14-PRUEBAS REACTIVIDAD CUTANEA E IRRITABILIDAD OCULAR.pdf
1. PRUEBAS DE
REACTIVIDAD CUTÁNEA E
IRRITABILIDAD OCULAR
UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN
ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
Mgr. Q.F. Mónica Chipana Flores
2. VALORACIÓN DE LA IRRITACIÓN
OCULAR Y DÉRMICA
Ubicación
Anatómica
Exposición
Efectos
Adversos
Accidental
Voluntaria Irritación
3. VALORACIÓN DE LA IRRITACIÓN
OCULAR Y DÉRMICA
Destinado o no a su aplicación tópica.
Producto
Químico Farmacéutico Cosmético
Potencial irritante
Dérmico Ocular
Evaluar
4. ANTECEDENTES
1933 mujer Estadounidense de 30 años se quedó ciega
después de utilizar una máscara de pestañas que
contenía parafenilendiamina, una sustancia química
Causar blefaritis alérgica, queratoconjuntivitis crónica,
queratitis bacteriana secundaria.
1938 la Federal Food, Drug and Cosmetic Act.
Fabricantes responsables de seguridad de sus
productos cosméticos.
Evaluar seguridad antes de comercializar sus
productos.
5. Durante los años 40 y como jefe del departamento de toxicidad
dérmica y ocular de la Food and Drug Administration (FDA),
un método para valorar la toxicidad de los productos que se
administran por vía tópica, tanto a nivel cutáneo como ocular.
A principios de los años 60, empezaron a conocerse estos ensayos
como la técnica de Draize o el ensayo de Draize.
Actualmente, los métodos que utilizan animales de laboratorio
para la valoración descriptiva de los efectos adversos sobre el
ojo o la piel.
Y se encuentran aprobados y aceptados por la Organización
para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OCDE).
ANTECEDENTES
7. ENSAYOS DETOXICIDAD CUTANEAY OCULAR:
Aplicación en la Industria Cosmética y farmacéutica
Las diversas formulaciones cosméticas tienen como objetivo
mantener un aspecto joven y lozano de la superficie del
cuerpo y se han clasificado de acuerdo a la parte del cuerpo
a la que está destinado su uso:
- Cosméticos para la piel (Polvos, cremas, lociones, jabones,
lápiz, barras de labios, etc.)
- Cosméticos para el cabello (Champúes, tintes, etc.)
- Cosméticos para los ojos (Rimel, sombras, etc.)
8. ❖ Es conocido que algunos agentes que forman parte de la
formulación de estos cosméticos pueden causar efectos
irritantes en la piel u ojos, cuyo grado de severidad va a
depender de la concentración del agente y de forma de
uso del compuesto (tiempo de exposición).
❖ Asimismo existe una serie de medicamentos y vehículos
que se aplican tópicamente para obtener efectos locales
y generales, que son capaces de alterar las características
físicas de la piel.
❖ El estudio de la actividad y toxicidad (irritación) provocada
por las sustancias que se aplican localmente a la piel y a
las mucosas, se efectúa por lo general en el conejo, el
cobayo y en algunos casos especiales en la piel humana.
9. La piel reacciona con la inflamación al estimulo irritativo, al igual
que otros tejidos, los estadios sucesivos de la reacción incluyen el
eritema, la vesícula, la pústula y la úlcera.
En la actualidad no existe normatividad peruana en cosméticos ni
en medicamentos para la selección de una técnica y
especificación para evaluar el grado de irritación en piel,
quedando a criterio de los laboratorios productores, por ejemplo
se considera que una crema no debe ser irritante mientras que
una loción que contiene alcohol puede tener algún grado de
irritación.
Existen diversas técnicas para evaluar el grado de irritación en la
piel, la mayoría de ellas emplean al conejo.
SENSIBILIDAD CUTANEA
10. PRUEBA DE SENSIBILIDAD CUTANEAY
REACTIVIDAD AGUDA EN CONEJOS
Método de Finklestein modificado
1. Fundamento:
La prueba mide la irritabilidad aditiva producida por una
substancia de prueba y un irritante primario (formaldehído). Un
colorante vital es inyectado por vía endovenosa, donde se une a
las proteínas circulantes y es extravasado en la piel inflamada y/o
irritada por la acción de la substancia de prueba.
