Medicine students

1. Molecular biology
Presented by:Valentina Duque andTatiana Gomez
Medicine
III semester

2. INTRODUCTION
• Is an abnormal growth of cells which tend to proliferate in an uncontrolled
way and, in some cases, to metastasize.
• It can involve any tissue of the body and have many different forms in each
body area.
• The cancer genome is characterized by mutations, deletions, amplification,
chromosomal translocations and microsatellite instability. Genomic
rearrangements including inversions, translocations or interstitial deletions
have also been identified in malignancies.
Cancer

3. Colorectal cancer
• A malignant tumor arising from the inner wall of the large intestine.
• Risk include colon polyps, long-standing ulcerative colitis, and genetic family
history.
• Colon polyps and early colon cancer can have no symptoms.Therefore, regular
screening is important, starting at age 50 (or earlier, if added risk factors are
present).
• Diagnosis can be made by barium enema or by colonoscopy, with biopsy
confirmation of cancer tissue. Surgery is the most common treatment for
colorectal cancer.
INTRODUCTION

4. Rad51C
• Is involved early and late stages of homologous recombination repair, as a strand transfer protein.
• It participates in resolution of holiday junction intermediates, in different stages of homologous
recombination.
• Biochemical evidence shows that it forms a dimer by interaction with Rad51B, which exerts single
stranded DNA-dependent ATPase activity.
• Defects in this protein have been documented as the cause of Fanconi Anemia (FA).
• It has a functional downstream role in interstrand cross links (ICL’s), during DNA repair process.
• It participates in (ICL’s) and double strand break-induced DNA damage signalling and controls intra-S-
phase checkpoint through CHK2 activation.
INTRODUCTION

5. Ataxin 7
• Is one of the autosomal dominant cerebellar ataxia (ADCA), characterized by progressive
degeneration of the cerebellum, brain stem and spinal cord.
• This locus has been mapped to chromosome 3 and it is showed that the disease allele associated
with spinocerebellar ataxia is caused by the expansión of the CAG repeats, producing an elonated
polyglutamine tract in the corresponding protein.
• It plays a role in the chromatin remodelation, and thus it plays a role in transcriptional regulation.
INTRODUCTION

6. Rad51C-Ataxin-7
Breast cancer cell lines
Rad 51C is
frequently amplified
Lung tumor genomic DNA
samples
LS- 174T cell
This fusión
gene is
associated
with
However, the presence of
this fusión gene in other
tumor types has not been
previously documented
INTRODUCTION

8. CANCER COLORECTALtype
GENES
Rad51-C-
ATAXN-7
Signs and
symptoms:
• Changes in intestinal habits
• Diarrhea, constripation
• Blood in the stool
• Stomach ache
• Weightloss
• Fatigue
• Anemia

9. Objective
To evaluate the expression and
frequency of the fusion gene
formed between Rad51C and
ATXN-7 in colorectal tumors, as
well as association of the fusion
gene with functional impairment
of the FA DNA repair pathway

10. MÉTODOS
Tejidos:
se usan para hacer un análisis histológico de un órgano determinado del cuerpo con el objetivo de detectar
anomalías.
 En el estudio se usaron muestras de tumores colorectales para hacer un análisis histológico de estos, y la
precipitación y cuantificación (en una absorbancia de 260 y 280 nm) del DNA y RNA presente en las
muestras.

11. PCR:
Es una técnica de laboratorio para amplificar pequeños fragmentos de DNA
para el estudio de su secuencias y así poder diagnosticar enfermedades y
alteraciones estructurales.
En el estudio se empleó para estudiar el DNA de las muestras de las células
LS-174T (relacionadas con el cáncer de colón)
MÉTODOS

12. RT-PCR:
Para generar una gran cantidad de copias de ADN, proceso llamado
"amplificación". E l ARN es retrotranscrito en ADN complementario (ADNc) usando
una transcriptasa inversa, y el resultado, se amplifica en una PCR tradicional.
Se uso para crear 2 variantes de cDNA, cada uno con dos exones, uno del gen
Rad51-C y otro del del ATXN-7 que luego se amplificaron.
La variente 2 represento la fusión de los dos genes que codificaba una proteína de
110 KDa que contenia un dominio especifico del Rad51C para la función de una
ATPasa.
MÉTODOS

13. Topo TA clonación:
Para la eficiente y rápida clonación de material genético y subsiguiente
secuenciación.
Clonación: es la reproducción de un individuo o material genético a partir de
uno pre existente, dejando dos modelos con idéntica información genética.
Se uso para clonar los productos obtenidos luego del proceso de la RT-PCR y
analizar su secuencia. Ademas, para identificar la variente 2, estas secuencias
obtenidas de los clones fueron comparadas con las secuencias del ARNm de
Rad51C y ATXN7
MÉTODOS

