1. Santiago Castro.
Sara Berdugo Mesa.
Estudiante Medicina tercer Semestre
Universidad Pontificia Bolivariana
P16INK4A
positively regulates p21WAF1
expression by suppressing AUF-1
dependent mRNA decay..
Autores: Huda H. AL Khalaf, Abdelilah Aboussekhra.

2. INTRODUCTION.
Cell cycle in most cells consist of four
cordinate process.
Cell growth.
DNA replication.
Cell division.
Distribution of
duplicated
chromosomes.

3. INTRODUCTION.
CELL CYCLE PHASES.
INTERPHASE.
G1 phase.
M phase.
G2 phase.
S phase.
G0 phase.
The cell is metabolically active and grows, but does not
replicate DNA. (2n)
DNA Rreplication occurs. (4n)
Enzime and other proteins are synthesized. (4n)
It refers to mitosis.
( quiescence) the cell is metabolically active but is non
dividing cell.

4. INTRODUCTION.
INTERPHASE.
It refers to mitosis.
Telophase.
M phase.
Anphase.
Metaphase
Prophase.
Chromosomes relax and nuclear
membranes are formed.
Chromosomes separate to opposite
poles.
Chromosomes align at the euatorial
zone.
Chromosomes condense and
migrate to the center of the cell.

5. INTRODUCTION.
CONTROL POINTS OF CELL CYCLE.CONTROL POINTS OF CELL CYCLE.
G1G1 MMG2G2
In response
to damaged
DNA or DNA
that has not
been
replicated.
In response
to damaged
DNA or DNA
that has not
been
replicated.
Can not
move
from 2n to
4n.
Can not
move
from 2n to
4n.
It stops mitosis if
choromosomes
are not correctly
aligned at the
mitotic spindle.
It stops mitosis if
choromosomes
are not correctly
aligned at the
mitotic spindle.
Regulated
by P53.
Regulated
by P53.

6. INTRODUCTION.
P16INK4AP16INK4A
P21WAF1P21WAF1
Cyclin-dependent kinases (cdkS)Cyclin-dependent kinases (cdkS)
INHIBITED.INHIBITED.
Cyclin.Cyclin.
Regulated.Regulated.Cell
proliferation.
Cell
proliferation.
FunctionsFunctions
• Suppress tumors
and apoptosis.
• Involved in cell
cycle control(in the
passage from G1 to
S).
Participates in
the P53 track
Participates in
the P53 track
Participates in
the pRB track
Participates in
the pRB track

7. .
INTRODUCTION.
Cyclin.Cyclin. Regulate the activity of
specific enzymes, cyclin
dependent kinases.
Regulate the activity of
specific enzymes, cyclin
dependent kinases.
kinase is activated
and adds
phosphate groups
to the protein and
regulates the cell
cycle.
kinase is activated
and adds
phosphate groups
to the protein and
regulates the cell
cycle.
The most
important in the
cell cycle.
The most
important in the
cell cycle.
Cyclin A and B.Cyclin A and B.
Cyclin D.Cyclin D.
Cyclin E.Cyclin E.
participates in the beginning of G1participates in the beginning of G1
participates in the S phaseparticipates in the S phase
necessary to move from G1 phase to
S phase
necessary to move from G1 phase to
S phase

8. .
INTRODUCTION.
P53P53
The detention of cell cycle at G1 ckeckpoint is regulated by the action of a
protein known as P53, that responds rapidly to damaged DNA. The gen coding
for P53 usually appear in human cancers. If P53 loses its fuction, the cell cycle
is not stopped at G1. and damaged DNA replicates and passes on to daughter
cell without reparation.

9. .
INTRODUCTION.
Apoptosis.Apoptosis.
Apoptosis or programmed cell death is the orderly process by which the cell dies
before extra-or intracellular stimulus. Apoptosis has an important role in
organism, allowing the destruction of genetically damaged cells, preventing the onset
of diseases such as cancer.

10. .
INTRODUCTION.
P21WAF1P21WAF1
P16INK4AP16INK4A
Inhibits cyclin
E-CDK2
complex.
Inhibits cyclin
E-CDK2
complex.
The target is
cyclin D-CDK.
The target is
cyclin D-CDK.
Inhibits.Inhibits.
To pass G1
phase to S
phase
To pass G1
phase to S
phase
Regulated the
beginning of
G1
Regulated the
beginning of
G1

11. OBJECTIVE.
In this study the objective was to check that p16 has
a positive control in the expression of p21 in human
and mouse cells.
In this study the objective was to check that p16 has
a positive control in the expression of p21 in human
and mouse cells.