Como control positivo se emplea etanol absoluto y como
control negativo se emplea agua destilada o aceite vegetal según
sea el caso.
2. Modelo animal:
- Conejos albinos, machos, de 2 a 2.5 kg.
11. 3. Reactivos:
- Solución acuosa de azul de Evans al 1%
- Solución de formaldehído al 10%
- Etanol absoluto
- Agua destilada (solución control) ó
- Aceite vegetal (solución control)
4. Materiales:
- Crema depilatoria
- Parches oclusivos
- Torundas de algodón
- Lápiz de cera
- Gasa aséptica
- Jeringas estériles descartables 2 ml con aguja #26
- Reloj
12. 5. Procedimiento:
♣ El conejo es colocado en posición supina (exponiendo el
abdomen) sobre una mesa y su abdomen es depilado
cuidadosamente.
♣ Veinticuatro horas después el animal es colocado nuevamente
en la mesa y con un lápiz de cera se demarca en el abdomen
hasta ocho áreas de 2,5 cm de diámetro. Con ayuda de una
torunda de algodón se aplica en cada área 0,1 ml de solución
de formaldehído al 10% y se deja secar por evaporación
(repetir el procedimiento tres veces sucesivas).
13. - Los parches oclusivos se impregnan con las muestras
problema y/o controles (positivo y negativo), y se colocan en
las áreas pretratadas con solución de formaldehído.
- Se colocan un mínimo de tres parches por cada muestra a
evaluar.
- Toda el área del abdomen es inmovilizado con la ayuda de una
gasa a manera de faja.
- Inmediatamente después se inyecta 1,5 ml de la solución de
Azul de Evans al 1% por vía endovenosa.
- La evolución de las lesiones se evalúa a las 1, 6, 9, 16 y 24
horas, después de inyectado el colorante.
14. 6. Evaluación
El control positivo, desarrolla una mancha de color azul intenso
(100%). El control negativo no desarrolla mancha coloreada (0%).
Para la evaluación se determina comparativamente con el
control positivo, una escala semicuantitativa (Tabla 1) basada en
la intensidad de color desarrollada en el área tratada.
15.
16. Otros métodos alternativos como el de Draize, Woodward y
Calvery emplea el dorso del conejo, inmovilizando en una mesa de
sujeción (Figura 1) y colocando las muestras en mangas cilíndricas
que están en contacto con la piel del animal.
El método de Finklestein es posterior al de Draize y Col. y tiene
una buena correlación con los resultados obtenidos con
voluntarios humanos.
17. IRRITACIÓN DÉRMICA:
MECANISMOS IMPLICADOS
• Es una reacción inflamatoria
local de efectos reversibles.
• Aparición de eritema y
edema.
• Agudo: inflamación.
• Crónica: hiperproliferación e
hiperqueratosis transitoria.
18. PRUEBA DE IRRITACIÓN CUTÁNEA AGUDA
Principio: aplicación de una dosis única de la
sustancia a analizar.
En la piel de animales de experimentación.
Cada animal sirve como su propio control.
Excepto cuando se sospecha de
irritación/corrosión intensa.
El grado de irritación se lee y determina a
intervalos especificados. Se describe
completamente.
20. Evaluación de la prueba
Las evaluaciones deberán realizarse a los 30 o 60 minutos después de
remover el parche, a las 24 horas y a las 72 horas de iniciada la prueba.
21. PRUEBA DE IRRITACIÓN
CUTÁNEA AGUDA
Duración
• Evaluar
reversibilidad
irreversibilidad.
• No mayor a 14
días.
pH
• pH 2 o menor
• pH 11,5 o mayor
• Se predice
capacidad
corrosiva.
Sustancias
• Tóxicas LD50
menor de
200mg/kg.
• Límite de la
dosis de prueba
2000mg/kg de
peso corporal.
