1. THE USE OF CASPASE INHIBITORS
IN PULSED-FIELD GEL
ELECTROPHORESIS MAY
IMPROVE THE ESTIMATION OF
RADIATION-INDUCED DNA
REPAIR AND APOPTOSIS
Josep Balart, Gemma Pueyo, Lara I de Llobet,
Marta Baro, Xavi Sole, Susanna Marin, Oriol
Casanovas, Ricard Mesia, Gabriel Capella
Sara Rendón V
Verónica Sarassa
Molecular Biology
Universidad Pontificia
Bolivariana

2. INTRODUCTION
In this study the scientists
tried to prove by the PFEG
(pulsed-field gel
Electrophoresis)that
Caspase inhibitors would
help in radiation-induced
DNA double-strand break
(DSB) repair. They used
tumor cells, caspase
inhibitors and mice.

3. KEY WORDS
APOPTOSIS:
Genetically programmed and regulated cell death.
It intervenes in two ways: begins at the end third of the G1
phase to impede a damaged cell going to synthesis phase
(so mutations can’t reproduce during DNA replication).
The other way: it can act on the G2 phase to impede cells that
haven’t reached maturity enter mitosis.

4. KEY WORDS
APOPTOSIS
WAYS
EXTRINSIC INTRINSEC
Use the protein Bcl-2
Called “death receptors”
(gene B-cell lymphoma
path, it establishes
2)to regulate
conections with the
preapoptotic factors. For
extracellular space,
example the C citocrome
recieving proapoptotic
(necessary in the
signals from the outside
activation of the 9-
and from neighbor cells.
caspase in cytosol)

5. KEY WORDS
APOPTOSIS: FADD
On the inside
interacts with Apoptosis
Fas two proteins: DaXX
EXTRINSIC RECEPTORS Tradd
Cell
TNF: proliferation
Raidd
Traff
Apoptosis
C Citocrome
INTRINSIC Bcl-2
SMAC/DIABLO

6. KEY WORDS
APOPTOSIS:
 FAS: surface protein of 36 kDa with a
cytoplasmatic domain of “cell death”.
 DaXX: estimulates cell cycle and mitosis, having
the contrary effect that of the apotosis.
 FADD: factor associated death domain.
 TNF: tumor necrosis factor
 Tradd: TNF receptor associated death domain

7. KEY WORDS
APOPTOSIS:
 Raidd (receptor associated interleukine death
domain), activation of initiator caspases.
 Traf (TNF receptor associated factor)
activated protein kinase and stimulate cell
proliferation.
 Bcl-2: Regulation of the apoptosis action on the
mitochondria
 SMAC/DIABLO: an inhibitor of caspase inhibitors
 Citocromo C: activates a protein complex
called "apoptosome", which directly
activatescaspase-9

8. KEY WORDS
DNA REPARATION
The double-strand
breaks is a post
Capacity of a cell Both strands replication repair.
to identify and
of the double Divides in two types:
correct damage to
the DNA molecules helix are broken 1. Non-homologous
that encode its end joining
genome. 2. Homologous
recombination.

9. KEY WORDS
PULSED-FIELD GEL ELECTROPHORESIS(PFGE)
It has been developed for separating large molecules
of DNA, all using multiple electric fields
Chromosomal DNAintegrated in agarose plugs
Plugs treated with enzymes, that leaves only the
naked DNA
With the restriction enzymes, the plugs are cut. Then,
inmersed in the wells of gel and sealed with agarose.

10. KEY WORDS
By the method PRGE (puled-field gel
electrophoresis) the apoptosis and caspase
activation can be determinated because
this method shows the quantity of
fragmented DNA.
+ fragmented DNA= + apoptosis,+activation of caspases
- fragmented DNA = - apoptosis, + DNA repair

11. PURPOSE
To demostrate if the DNA
fragmentation in experiments
with PFGE in induced by
apoptosis using Caspase-3.

12. MATERIALES Y MÉTODOS
LÍNEAS CELULARES (CULTIVOS)
Se utilizaron células tumorales: la utilizada en el
estudio fue la escamosa humana carcinoma de
A431. Fue tomada de una colección americana
de células (El carcinoma pancreático NP18).
Se hizo un cultivo celular en ratones macho
durante 6 a 8 semanas Los tumores se
generaron mediante inyección subcutánea de un
millón de células NP18 en el flanco de cada ratón.

