REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

1. Universidad de Chile
Facultad de Medicina
Escuela de Tecnología Médica
Bioquímica II
PCR
Reaccion en cadena de la
polimerasa
Integrantes: Bárbara Avello
Paulina Campos
Profesor Guía: Isabel Castro

2. Un poco de historia…
 Técnica desarrollada en 1985 por el
Bioquímico Estadounidense Kary B. Mullis
quien recibió el premio Nobel de Química
de 1993.
 Esta tecnica resultó ser una revolución en
la investigación biológica y médica.

3. Definición de PCR
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Técnica de Biología Molecular que tiene por
objetivo la amplificación directa de un gen (o
fragmento de DNA) o indirecta de un RNA,
presente en mezclas de muy diversas fuentes.
* No es necesaria una purificación previa de la
muestra íntegra original.

4.  Tiene la capacidad de amplificar millones de
veces fragmentos pequeños de DNA de
hasta 10 Kb (10.000 pares de bases), en un
período de tiempo relativamente corto.
 Es un método muy adecuado para preparar
ácidos nucleicos en una cantidad muy
superior a la de la muestra original.

5. Objetivo básico de la PCR
AMPLIFICACION
Para disponer de cantidad
suficiente como para
utilizarlo con fines
diversos.
AMPLIFICAR DNA
DETECCION
Para poderlo detectar en
muestras con pequeñas
cantidades del DNA diana.

6. Fundamentos
Mimetiza el proceso de replicación
Complementariedad BN
Capacidad del DNA para
desnaturalizarse/ renaturalizarse

7. Requerimientos
1.- Muestra (templado o molde: DNA o cDNA)
2.- Primers
3.- DNA polimerasa resistente a alta
temperatura
4.- Mg++
5.- Desoxinucleótidos trifosfatos – dNTPs
(dATP, dGTP,dCTP, dTTP)
6.- Buffer, KCl

8. 1.- Templado o Molde
 Molécula que contiene la región de DNA que se quiere
amplificar.
 Puede ser DNA o cDNA.
 Se requiere poca cantidad.
No debe ser necesariamente
puro.
 Tiene que ser libre de altas
concentraciones de EDTA o
cationes que pueden actuar
como quelantes.

9. 2.-Primers (iniciadores, partidores o
cebadores)
 2 oligonucleótidos sintéticos que flanquean a
la región blanco, uniéndose por
complementariedad de bases a cada uno de
los extremos del fragmento de DNA que se
quiere amplificar.
Primer sentido Primer antisentido

10.  Deben ser específicos para la secuencia a
amplificar.
 Deben tener idealmente un alto % de C+G,
entre un 40-60%.
 Deben evitar ser complementarios entre si,
especialmente en el extremo 3´.
 Deben evitar formar estructuras secundarias.
 Generalmente su longitud debe variar entre
18 y 30 pb.

11.  La concentracion debe ser adecuada para
favorecer la hibridacion entre el molde y el
primer.
 Ambos primers deben tener una Tm
(temperatura de melting) similar,con una
diferencia de no mas de 5ºC.
Tm = [2 x (A + T) + 4 x (G + C)] – 5
 La temperatura de annealing o de
hibridacion (Ta) debe ser aprox. 5ºC menos
que los valores de Tm obtenidos.

12. 3.- DNA polimerasa
Características que debe tener la enzima:
PROCESIVIDAD
FIDELIDAD
TERMOESTABLE

13. Taq DNA polimerasa Termoestable:
-Aislada de Thermus aquaticus (vive en aguas
termales).
-Comete un error cada 10.000 nucleótidos.
-Su temperatura optima de actuación es a
72ºC.
-Su concentracion varia entre 1 a 2 unidades
de enzima por cada 100µL de reaccion.
-No posee la actividad editora o correctora (3`
exonucleasa).
Otras DNA polimerasas termoestables, obtenidas de bacterias
termófilas:
Pwo Pyrococcus woesei
Pfu Pyrococcus furiosus
Tli Thermococcus littoralis

14. 4.- Mg++ (MgCl2, MgSO4)
Mg++ es un cofactor de DNA polimerasas.
Determinar la [Mg++] óptima es uno de los
pasos más importantes en la puesta a punto de
una PCR.
[Mg++] muy bajas : la polimerasa no funciona
correctamente, afectando el rendimiento de la
reacción.
[Mg++] muy altas :favorece amplificaciones
inespecificas, afectando la especificidad
reacción.