22. ENSAYO DE IRRITACIÓN DÉRMICA SEGÚN LA
GUÍA 404 DE LA OCDE.
Rasurar piel de la zona dorsal 24h
antes de la exposición.
Aplicar la sustancia a ensayar en un
área aproximada de 6cm2
Cubrir con gasa estéril y retirar a las
4h.
Valorar las lesiones 24h después.
Cuantificar las lesiones según la guía
404 de la OCDE.
27. IRRITABILIDAD OCULAR
La prueba de irritabilidad ocular en cosmética está dirigida a
algunos preparados (Rimel, sombras, champús) que por la
forma de uso podrán introducirse accidentalmente en la
mucosa del ojo.
*METODO DE IRRITABILIDAD OCULAR:
▪Se consideran cuatro parámetros para la interpretación de la
prueba: opacidad de la córnea, iritis, enrojecimiento de la
conjuntiva y quemosis.
▪Para cada muestra usar 6 conejos de cualquier sexo, de
entre 2.0 y 2,5 kg, de peso debiendo estar seguros de que
antes y durante la prueba estos animales se han mantenido
en condiciones óptimas, a fin de evitar que les caiga al ojo
polvo, aserrín o cualquier otro material extraño que pueda
producir irritación ocular.
28. ▪ Se examinan ambos ojos de cada animal que se pretende
emplear para la prueba, y sólo se escogen aquellos
animales sin defectos o irrigación ocular. Cada animal se
sujeta firme pero suavemente para que permanezca
quieto.
▪ Se aplica el material de prueba a un ojo de cada animal
jalando suavemente hacia afuera el párpado inferior del
globo ocular, a modo de formar una especie de recipiente
en el cual se deposita la muestra.
29. ▪ Mantener los párpados suavemente por un segundo, y
dejar al animal en reposo.
▪ El otro ojo, que permanece sin tratar, sirve como control.
Para probar líquidos, instilar 0,1 ml y para muestras
sólidas o en pasta se emplean 100 mg, excepto cuando la
sustancia está en escamas, gránulos, polvo u otra forma
particular, en cuyo caso aplicar 0,1 ml de la sustancia
compactada lo más que sea posible sin triturar ni alterar
las partículas individuales, aun cuando el peso de tal
volumen sea inferior a 100 mg. En tal caso, debe
registrarse el peso de la dosis de prueba.
30. ▪ Examinar los ojos a las 24, 48 y 72 horas, y registrar el grado
de reacción ocular.
▪ Si se cree conveniente, alguno o todos los ojos pueden lavarse
con solución salina fisiológica estéril, después de la lectura a las
24 horas.
▪ Se debe considerar que un animal exhibe una reacción positiva
si la sustancia a probar produce, a cualquiera de las lecturas,
ulceración de la córnea (que no sea un punteado fino),
opacidad de la misma (que no sea una disminución ligera del
lustre normal), iritis (que no sea una ligera profundización de
los dobleces o una leve inyección de los vasos sanguíneos
circuncorneales), o si dicha sustancia produce en la conjuntiva
excluyendo la córnea y el iris una inflamación obvia con
eversión parcial de los párpados o un enrojecimiento carmesí
difuso, con los vasos individuales no discernibles con facilidad.
31. ▪ La prueba debe considerarse positiva si 4 o más de los
animales en el grupo de prueba exhiben una reacción positiva.
▪ Si sólo un animal exhibe una reacción positiva, la prueba debe
considerarse como negativa. Si 2 o 3 animales muestran una
reacción positiva, la prueba se repite empleando un grupo
diferente de 6 animales.
▪ La segunda se considera positiva si 3 o más de los animales
exhiben una reacción positiva. Si sólo 1 o 2 de los animales de
la segunda prueba exhiben una reacción positiva, la prueba
debe repetirse con un grupo diferente de 6 animales.
▪ En caso de que se requiera una tercera prueba, la sustancia se
considerará como irritante si cualquier animal exhibe una
repuesta positiva.
32. TEST DE DRAIZE
• John H. Drize, toxicólogo
Jefe del Departamento de
Toxicidad Ocular y Dérmica
de la FDA.
