1. A Long ncRNA Links Copy Number Variation to a Polycomb
Trithorax Epigenetic Switch in FSHD Muscular Dystrophy
Daphne S. Cabianca, and Davide Gabellini, Valentina Casa, Beatrice Bodega, Alexandros Xynos, Enrico Ginelli,
Yujiro Tanaka
María Alejandra Mejía Carmona
Alejandro Posada Garzón
III SEMESTER
UPB

2. INTRODUCTION
 FSHD is a genetic defect of the 4q35 subtelomeric region.
 Deletions caused by reducing the number of copies D4Z4
 Epigenetic factors involved
 FSDH in patients with altered DNA methylation, histone marks and higher order
chromatin structure.
In patients with FSHD has been
reported the loss of repressive
marks (repressed) and 4q35 gene
repression.

3. GENERAL OBJECTIVE
 The objective of this study was to provide information about biological
function of repetitive sequences in regulation gene expression and shows
how mutations of such elements can influence the progression of a human
genetic disease. In this case show chromosome 4q35 in the repetitive
sequence D4Z4 for the desease FSHD.

4. GENERALIDADES
• La distrofia muscular tipo facioescapulohumeral, es uno mas de los 9 tipos de distrofias
musculares conocidas, siendo esta la quinta distrofia muscular más común.
• FSHD es una enfermedad de los musculos descrita en 1886 por los doctores Landouzy y
Déjerine.
•La distrofia facioescapulohumeral es una enfermedad genética causada por una anomalía
localizada en el cromosoma 4.
•La distrofia facioescapulohumeral se manifiesta por la afectación de los músculos de la cara
(facio), de los hombros (escápulo) y de los brazos (humeral) ).

5. EPIGENETICA
•El término fue acuñado por C. H. Waddington en 1953 para
referirse al estudio de las interacciones entre genes y ambiente
que se producen en los organismos.
• Se define como aquellas actividades reguladoras de genes que
no involucran un cambio en la secuencia de bases y que
pueden transmitirse de una generación a otra. Regulación de
la expresión génica sin cambio en la secuencia de nucleotidos.
• Se ha determinado que hay tres procesos epigenéticos de
regulación: metilación del ADN, modificación de las histonas y
por último el efecto de los ARN pequeños no codificantes.

6. ncRNA
Es una molécula de ARN funcional que no se traduce en una proteina. En ellos se
incluye el RNA de transferencia y el RNA ribosomal

7. MATERIALES Y MÉTODOS
• Cells: hídridas monocrosomales en un fondo de CHO  (chr4/CHO).
• Extracción RNA: el RNA se extrae para ser utilizado en diferentes procedimientos como
obtencion de cDNA mediante rtPCR, estudios de expresion genética, etc.
• RT-PCR: amplificacion de RNA a través de la sintesis previa de su cDNA (DNA copia),
utilizando una transcriptasa inversa, seguido de varios ciclos de PCR convencional.
• qRT-PCR: es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizada
para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la
amplificación de ácido desoxirribonucleico (ADN).

8. MATERIALES Y MÉTODOS
•Northern blot: permite identificar secuencias especificas de RNA. Además, con éste
método no se utilizan enzimas de restricción ya que las moléculas de RNA son muy
pequeñas comparadas con las del DNA genómico y por eso no se requiere de
fragmentaciones subsecuentes.
• FISH: Utiliza sondas de DNA marcadas con un fluoróforo para detectar o confirmar
anomalías génicas o cromosómicas que generalmente están más allá de la capacidad de
resolución de la citogenética de rutina.

9. RESULTADOS
ChIP analizados por qPCR para p13E-11, elemento no eliminada (NDE), y las diferentes regiones de la repetición D4Z4.
Las células CHO transfectadas de manera estable con humanos BAC 4q35 ya sea que contengan (CH16-291A23) o ausente
(RP11-462G22) 4q35 D4Z4 repetido. ChIP se analizó mediante qPCR con cebadores para una región común a los dos BACs.

10. RESULTADOS
Células Chr4/CHO que expresan establemente el control shRNA o shSuz12. La disminución se
evaluó por qRT-PCR (G) e inmunotransferencia (H).

11. RESULTADOS
Los resultados muestran la frecuencia relativa de interacción entre DBE y el centro FRG1 en control y
las células tratadas chr4/CHO AZA + TSA que expresan un no silenciamito shRNA o una específica
shRNA para DBE-T (shDBE-T).

12. RESULTADOS
(B) Representación esquemática de la ubicación de la DBE-T y sondas D4Z4.
(C) A raíz de AZA + TSA tratamiento, las células fueron analizadas por chr4/CHO ADN / ARN
FISH.

13. RESULTADOS
Células Chr4/CHO que expresan establemente el control shRNA o shAsh1L. La disminución se
da después del tratamiento AZA + TSA evaluado por QRT-PCR (C) y la inmunotransferencia.

14. RESULTADOS
(B) ARN-GTS in vitro despliega un análisis que muestra la interacción entre el dominio SET
Ash1L recombinante GST-fundido o GST y transcrito in vitro DBE-T. En la tinción de derecho,
Azul de coomassie en proteínas purificadas recombinantes.

15. DISCUSSION
SENIOR OPINION AGREE
YES/NO
BODEGA PcG silencing and DNA methylation are reduced selectively at NO
the deleted 4q35 allele in FSHD and better explain the strictly
4q35-linked nature of the desease.
BAE In Drosophila, PREs were shown to generate ncRNAs that YES
regulate the epigenetic status of the locus
FAULKNER A significant portion of the human genome is composed of YES
macrosatellite repeats. Although once thought of primarily as
‘‘junk,’’ recent studies indicate that repeated elements play
central roles in regulating gene expression at multiple levels
LEEB in mammals the greatest proportion of PcG-mediated YES
chromatin modifications is located in genomic repeats, and it
has been suggested that they could providea binding platform
for PcG proteins

16. CONCLUSIONS
 The role of proteins is of great importance in the epigenetic regulation of gene
expression.
 Processes such as DNA methylation, histone modification and finally the effect of
small non-coding RNAs are important for changes in gene expression.
 PCR is very important when you need to make a comparison of two genes from
different species in certain pathologies.
 In FSHD shows the importance of presenting repetitive sequences in the genome for
phenotypic expression.

19. BIBLIOGRAFÍA
• Nogales Jorge, Donoso Archibaldo, Verdugo Renato. Tratado de
neurología clinica. Santiago de Chile: Editorial universitaria; 2005.
• Jiménez, L Felipe. Merchant, Horacio. Biología celular y molecular.
México: Pearson educación; 2003.
• Elmer W. Koneman. Diagnóstico microbiológico: texto y atlas en color. 6
ed. Buenos aires. Medica panamericana; 2008.

20. GRACIAS