15. 5.- Desoxinucleótidos trifosfato
(dNTPs)
 Provee de nucleotidos (base+ azucar +
fosfato) a la reaccion para la sintesis de DNA.
 Deben estar presentes en cantidad suficiente
para que se logre la extensión a lo largo de
todos los ciclos (~200 µM cada dNTP).
 No deben estar en exceso para que los iones
Mg++ no estén formando complejos con los
dNTPs.

16. 6.- Buffer y sales
Buffer Mantiene el pH optimo para
que la enzima actúe.
El buffer es en general Tris base
ajustado a un pH específico con HCl.
pH óptimo para Taq: 8.3
Sales KCl: contribuye al plegamiento
correcto de la enzima.

17. Aditivos adyuvantes
Existen una serie de reactivos que pueden
contribuir a la reacción de amplificación.
 Formamida y el dimetil-sulfóxido (DMSO)
 Glicerol

18. Equipos: Termociclador
Instrumento programado para cambiar la
temperatura de las muestras rápidamente
desde una temperatura a otra.

19. PCR convencional en el
laboratorio
1.Creación del Primer
2.Extracción de DNA (o RNA)
3. PCR
4. Detección de resultados

20. 1. Creación del primer
Los primer o cebadores (compuestos
por oligonucleótidos específicos) son
sintetizados químicamente.
*Para realizar esta labor se utilizan bases de dato
universales y programas computacionales que
establecen la secuencia primer para un gen
determinado.

21. 2. Extracción de DNA
Se extrae el DNA genómico desde la
muestra a analizar
*Para esto existen Kits
comerciales que aseguran:
 Alto rendimiento.
 Alta pureza.
Gran cantidad de DNA

22.  La correcta extracción de DNA o RNA
se comprueba mediante la
determinación de:
Integridad y concentración
aproximada de DNA o RNA
(electroforesis en gel de agarosa 1%)
Relación Ác. Nucleicos/Proteínas
(ABS a 260/280 con
espectrofotometro)

23. 3. PCR y sus etapas
3.1
Desnatura-
lización del
DNA
3.3 3.2 Unión del
Elongación iniciador a la
secuencia
de la complementa
cadena -ria

24. 3.1 Desnaturalización del
DNA
El DNA molde de doble hebra es
desnaturalizado por calor a un t° por encima de
su punto de fusión
T° inicial del PCR: 95°C por 5 min
T° inicial de cada ciclo: 95°C por 30 seg.

25. 3.2 Alineamiento/unión del
iniciador a la secuencia
complementaria
Se desciende la t° lo suficiente para que
ocurra la hibridación entre los cebadores y el
DNA molde.
T° ideal: 65°C por 45 seg.

26. 3.3 Extensión/elongación de las
cadenas
La t° es nuevamente aumentada para
favorecer la actividad catalítica de la
polimerasa la cual se ha unido al extremo del
duplex molde-cebador.
T° ideal en cada ciclo: 72°C por 45 seg.
T° Final: 72°C por 10 min.

29. *Amplificación exponencial

30. 4. Detección de resultados
La detección del producto del PCR se
realiza normalmente mediante una
electroforesis.
*Electroforesis en gel de
agarosa, revelado con rayos
UV gracias a la utilización de
bromuro de etidio (colorante)

31. Precauciones
 Contaminación con DNA

32. Controles
 Control sin molde.
 Control positivo.
 Control de primers.

33. Ventajas Desventajas
Velocidad Secuencia
Facilidad Tamaño limitado
Contaminaciones
Sensibilidad
(por sensibilidad)
Muestras

34. Aplicaciones PCR
 Huella digital genética.
 Test de paternidad.
 Detección de enfermedades hereditarias.
 Comparación de la expresión génica.
 Clonamiento de genes.
 Mutagénesis.
 Análisis de DNA antiguo.
 Genotipificacion de polimorfismos

35. Bibliografía
 Texto Ilustrado de Biología Molecular
e Ingeniería Genética (Conceptos,
Técnicas y Aplicaciones en Ciencias
de la Salud), José Luque y Ángel
Herráez.
 Biología molecular y Biotecnología
(2da edición), J.M. Walker y E. B.
Gingold. 1997