2. PCR
• El aislamiento de grandes cantidades de
segmentos específicos de ADN puede ser
realizado utilizando varias técnicas, una de
las cuales es la Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR).
3. • La PCR está basada en una reacción de
síntesis de DNA llevada a cabo in vitro por
la enzima Taq Polimerasa, una polimerasa
de DNA resistente a la temperatura.
4. Componentes de la reacción:
• El tampón (buffer)
• Los nucleótidos (dNTP´s)
• Los cebadores (primers)
• El ADN (muestra)
• La polimerasa (taq Polimerasa)
5. Parámetros de la reacción:
• Temperaturas en cada parte del ciclo
• Duración de cada parte del ciclo
• Velocidad de enfriamiento y calentamiento
• Número de ciclos
6. • En abril de 1983, Kary Mullis da a conocer la técnica de
reacción en cadena de la polimerasa, o PCR. Esta técnica
ha invadido de tal forma la Biología Molecular, que hoy en
día es muy difícil imaginar esta ciencia sin ella. En 1989,
Science seleccionó el PCR como el principal desarrollo
científico, y la Taq polimerasa como la molécula del año.
En 1993, Kary Mullis recibió por este descubrimiento el
Premio Nobel de Química.
7. • Gracias a la PCR, la "insuficiente cantidad de ADN" ya no
es una limitación en la investigación en Biología
Molecular, ni en los procedimientos de diagnóstico
basados en el estudio del ADN. El número de aplicaciones
de esta técnica parecen infinitas, y continúan creciendo sin
parar. Una de sus posibles aplicaciones se centra en la
secuenciación del ADN de muestras biológicas.
8. Desnaturalización
• Dos pequeños fragmentos de ADN, típicamente de
10 pares de bases, llamados primers, son
sintetizados a través de otra técnica. Esos
primers son pequeños fragmentos de ADN que son
complementarios a cada una de las extremidades
de la secuencia de ADN de interés. En un tubo de
reacción son adicionados los primers, nucleótidos
libres de todas las bases nitrogenadas (adenina,
guanina,, timina y citosina), el ADN y una enzima
especial resistente al calor llamada Taq
polimerasa, que promueve la síntesis de ADN. La
mezcla es calentada a 95°C lo que provoca la
separación de las dos cadenas de ADN.
9. Alineamiento
• Enseguida, la mezcla es enfriada hasta
55°C, temperatura en la cual los primers
se unirán a las regiones complementarias
de las moléculas de ADN que están
separadas. En este momento, dentro del
tubo de reacción, todo el ADN está en
forma de cadena simple, menos las dos
pequeñas regiones en las cuales los
primers de 20 pares de bases se ligarán
a los dos lados de la secuencia de ADN.
10. Alargamiento (polimerización)
• La temperatura se eleva entonces hasta 72°C y
la Taq polimerasa comienza a sintetizar un
nuevo ADN, comenzando por las regiones en
doble cadena, en donde cada uno de los primers
se unió al molde de la muestra de ADN. La Taq
polimerasa promueve la síntesis de ADN apenas
en la región de doble cadena. La síntesis ocurre
a una tasa de aproximadamente 20 nucleótidos
por segundo, y en un minuto es sintetizada una
nueva copia del fragmento que se quiere
analizar.
11. Repetición del ciclo
• La reacción entonces es nuevamente
calentada a 95°C causando nuevamente la
separación de todo el ADN en las
cadenas simples. Al final del primer ciclo
hay dos cadenas de la molécula original
de ADN mas dos copias de la región de
interés.
12. • La temperatura es disminuida de nuevo a
55°C y ahora los primers se irán a unir a
los cuatro sitios en las dos copias nuevas
y también en la molécula original de
ADN. LA temperatura del ciclo es
nuevamente elevada a 72°C y se
multiplican entonces las cuatro cadenas
individualizadas.
13. • Estos ciclos son repetidos varias veces,
típicamente 30 veces, en un aparato llamado
termociclador. Al final de 30 ciclos de
amplificación existen aproximadamente un millón
de copias del segmento de ADN de interés por
cada molécula molde original de la muestra
inicial. Es así que podemos seleccionar un
fragmento específico dentro de todo el ADN.
14. • Estos ciclos son repetidos varias veces,
típicamente 30 veces, en un aparato
llamado termociclador. Al final de 30
ciclos de amplificación existen
aproximadamente un millón de copias del
segmento de ADN de interés por cada
molécula molde original de la muestra
inicial. Es así que podemos seleccionar un
fragmento específico dentro de todo el
ADN