13. MATERIALES Y MÉTODOS
LÍNEAS CELULARES (CULTIVOS)
Cuando los tumores alcanzaron 10 mm de tamaño,
fueron eliminados, cortados en pedazos y se
incubaron durante 90 min en Dubelcco’s Modified
Eagle Medium (DMEM) que tiene colagenasa IV las
suspensiones de células
Se incubaron durante 30 minutos en tripsina A 37
grados y se pasaron por un filtro de células de 70 um

14. MATERIALES Y MÉTODOS
PFGE
Los sedimentos celulares
obtenidos fueron mezclados
con agarosa
Se ajustó el número de células
por tapón (a 100.000 células)
Se utilizaron alícuptas (se toma
parte de ese volumen).
Usaron el sedimento entero para
formar los tapones de células
obtenidas de la desagregación
del tumor.

15. MATERIALES Y MÉTODOS
PFGE
Fueron pasadas a
Se cambió el
Refrigeración tubos con DMEM,
medio por uno
a 4°C después fueron
de
irradiadas
preincubación
Los tapones
celulares que no La reparación del
fueron irradiados DNA fue
fueron tratados interrumpida
paralelamente poniendo el tapón
con los radiados celular en hielo

16. MATERIALES Y MÉTODOS
PFGE
Los tapones celulares
fueron transferidos, para Las esquinas se
ser lisadas, a una rompen fácilmente
solucion buffer helada debido a la
que contiene Sodio fragilidad de los
laurolil-sarkosina y tapones de agarosa
proteinasa K en EDTA
(conservante). (Lisis=
duró 1 h)
Se aseguro que el
Fragmentos de mismo numero de
ADN fueron células fueran
resueltos por la cargadas en el
PFGE gel.

17. MATERIALES Y MÉTODOS
PFGE
Cromosomas de La suma de la
Saccharomyces fluorescencia dentro
cervisiae y de las extensiones de
Schizosaccharomy ADN fue usada para
ces pombe fueron calcular y valor las
usados como diferencias entre
marcadores de cada experimento.
ADN
El ADN adquirio
intesidad
Los geles fueron fluorescente y se
teñidos, lavados y transformo a
transiluminados. unidades de
densidad optica.

18. MATERIALES Y MÉTODOS
.
INMUNOFLUORESCENCIAS
La inmunofluorescencia (IF) es una técnica que emplea
anticuerpos conjugados a fluorocromos.
Los fluorocromos son moléculas que al ser excitadas con la
energía de una determinada longitud de onda son capaces
de emitir energía de una longitud de onda mayor
Propósito: Que la determinación de fosforilación de H2AX y la
activación de las caspasas 3 se da por inmunofluorescencias

19. MATERIALES Y MÉTODOS
INMUNOFLUORESCENCIAS
Primero unas secciones del tapón de células se pusieron en el criostato
Se agregó 4% del buffer neutro de formaldehido , se lavó con 0.1%
de tritón en PBS por 10 min
Incubación por una hora con proteínas bloqueadoras de la solución.
Las tiras fueron incubadas con anticuerpos primarios de la antifosfohistona H2AX
(gen que codifica H2) seguido de incubación con los segundos anticuerpos alexa
fluor 488 mas alexa fluor 594 (Tinciones) Todo en una dilución 1:500

20. MATERIALES Y MÉTODOS
INMUNOFLUORESCENCIAS .
Capturación de imágenes por un microscopio
especial de alta resolución y tecnología
Conteo de células por un software
Activación de la apoptosis de las células que
estaban en monocapa se examinó mediante IF
específica (uso de Nuclear-PRO 3 tinte
principalmente

21. MATERIALES Y MÉTODOS
Elementos que bloquean
INHIBIDORES DE CASPASAS los activadores de las
caspasas.
• Las células • Las células • Ambas
tapón fueron obtenidas sustancias
tratadas con fueron fueron
un ihnibidor tratadas con incubadas por
general de el inhibidor una hora
caspasas, Caspasa-3 antes de ser
para impedir zvd-fmk encapsuladas
apoptosis en la célula.

