Introduction to Chromatography

1. Cromatografía

2. ¿Qué es la Cromatografía?
La cromatografía es un método muy utilizado en todas las ramas de la ciencia
que permite la separación, identificación y determinación de los componentes
químicos en mezclas complejas. Ningún otro método de separación es tan
potente y de aplicación tan general.
El término cromatografía fue introducido en 1906 por el botánico ruso Mikhalil
Tswett, para hacer referencia a la separación de los pigmentos contenidos en
extractos vegetales, conforme éstos se filtraban a través de una columna rellena
con un sólido poroso (Chicharro, 2005).

3. Es difícil definir el término cromatografía, ya que se aplicada a varios sistemas
y técnicas. Pero tienen en común una fase estacionaria y una fase móvil.
En todas las separaciones cromatográficas, la muestra se desplaza con una fase
móvil, que puede ser un gas, un líquido o un fluido supercrítico
La fase móvil se hace pasar a través de una fase estacionaria con la que es
inmiscible, y que se fija a una columna o a una superficie sólida.

4. La cromatografía no es más que el desplazamiento de una zona discreta de una
sustancia a lo largo de una capa de sorbente (fase estacionaria), en un flujo de
una fase móvil, debido a la múltiple repetición de actos de sorción y desorción
de sus moléculas en la fase estacionaria, en correspondencia con la constante
de distribución (KD) del sorbato entre la fase móvil y la fase estacionaria.
Las dos fases se eligen de tal forma, que los componentes de la muestra se
distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria.
Los componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se
mueven lentamente con el flujo de la fase móvil; por el contrario, los que se
unen débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez

5. Keulemans (1959) definió cromatografía
“Método físico de separación en el que los componentes a separar se
distribuyen en dos fases, una de las cuales constituye un lecho
estacionario de gran desarrollo superficial y la otra un fluido que
pasa a través o a lo largo del lecho estacionario (fase móvil)”.
La característica que distingue a la cromatografía de la mayoría de los métodos
físicos y químicos de separación, es que se ponen en contacto dos fases
mutuamente inmiscibles.

6. Una muestra que se introduce en la fase móvil es transportada a lo largo de la
columna que contiene una fase estacionaria distribuida.
Las especies de la muestra experimentan interacciones repetidas (repartos)
entre la fase móvil y la fase estacionaria. Cuando ambas fases se han escogido
en forma apropiada los componentes de la muestra se separan gradualmente en
bandas en la fase móvil.
Al final del proceso los componentes separados emergen en orden creciente de
interacción con la fase estacionaria. El componente menos retardado emerge
primero, el retenido más fuertemente eluye al último. El reparto entre las fases
aprovecha las diferencias entre las propiedades físicas y/o químicas de los
componentes de la muestra.

7. Su propósito es identificar, cuantificar o purificar cada uno de los
componentes de una mezcla de solutos, basándose en las velocidades con las
que se mueve cada soluto a través de un medio poroso arrastrado por un
solvente, una mezcla de solventes o porgas.
¿Para que sirve?

8.  La cromatografía tiene como rasgo la presencia de 2 fases
 Fase estacionaria: Permanece estacionaria dentro del Sistema. Los componentes
mas afines a la fase estacionaria avanzan lentamente (mas retenidos)
 Fase móvil: Se desplaza a lo largo de el. Los componentes mas afines a la fase
móvil (menos retenidos) avanzan con mayor rapidez
 Equilibrio de distribución >> la velocidad con la que se mueve cada sustancia
depende de su afinidad relativa por ambas fases o la clave de la separación

9. Introducción a la Cromatografía
 El medio cromatografico:
 Columna
 Placa
 Papel
Funciona como un controlador de la velocidad de cada sustancia.
Mediante el uso de un detector logra la caracterización química.
Logra su separación.

10. A continuación se presenta una tabla de la clasificación de los métodos cromatográfico en
columna, esta tabla tiene el fin de que resumir la clasificación de la cromatografía en
columna, y de forma breve ver sus métodos y su fundamento de función.

13. Adsorción: Proceso físico o químico por el cual átomos, iones o moléculas son atrapadas
o retenidas en la superficie de un material
Absorción: proceso físico o químico en el cual átomos, moléculas o iones pasan de una
primera fase a otra incorporándose al volumen de la segunda fase.