12. MATERIALES Y METODOS.
LINEA CELULAR.
1. U2OS,EH1 Y EH2 (líneas celulares).
2. MEFs p16.
3. Knockout p16.
4. HFSN1 (fibroblastos de piel humana normal)
5. DMEM/F12(medio)
6. MCF-10ª se adquirieron de ATCC y fueron cultivadas según
recomendaciones.

13. .MATERIALES Y METODOS.
IMMUNOBLOT.
PREPARACION DE LA MUETRAS.PREPARACION DE LA MUETRAS.
Los extractos de célula se prepararon a partir de diferentes líneas celulares
tanto de humanos como de ratón, posteriormente fueron separados por
electroforesis en gel según su tamaño y se disolvieron en el detergente SDS
y las proteínas fueron transferidas a filtro y se encubaron con los
anticuerpos y la β- actina como control interno.
los anticuerpos iban dirigidos contra:
• p21(F5)
•P14(c18)
•GADPH (fl335)
•PCNA (OC-10)

14. .MATERIALES Y METODOS.
INMUNOTINCION.INMUNOTINCION.
celulas se fijaron en acetona, metanol y se hizo un proceso de
inmunoperoxidasa usando anticuerpo Ki-67 y anticuerpo anticonejo
conjugado con peroxidasa, y los sitios a los que se unieron los anticuerpos se
visualizaron por deposito de cromogenos.
TODO ESTE PROCEDIMIENTO SE REALIZO CON EL FIN DE EVALUAR
EL p21 Y LA CANTIDAD DE CELULAS QUE SE ENCONTRABAN EN LA
FASE S.
TODO ESTE PROCEDIMIENTO SE REALIZO CON EL FIN DE EVALUAR
EL p21 Y LA CANTIDAD DE CELULAS QUE SE ENCONTRABAN EN LA
FASE S.

15. .MATERIALES Y METODOS.
PROLIFERACION CELULAR.
Las células MFC-10A expresan CDKN2A-ORF o plásmido de control se sembraron
en una placa E16 y la tasa de proliferación se midió usando un sistema
xCELLigence.(monitorea eventos celulares en tiempo real sin la incorporación de
marcadores)

16. .MATERIALES Y METODOS.
CITOMETRIA DE FLUJO.
Esta técnica permite analizar una población celular en donde predominan otras
poblaciones celulares mayoritarias y me permite obtener varios parámetros de una
célula analizada.
Células.Células. PBS.PBS. Centrifugación.Centrifugación.Fijación
(metanol).
Fijación
(metanol). RNasa.RNasa.
Incubación y
adhesión de
yoduro.
Incubación y
adhesión de
yoduro.
ESTE PROCEDIMIENTO SE USO PARA SABER EL CONTENIDO
EXACTO DE DNA Y ADEMÁS PARA ANALIZAR LAS CÉLULAS EN
DIFERENTES CICLOS CELULARES.
ESTE PROCEDIMIENTO SE USO PARA SABER EL CONTENIDO
EXACTO DE DNA Y ADEMÁS PARA ANALIZAR LAS CÉLULAS EN
DIFERENTES CICLOS CELULARES.

17. .MATERIALES Y METODOS.
RT-PCR.
Esta prueba se utiliza para la amplificación directa de un gen o de un fragmento
de DNA o indirecta de RNA.
El ARN total fue purificado utilizando reactivo , se determinaron concentraciones
ADN complementario monocatenario (ADNc) se obtuvo por
la transcripción inversa y se amplifico por cebadores y posteriormente se calentó
y se observaron después de la electroforesis.

18. .MATERIALES Y METODOS.
ESTE MÉTODO SE UTILIZO PARA DEMOSTRAR QUE EL P16
CUMPLE UN PAPEL FUNDAMENTAL EN LA ESTABILIDAD DEL
RNAM DEL CDKN1A DE LOS FIBROBLASTOS DE LA PIEL
NORMAL.
ESTE MÉTODO SE UTILIZO PARA DEMOSTRAR QUE EL P16
CUMPLE UN PAPEL FUNDAMENTAL EN LA ESTABILIDAD DEL
RNAM DEL CDKN1A DE LOS FIBROBLASTOS DE LA PIEL
NORMAL.

19. .MATERIALES Y METODOS.
ANLISIS DE LA ESTABILIDAD.
Se hicieron curvas de calibración para el gen CDKN1A para
determinar la concentración relativa de los transcritos amplificados (p21-
p16),a través de la AUF1 y luego se normalizó el nivel de ARNm del GAPDH.
LOS VALORES NORMALIZADOS SE UTILIZARON PARA CALCULAR LA VIDA MEDIA
DEL ARNM CDKN1A.
LOS VALORES NORMALIZADOS SE UTILIZARON PARA CALCULAR LA VIDA MEDIA
DEL ARNM CDKN1A.