22. RESULTADOS
FIGURA 1
En la figura 1 se analiza el resultado del
PFGE para la línea celular trabajada
(A431) encapsulada primero en
agarosa
La cantidad del ADN liberado (lo mide
la densidad óptica dado en unidades
arbitrarias= UA) y se representa en
unidad de tiempo (en horas)
Lo no irradiado (barras negras) y los
tapones celulares de 45 Gy (barras
blancas) La cuantificación empieza por debajo
de la zona de compresión

23. RESULTADOS
FIGURA 1
En la figura 1 se muestra:
1. DNA intactos sin irradiación en las
diferentes horas de cultivo (U) y
bajo el efecto de los Gy de
irradiación en el tiempo (I).
2. Los (I) muestran una zona de
engrosamiento por debajo de los
pozos de siembra del gen y un DNA
barrido (esto es producto de la
degradación) y además la
extracción del DNA es menor en las
células expuestas con más tiempo
a más radiación.
Gy: Unidad que mide la dosis absorbida de radiaciones
ionizantes en un determinado material

24. RESULTADOS
FIGURA 2
La activación de las
caspasas y el aumento de la
radiación inducida por la
fluorescencia de H2AX
disminuyó con el tiempo.
Los tapones celulares con
reparación se tiñeron con
azul.
La fluorescencia de la
caspasa en células con ésta
activada con rojo.
H2AX con fluorescencia con
verde.

25. RESULTADOS
FIGURA 2
Para evaluar la activación de
la apoptosis, midieron los
niveles de caspasa 3.
Se muestra que la apoptosis
es independiente de la
irradiación, que el mismo
medio de la agarosa lo
induce.
Esto muestra que la agarosa
participa de manera
espontánea en la
degradación del DNA.

26. RESULTADOS
FIGURA 3
A-PRO tiñe
núcleos
Fluorescencia
de la
caspasa
Cuadros
combinados
A pesar de la irradiación, la fragmentación nuclear y
La la condensación de la cromatina asociada, la apoptosis fue
apoptosis fue mínima pero junto a la activación específica de
insignificante. caspasa-3.

27. RESULTADOS
FIGURA 4
Los inhibidores de las caspasas
bloquean la apoptosis
inducida por la encapsulación
en agarosa.
Barras negras: fragmentación
espontánea durante la
incubación de células tapón (a
mayor tiempo más
fragmentación)

28. RESULTADOS
FIGURA 4
Barras grises:
inhibidores Zvad-fmk
No diferencias significativas
entre A431 y NP18

29. RESULTADOS
FIGURA 5
La reducción de la apoptosis mejoró la
estimación de la reparación del DNA en los
injertos.
PFGE se realizó en no irradiados (barras
negras) e irradiado con 45 Gy(barras
blancas)
La fragmentación espontánea (barras
negras) aumentó en ausencia de Zdv-
fmk
La radiación inducida por roturas
disminuyó con el tiempo.

30. DISCUSSION
Frisch SM, Screaton RA
This is the first study to describe that the
spontaneously released DNA in cell-plugs
reflects an ongoing homeless-induced
apoptosis, referred to as anoikis.
agree

31. CONCLUSIONS
Brown DG, Sun XM, Cohen GM:
when cells are embedded in agarose. DNA cleavage into
large fragments is an early event observed in the
apoptotic cascade before the typical endonuclease
cleavage into 180 to 200 bp can be detected as a DNA
ladder.
agree

32. CONCLUSIONS
Bonner WM, Redon CE, Dickey JS, Nakamura AJ,
Sedelnikova OA, Solier S,
Pommier Y:
After elucidating the mechanism behind DNA
degradation, it seemed reasonable to conclude
that apoptosis initiation was occurring in both
unirradiated and irradiated cell-plugs.
agree

33. CONCLUSIONS
Liotta LA, Kohn E:
The clinical significance of resistance to
anoikis is increasingly associated with
malignant phenotypes, therapy resistance,
and poor prognosis.
agree

34. CONCLUSIONS
It´s difficult to quantify
the DNA repair, you can
only know the cells that
didn´t do apoptosis. Is
assumed that if the cell
didn´t do apoptosis its
DNA was repaired.

35. CONCLUSIONS
Although the agarose is the
ideal medium for PFGE, it
causes DNA fragmentation
and apoptosis of some cells.
This may have inceased the
number of cells with
apoptosis (but not only by
DNA damage)

36. CONCLUSIONS
 Thisexperiment allows the generation of
posterior studies about the origin
of malignant neoplastic phenomenons.

37. CONCLUSIONS
 It promotes literature sources to
generate new techniques to improve the
effectiveness and efficiency of cancer
treatments, where patients can get the
expected results with the least
damage possible.

38. Sara Rendón Villa

40. BIBLIOGRAPHY
 MARTINEZ SÁNCHEZ, Lina María. Biología
molecular. 2. ed. Medellín: UPB. Fac. de
Medicina, 2006. 208 p.
 Eder M, Gedik P (1979) Manual de
Patología General y Anatomía
Patológica. Traducción de la 30ª edición
alemana. Editorial Científica-Médica,
Barcelona.