14. Si colocamos un detector al final de la columna que responde a la concentración del soluto y
se registra su señal en función del tiempo (o del volumen de fase móvil añadido) se obtiene
una serie de picos que representan un grafico denominado cromatograma
Este grafico es útil tanto para el análisis cualitativo como cuantitativo.
Fig. 1. Cromatograma característico de una mezcla de dos componentes.

15. El pico pequeño de la izquierda representa una especie que no se retiene en la
columna, y de esta forma alcanza el detector casi inmediatamente después del
inicio de la elución. Por tanto, su tiempo de retención tM es aproximadamente
igual al tiempo que emplea una molécula de la fase móvil para pasar a través de
la columna.
Es el tiempo que transcurre después de la inyección de la muestra hasta que el
pico de concentración del analito alcanza el detector; es el tiempo que tarda un
compuesto en salir de la columna; es el tiempo que tarda en aparecer el
máximo de un pico, (Fig.).
Tiempo de retención tR:

16. La velocidad lineal promedio de migración del soluto v es:
donde L es la longitud de la columna que esta rellena.
Tiempo muerto tM:
Tiempo necesario para que la especie no retenida alcance el detector; tiempo de
migración de la especie no retenida; tiempo necesario para que, por termino
medio, una molécula de la fase móvil pase a través de la columna, (Fig.1).
De manera semejante la velocidad lineal promedio u del movimiento de las
moléculas de la fase móvil es
𝜇 =
𝐿
𝑡 𝑀
𝑣 =
𝐿
𝑡 𝑅

17. Velocidades, Relación lineal de migración del soluto
Velocidad = distancia/Tiempo largo de Columna/ Tiempos Retención
Velocidad del soluto: Velocidad de la fase móvil : 𝜇 =
𝐿
𝑡 𝑀
𝑣 =
𝐿
𝑡 𝑅

18. En general, los equilibrios de distribución implicados en cromatografía se describen por
ecuaciones sencillas que suponen la transferencia de una analito (Muestra o Sustancia) entre
las fases estacionaria y la móvil. Así, para el soluto A, se puede escribir:
Constante de distribución:
La constante de equilibrio K para este proceso se denomina constante de distribución, la
razón de distribución o coeficiente de distribución, y mide la distribución del analito entre la
fase estacionaria y la fase móvil. Se define como:
donde CS es la concentración molar del soluto en la fase estacionaria y CM es la
concentración molar en la fase móvil.
CS = moles/Litro de analito en la fase estacionaria.
CM = moles/Litro de analito en la fase móvil.
Constante de Distribución (recomendado por la IUPAC) (antes: Coeficiente de Partición)

19. Factor de retención
Es un parámetro que describe la velocidad de migración de los solutos
(analitos) en la columna. Para una especie A, el factor de capacidad k’A se
define como
donde KA es el coeficiente de distribución de la especie A, VS es el volumen de la fase
estacionaria y VM es el volumen de la fase móvil.
Factor de Retención𝑘 𝐴 =
𝐾𝐴 𝑉𝑆
𝑉 𝑀
𝑘 𝐴 =
𝑡 𝑅 − 𝑡 𝑀
𝑡 𝑀
Tiempo de retención ajustado

20. L = largo de la columna (distancia)
s = desviación estándar en distancia
tR = tiempo de retención
t = desviación estándar en tiempo
𝜎
𝐿
=
𝜏
𝑡 𝑅
𝜏 = 𝜎
𝑡 𝑅
𝐿
Relación entre largo de la columna y Tiempos de Retención

21. Factor de selectividad
El factor de selectividad α de una columna para dos especies A y B se
define como:
donde KB es el coeficiente de distribución para la especie mas fuertemente retenida
B, y KA es el coeficiente de distribución para la menos retenida, o que es extraido
con mas rapidez, la especie A
Según esta definición a siempre es mayor que la unidad, por que B es el compuesto
más retenido (de > tR). donde kB y kA son los factores de capacidad de B y de A,
respectivamente.
𝛼 =
𝐾 𝐵
𝐾𝐴
𝛼 =
𝑘 𝐵
𝑘 𝐴
𝛼 =
𝑡 𝑅 𝐵 − 𝑡 𝑀
𝑡 𝑅 𝐴 − 𝑡 𝑀
Constante de
Distribución
Factor de
Retención
Tiempo de
Retención
𝑘 𝐴 =
𝑡 𝑅 𝐴 − 𝑡 𝑀
𝑡 𝑀
𝑘 𝐵 =
𝑡 𝑅 𝐵 − 𝑡 𝑀
𝑡 𝑀

