de cristal-violeta- yodo y conservan su color azul, mientras que las Gram negativas se decoloran completamente por la acción del alcohol.

15.  Se elimina exceso: Lavado
 Se aplica un colorante contraste, el rojo de safranina 1min, con el cual las células Gram negativas que antes se habían decolorado se tiñen después.
 Eliminar exceso: Lavado
 Finalmente dejar secar y luego se podrá observar al microscopio.

16. Análisis de resultados:
MEDIO DE
CULTIVO: Agar
Mc Conkey
SIEMBRAS:
Estría simple y
en cuadrante
cruzada.
TINCIÓN
GRAM:
Paso 1: Poner en
portaobjetos un poco de
cultivo bacteriano.
Paso 2: Fijar
muestra (Frotis).
Paso 3:
Cristal violeta
(1min).
Paso 4: Azul de
metilo (1 min)
Paso 5:
Eliminar
exceso
Paso 6:
Lugol (1min)
Paso 7:
Eliminar exceso
Paso 8: Alcohol
(5-10 gotas)
Paso 9: Eliminar
exceso
Paso 10:
Safranina
Paso 11:
Eliminar
exceso
Paso 13:
Observar en
microscopio
Paso 12:
Secar al aire
Paso 13:
Resultados

17. Conclusión:
De acuerdo a los resultados obtenidos en la práctica podemos concluir que la hipótesis planteada resultó falsa pues los resultados de la tinción de los medios de cultivo utilizados fue: bacilos, morado-rosas por lo tanto nos referimos al grupo mendosicutes (con ausencia del azúcar del peptidoglucano en pared celular) y otro al no tener pared celular no se tiñó por lo tanto fue tenericute (bacilos). Entonces no pudimos obtener bacterias Gram positivas pertenecientes al grupo firmicutes. Por último podemos afirmar que se lograron los tres objetivos planteados, pues se prepararon adecuadamente los medios de cultivo para el desarrollo de bacterias en frutas y verduras; se observó la morfología de algunas bacterias desarrolladas en frutas y se les pudo dar clasificación de acuerdo a la tinción Gram. Bibliografía:
 Velasco M., López R., Romero M., Salamanca C. Biología 2º Bachillerato: Editex, España 2006.
 Piña López C.: Diversidad microbiana, tipos de microbios.
http://www.unad.edu.co/fac_ingenieria/pages/Microbiologia_mutimedia/bact_clasif.htm
 Franco Martínez F.: UNAM Facultad de Odontología, Microbiología, guía de estudio 2002.
http://132.248.225.10/licenciatura/guiasyprogramas/guias/2_microbiologia. pdf
 Microbiología clínica:
http://danival.org/600%20microbio/6200microclin/bhim/bhim_2-3.html
 http://www.mcd.com.mx/pdfs/AGAR%20MAC%20CONKEY.pdf
 http://www.mcd.com.mx/pdfs/agar_bacteriologico.pdf
 http://www.joseacortes.com/practicas/frotisbact.htm