20. .
RT-PCRq.
La PCR a tiempo real la amplificación y la detección se dan simultáneamente sin tener que
hacer procedimientos posteriores y me permite monitorizar por fluorescencia cuanto DNA
se sintetiza en cada momento .
En este caso se extrajo ARN de ambos p16 competente y p16 deficiente, el ARN total fue
purificado, tratado por DNasa, y después se sintetizó ADNc , todo este proceso se hiso
mediante cebadores específicos.
ESTE MÉTODO SE REALIZO PARA INVESTIGAR EL MECANISMO POR EL QUE P16
REGULA EL NIVEL DE LA PROTEÍNA P21, SE EVALUÓ EL PAPEL DE P16 EN LA
EXPRESIÓN DEL ARNM CDKN1A EN RATÓN Y FIBROBLASTOS HUMANOS.
ESTE MÉTODO SE REALIZO PARA INVESTIGAR EL MECANISMO POR EL QUE P16
REGULA EL NIVEL DE LA PROTEÍNA P21, SE EVALUÓ EL PAPEL DE P16 EN LA
EXPRESIÓN DEL ARNM CDKN1A EN RATÓN Y FIBROBLASTOS HUMANOS.
MATERIALES Y METODOS.

21. .
Transfección y evaluación de la actividad reportero
GFP
Permite la introducción de ácidos nucleicos en el interior de las células, lo que
a llevado a ampliar los conocimientos acerca de la regulación génica y de la
función de las proteínas en los sistemas celulares.
Las células fueron transfectadas con un reportero EGFP, en el que la
región del reportero se fusiono con un fragmento que se extiende a
través del RNAm del CDK1A
Todo esto se hizo con el fin de aclarar el papel de la proteina de union
ARE AUF1 en el control de p16 relacionado con el decaimiento de
CDKN1A RNAm
Las células fueron transfectadas con un reportero EGFP, en el que la
región del reportero se fusiono con un fragmento que se extiende a
través del RNAm del CDK1A
Todo esto se hizo con el fin de aclarar el papel de la proteina de union
ARE AUF1 en el control de p16 relacionado con el decaimiento de
CDKN1A RNAm
MATERIALES Y METODOS.

22. .
La cuantificación del nivel de expresión de la proteína
Todo este procedimiento lo hicieron para demostrar que el supresor
de tumores p16 controla positivamente la expresión de p21 en cáncer
de mama células epiteliales
Todo este procedimiento lo hicieron para demostrar que el supresor
de tumores p16 controla positivamente la expresión de p21 en cáncer
de mama células epiteliales
Los niveles de expresión de las proteínas obtenidas por
inmunotransferencia fueron medidas utilizando el densitómetro. Y se llego
a la conclusión debido a que el p16 indujo una respuesta a la luz
ultravioleta.
MATERIALES Y METODOS.

23. RESULTADOS.

24. .
RESULTADOS.

25. .
RESULTADOS.

26. RESULTADOS.

27. RESULTADOS.

28. .
DISCUSSION.
REFERENCE WHAT THEY SAID AGREE OR DISAGREE
Mitra J, Dai CY, Somasundaram K, El-
Deiry WS, Satyamoorthy K
“p16 positively
regulates the basal expression of p21
in various human cell
types and mouse embryonic
fibroblasts. Likewise, using
different p16 constructs and the U2OS
cell line, it has been
previously found that p16 enhances
p21 expression”.
Agree
Al-Mohanna MA, Al-Khalaf HH, Al-
Yousef N, Aboussekhra A
“while p21 is the
p53 effector during the cellular
response to γ-rays, its activity is
under the control of p16 in response
to UV light”.
Agree
Al-Ansari MM, Hendrayani SF, Shehata
AI, Aboussekhra A
“p21 and p16 are both concomitantly
down-regulated in various
breast cancer-associated fibroblasts as
compared to their
adjacent counterparts”.
Agree
Lal A, Mazan-Mamczarz K, Kawai T,
Yang X, Martindale JL
“AUF1 targets also p53 and C-Myc,
which are well known modulators
of p21 transcription”.
Agree

29. CONCLUSION.
P16 is a protein with an important role in the regulation
of cell proliferation, enhancing the activity of p21 on the
critical G1 to S phase transition of the cell cycle.
AUF1, an important RNA binding protein, is negatively
regulated by the p16, which increases the CDKN1A´s
expression.

30. CONCLUSION.
Using ectopic p16 on p16-deficient cells, can increase
considerably p21 levels, but it doesn´t have any effect on the
cell proliferation .
There is an important correlation with p16 and p21 levels
with certain cancer cell lines like medulloblastoma and
meningioma cells, which also is negatively correlated with
AUF1 levels on the same type of cells.

31. .
Sara Berdugo Mesa.

32. .
Santiago Castro.

33. .