22. Tiempo de Retención Relativo :
tRs = Tiempo de Retención del estándar interno
𝑅𝑅𝑇 =
𝑡 𝑅
𝑡 𝑅𝑠

23. Tiempos de Retención
tM = Tiempo de Retención fase móvil (tiempo muerto)
tR = Tiempo de Retención del analito (soluto)
tS = Tiempo en la fase estacionaria (Tiempo de Retención adjustado)
L = largo de la columna

24. Resolución cromatográfica
La resolución cromatográfica RS de una columna es una medida cuantitativa de su
capacidad para separar dos analitos. La resolución de una columna se define como
donde WA y WB son el ancho de los picos A y B.

25. De la siguiente Fig. se deduce que si R> 1.5 la separación de los componentes es
completa, o será incompleta sí R<1.5. Para una fase estacionaria dada, la
resolución puede mejorarse alargando la columna, aumentando así el número de
platos. Aunque una consecuencia negativa del aumento de platos es el incremento
del tiempo requerido para la separación.
Podemos definir, entonces, plato teórico como la longitud de una columna en la que
el soluto experimenta un equilibrio completo entre las dos fase. El número de platos
teóricos N de una columna de longitud L será:
𝑁 =
𝐿
𝐻
=
𝐿𝑜𝑛𝑔𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝐶𝑜𝑙𝑢𝑚𝑛𝑎
𝐴𝑙𝑡𝑢𝑟𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑝𝑙𝑎𝑡𝑜

26. Separaciones correspondientes
a tres resoluciones distintas.
Donde,
Rs = 2ΔZ/(WA + WB).

27. Eficiencia en cromatografía
La eficiencia se define en base a dos términos, que son medidas cuantitativas de la
eficiencia de una columna:
Los dos están relacionados por la
ecuación:
1º la altura del plato H
2º el número de platos N
𝑁 =
𝐿
𝐻
=
𝐿𝑜𝑛𝑔𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝐶𝑜𝑙𝑢𝑚𝑛𝑎 (𝑐𝑚)
𝐴𝑙𝑡𝑢𝑟𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑝𝑙𝑎𝑡𝑜 (𝑐𝑚)
De esta ecuación se deduce que la altura del plato H es:
𝐻 =
𝐿
𝑁

28. La eficacia de la columna cromatográfica aumenta cuanto mayor es el número de
platos, y cuanto menor es la altura de plato. Existen diferencias en las eficacias por
diferencias en el tipo de columna y/o el tipo de fases móvil y estacionaria. Las
eficacias en términos de número de platos varían de cientos a miles, y las alturas de
plato de unas pocas décimas a milésima de centímetro o menos.
Existe otra ecuación para calcular el número de
platos N

29. Definición del numero de platos N=16(tR/W)2
En este caso N se puede calcular a partir de dos medidas de tiempo, tR y W (ancho
del pico); para calcular H, se debe conocer la longitud del relleno de la columna L.
(Fig. siguiente)

30. En general se asume que las bandas cromatográficas tienen una forma gaussiana,
por ello resulta conveniente definir la eficacia de una columna en los términos de
varianza por unidad de longitud de la columna. De esta forma, la altura de plato H
viene dada por:
Esta definición de la altura de plato se ilustra en la Fig. Siguiente, donde se muestra
una columna con un relleno de L (cm) de longitud. Se muestra una gráfica que
representa la distribución de las moléculas del analito a lo largo de la columna en el
momento en que el pico del analito alcanza el extremo final del relleno (es decir, en
el tiempo de retención tR).