• En 1944 desarrolló un
método para valorar la
toxicidad de productos
administrados vía tópica a
nivel ocular y dérmico.
• Aceptados por la FDA y
otros.
• Protocolos habituales.
33. TEST DE DRAIZE
Se utiliza para medir la irritación.
Mediante la observación de los daños
causados por una sustancia.
En la piel y ojos de los animales.
Identificar daños reversibles o irreversibles.
Valoración cualitativa a la que se atribuye
valor numérico.
Clasificar compuestos en función de su
efecto irritante.
34. TEST DE DRAIZE
CONEJOS ALBINOS
Baratos
Fáciles de obtener
No agresivos
Fáciles de manipular
Ojos grandes
35. IRRITACIÓN OCULAR
MECANISMOS INVOLUCRADOS
Córnea: permite el paso de la luz.
• Lesión altera estructura y
disminuye su transparencia.
• Disminución de visión o
ceguera.
• Opacidad corneal.
• Daños en el epitelio son
reversible.
• Daños en el endotelio son
irreversibles.
36. POSIBLE SECUENCIA DE ACONTECIMIENTOS EN LA
IRRITACIÓN OCULAR INDUCIDA POR PRODUCTOS
QUÍMICOS
37. TEST DE DRIZE DE IRRITACIÓN OCULAR
Conjuntiva
Grado de enrojecimiento Quemosis Presencia de exudados
Iris
Inflamación Pliegues Edemas Fotofobia Hemorragia
Destrucción
del tejido
Inyección ciliar
circuncorneal
Córnea
Opacidad Área afectada
El ensayo in vivo valora los efectos adversos de las sustancias
sobre:
Córnea Iris Conjuntiva
41. IRRITABILIDAD OCULAR EN COSMÉTICOS
(Método de Draize modificado)
Las variaciones del método de Draize para la
evaluación de cosméticos como por ejemplo champú,
crema de párpados, sombras, rimel, etc; han sido
realizadas no sólo para determinar el índice de
irritación ocular que puede causar el producto por el
uso continuo o la instilación accidental en el ojo, sino
que tiene como objetivo conocer si el producto puede
causar lesión en la córnea o daño ocular severo (índice
ocular alto), así como comparar el efecto irritante
ocular entre las diversas formulaciones de un mismo
producto.
42. IRRITABILIDAD OCULAR EN COSMÉTICOS
(Método de Draize modificado)
Las principales modificaciones efectuadas a la técnica original
incluyen:
a. El empleo de dosis múltiples de la muestra.
b.Ampliación del tiempo observación hasta 7 días.
c. Empleo de un índice numérico para la evaluación del
efecto
d. Tiene como objetivo comparar el índice de lesión ocular
de diversas formulaciones o lotes.
43. ▪ Con el fin de visualizar mejor el posible daño ocular se emplea
Fluoreceína al 2%.
▪ Las lecturas se realizan durante 7 días, según formato adjunto,
obteniéndose el índice ocular numérico por cada día en base a la
Tabla 2.
▪ Como resultado de la prueba se expresa el máximo índice
ocular numérico obtenido durante los siete días.
51. 1. pH
▪ Las lágrimas tienen un pH de 7,4 – 7,7 (tienen capacidad
tampón)
▪ En la preparación de colirios debe tenerse en cuenta el pH
óptimo (6,5-8,5)
▪ Ácidos : ac. cítrico, ác. bórico, fosfato monosódico
▪ Bases: citrato sódico , fosfato disódico
▪ Tampones (tampón fosfato y mezclas de ácido bórico y
borato sódico, ácido cítrico / citrato sódico). En los colirios
que contienen antibióticos, se utilizan tampones
bórico/borato.