14. Tinción de inmunofluorescencia:
Es una técnica de inmunomarcación que hace uso de anticuerpos unidos
químicamente a una sustancia fluorescente para demostrar la presencia de una
determinada molécula.
 En el estudio se uso para identificar la presencia del gen FANCD2 en el
núcleo de las células proliferativas del cáncer colorectal ya que la ausencia de
este gen está relacionada con la fusión de Rad-51c y ATAXN-7.
MÉTODOS

15. .
Tratamiento celular con 5-azacitidina:
Ejerce sus efectos antineoplásicos mediante diversos mecanismos, entre los
que se incluye la citotoxicidad sobre las células hematopoyéticas anormales en
la médula ósea y la hipometilación del ADN.
 En el estudio se uso para hipometilar los sitios CpG en la región promotora
del gen Rad51C y así evaluar la expresión del gen de fusión y comparar esta en
las células LS-174 T y RKO.
MÉTODOS

16. PCR en tiempo real:
Utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta
el producto de la amplificación de DNA. Para ello emplea, un molde de DNA, un par
de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado, y una DNA
polimerasa termoestable.
 Se uso para analizar la expresión de la fusión Rad-51c-ATAXN7 luego del
tratamiento hipomemetilante y compararlo con las células de control las cuales no
fueron tratadas.
MÉTODOS

17. Inmunoprecipitación:
Es un método de detección de complejos en una solución (DNA, RNA,
proteínas) mediante la precipitación de la interacción de un anticuerpo con su
blanco de unión específico.
 Se utilizo para analizar el nivel de expresión del ARN en la fusión de los genes
al ser transcrito inversamente a cDNA y utilizarse como modelo en las células
tratadas con el hipometilante y así compararlo con las células de control.
(analizar nivel de expresión génica).
MÉTODOS

18. Inmunoblot:
Se usa para detectar proteínas específicas en una muestra determinada.
Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio
que se desee.
 El western inmunoblot se utilizó para estudiar la proteína de fusión entre Rad-
51c y ATAXN7 en células de tumor de colón, obtenida gracias a la
inmunoprecipitación. Se observo una proteína de 110KDa en las células LS-174T
inmunoprecipitadas.
MÉTODOS

19. MTT:
Es un agente de reticulación entre hebras de DNA.
Método utilizado para medir supervivencia y proliferación celular, además de la citotoxicidad de
agentes medicinales o materiales tóxicos que pueden causar impacto en las células.
 Se uso para analizar la estabilidad de las células luego de ser tratadas con cisplatino para definir
la sensibilidad de estas a este tratamiento.
Medicamento basado en platino
usado en quimioterapia para el
tratamiento de varios tipos de
cáncer, causando apoptosis
MÉTODOS

20. RESULTADOS

21. RESULTADOS

22. RESULTADOS

23. DISCUSSION
AUTOR THEORY AUTHOR OPINION
Fearon ER, et al. 2011 Alterations in several important
pathways are involved in the
initiation and progression of
colorectal cancers. These
alterations include the common
mutation in some genes (APC,
TP53,SMAD4…)
Fearon ER, et al. 2011 By deep sequencing of colorectal
tumors, many fusion genes have
been identified.
Yamada NA, et al. 2004 The N-terminus domain of Rad51C
has DNA dependent ATPase
function, important for
homologous recombination
mediator activity.
Kalvala A, et al. 2015 Several hypermethylated CpG sites
in the promoter of Rad51C regulate
Rad51C isoforms.

24. CONCLUTIONS
• Determinating the genetic structure of a tumor, it’s posible gene
recombination and modifications are very helpful not only in the
diagnosis, but for the right treatment of the expressed patology,
depending on the factors that can influence in the diferent variances
of the disease, like in the case of he fusion between Rad51C and
ATAXN7.
• It’s importantant to make a biochemical and stadistic analysis about
the consecuences that can leave the fusión of some genes, like in this
case, Rad51-C-ATXN7, because their appearance is related with the
absence of FANCD2 DNA repair foci in colorectal tumors.

25. CONCLUTIONS
• A real big key they found in the investigaion was that using
5Azacytidine up regulated the fusión gene expression, indicating that
Rad51C promoter methylation can regulate the expression of the
fusion gene variants in colorectal cáncer.
• Using chemical agents like cisplatin can help patients to respond
better to the treatment for colorectal cáncer, as being this substance
an apoptsis promoter, as it it seen in the study, in which LS-174T cells
infected with cancer were sensible to it and die.

28. REFERENCES
• http://www.medicinenet.com/script/main/art.asp?articlekey=2795
• http://www.cancer.net/es/tipos-de-c%C3%A1ncer/c%C3%A1ncer-
colorrectal/signos-y-s%C3%ADntomas
• file:///C:/Users/User/Downloads/Colon%20cancer%20and%20normal%2
0cell%20lines.pdf