31. La curva es gaussiana, y la ubicación de L -1σ y L +1σ se indica mediante líneas
verticales discontinuas. Obsérvese que las unidades de L son centímetros y las de
σ2 son centímetros cuadrados; de este modo H representa una distancia lineal, en
centímetros (ecuación 1-11).
Definición de la altura de plato H=σ2/L

32. Relación entre largo de la columna y Tiempos de Retención

33. Determinación del número de platos teóricos
N = número de platos

34. Al existir diversas posibilidades de realizar el proceso de la separación cromatográfica,
existen diferentes formas de clasificar los métodos cromatográficos. Básicamente son:
De acuerdo a la fase móvil: cromatografía de gases y cromatografía líquida
De acuerdo al método de realización del análisis: elución (la más difundida), análisis
frontal, desplazamiento
De acuerdo al fenómeno de interacción: de adsorción, de reparto, de intercambio
iónico, permeación por gel

35. Cromatografía de Gases

37. Si los tR son iguales, no lograremos separación. Tampoco basta que sean distintos. Las condiciones cinéticas
deben ser tales que los actos de sorción desorción sean rápidos para aprovechar las potencialidades de la
separación. Esto explica el buscar las condiciones.

38. Cromatógrafo de gases con espectrómetro de masas

39. Parámetros que influyen en la distribución y por tanto en la retención
o Composición y propiedades de la fase móvil;
o Tipo y propiedades de la fase estacionaria;
o Las fuerzas intermoleculares entre el componente y las
fases;
o Temperatura

40. Una separación cromatográfica óptima se logra por la variación de las propiedades de las
fases y de los parámetros de operación, hasta obtener los parámetros de retención deseados
para cada componente. Los mismos van a estar determinados por la cinética de los procesos
de sorción, desorción y de transporte de masas.
 Elección de la fase estacionaria
 Elección de la temperatura
 Elección de la fase estacionaria Elección de la composición de la fase móvil
Interacciones electrostáticas intermoleculares
Fuerzas polares de van der Waals
Fuerzas de dispersión no polares
Puentes de Hidrógeno (tailing)
En cromatografía iónica – interacciones electrostáticas entre iones

42. Si los tR son iguales, no lograremos separación. Tampoco basta que sean distintos. Las condiciones cinéticas
deben ser tales que los actos de sorción desorción sean rápidos para aprovechar las potencialidades de la
separación. Esto explica el buscar las condiciones

44. El éxito de un sistema cromatográfico determinado se evalúa por su capacidad de resolución
y depende de los siguientes parámetros:
- Selectividad. Capacidad del sistema de discriminar entre compuestos relacionados
estructuralmente. Se refleja en los valores de Kd. Depende de la naturaleza química de las
fases fijas y móvil. Alta selectividad muestra la cromatografía de afinidad.
- Eficiencia. Es una medida de los efectos de difusión que producen picos más anchos y que
se sobreponen. Importante el empaque de la columna.
- Capacidad. Es un índice de la cantidad de material que puede ser resuelto sin sobreposición
de picos. La cromatografía de intercambio iónico y el cromato enfoque son de alta capacidad.

45. El éxito de un sistema cromatográfico determinado se evalúa por su
capacidad de resolución y depende de los siguientes parámetros:
- Selectividad. Capacidad del sistema de discriminar entre
compuestos relacionados estructuralmente. Se refleja en los valores
de Kd. Depende de la naturaleza química de las fases fijas y móvil.
Alta selectividad muestra la cromatografía de afinidad.
- Eficiencia. Es una medida de los efectos de difusión que producen
picos más anchos y que se sobreponen. Importante el empaque de la
columna.
- Capacidad. Es un índice de la cantidad de material que puede ser
resuelto sin sobreposición de picos. La cromatografía de intercambio
iónico y el cromatoenfoque son de alta capacidad.

46. Aplicación de la Cromatografía
Con la cromatografía se separan especies químicas estrechamente relacionadas, esta
propiedad también suele estar acompañada del hecho que especies se está tratando, o bien
nos guía al rededor de que compuesto se trata; es decir tiene un carácter cualitativo.
Y con el avance de la tecnología en la última década, existen mecanismos e instrumentos
que nos permiten con gran precisión saber de que compuesto hablamos, pero también nos
indica en que proporciones encontramos a este.
Su empleo presenta notables ventajas:
1. Es sencilla, rápida y no requiere aparatos complicados.
2. Abarca escalas microanalíticas hasta escalas
industriales.
3. Es una técnica poco o nada destructiva que puede
aplicarse a sustancias lábiles.

47. Cromatografía en columna abierta

48. Clasificación de la cromatografía
Cromatografía en columna cerrada

49. Fin