▪ En los colirios con esteroides, sulfamidas, antihistamínicos o
alcaloides: tampones fosfato/difosfato
▪ Tampones borato y fosfato son incompatibles con las sales
de Ag, Mg, Zn : se puede utilizar citrato-fosfato
52. 2. Esterilidad:
•Métodos de esterilización de colirios:
❖ Autoclave (115 °C, 30’ ó 121 °C, 15’)
❖ Esterilización por calor seco
❖ Óxido de etileno
❖ Radiaciones ionizantes
❖ Filtración (0,22 μm)
•Preparación o Cabina de flujo laminar
53. 3. Limpidez (en colirios solución):
✓ Ausencia de partículas
✓ Filtración (filtros de membrana de 0,8 μm)
✓ Acondicionar en envases exentos de partículas
4.Viscosidad:
La viscosidad es la propiedad que describe la
adherencia del producto. Esto favorece el contacto
del principio activo con la mucosa conjuntival, y, por
tanto, su eficacia. Para conseguir la máxima
viscosidad sin afectar la estabilidad del colirio ni ser
irritante, se añaden diferentes sustancias inertes del
tipo de la metilcelulosa.
55. ENSAYOS DE COLIRIOS
1. Esterilidad
2. Masa o volumen extraíble
3. Medida del pH y del poder de
tamponamiento
4. Tonicidad
5. Viscosidad
6. Tamaño de las partículas
56. 1.Esterilidad
▪Filtración por membrana o inoculación directa
Los aplicadores también satisfacen el ensayo de
esterilidad:
Sacar el aplicador de su envase en condiciones
asépticas y transferirlo a un tubo con medio de cultivo
de forma que quede totalmente sumergido.
Incubar e interpretar los resultados según se describe
en el ensayo de esterilidad.
Si no se observa crecimiento microbiano, el producto
cumple el control de esterilidad.
57. 2. Masa o volumen extraible
•Vaciar al máximo posible el contenido de un envase y
calcular el peso o el volumen del contenido.
•Las emulsiones y suspensiones agitar el envase
antes de realizar el ensayo.
Resultado:
•El peso o el volumen no es menor que la cantidad
indicada en la etiqueta.
58. 3.Medida del pH y del poder de tamponamiento
Los colirios con el ajuste del pH evitan la sensación de dolor e
irritación y se ajustan a:
1. pH fisiológico
2. pH estabilidad del p.a. colirio bajo forma de polvo y
preparación extemporánea.
4.Tonicidad
Ajuste de la tonicidad: se usa cloruro sódico (NaCl), manitol o
sorbitol. Se considera isotónico en el intervalo de 0,7-2% p/v de
NaCl.
5.Viscosidad
Ajuste de la viscosidad: se usan sustancias mucoadhesivas como
hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), metilcelulosa (MC), alcohol
polivinílico, dextranos, Carbopol®.
59. 6.Tamaño de partícula (para suspensiones y
preparados semisólidos)
•Los colirios suspensión se analizan en un coulter o se
observan en microscopio
•Por cada 10 μg de p.a.:
◦No más de 20 partículas > 25μm y no más de 2 > 50 μm
◦Ninguna partícula > 90 μm
61. Prueba de conteo de partículas por
obstrucción de luz
Esta prueba se aplica a las soluciones oftálmicas, incluidas las
soluciones que han sido reconstituidas a partir de solidos estériles,
para los cuales se especifica una prueba de detección de Partículas. La
prueba cuenta las partículas solidas o líquidas en suspensión.
Interpretación: La solución oftálmica cumple con los requisitos de la
prueba si el numero promedio de partículas presente en las unidades
analizadas no excede del valor adecuado que se indica en la Tabla 1. Si
el numero promedio de partículas excede del lımite, analizar mediante
la Prueba de Conteo de Partículas Microscópicas.
62. La prueba de recuento de partículas microscópicas enumera
partículas subvisibles, esencialmente solidas, en soluciones oftálmicas,
luego de recogerlas sobre un filtro de membrana microporosa.
Algunas soluciones oftálmicas, tales como soluciones que no se filtran
fácilmente debido a su alta viscosidad, pueden quedar exentas de
análisis utilizando la prueba microscópica.
Interpretación: La solución oftálmica cumple con los requisitos de
la prueba si el numero promedio de partículas presente en las
unidades analizadas no excede del valor adecuado que se indica en la
Tabla 2.
PRUEBA DE CONTEO MICROSCÓPICO
DE PARTÍCULAS
