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CROMATOGRAFIA
La cromatografía agrupa un importante y diverso conjunto de métodos, que
permiten separar componentes estrechamente relacionados en mezclas
complejas.
En todas las separaciones cromatográficas, la muestra que se desea separar se
disuelve en la denominada “fase móvil” que, normalmente, está formada por
un gas o un líquido.
Durante el proceso cromatográfico, se hace pasar la fase móvil a través de una
“fase estacionaria”, inmiscible, la cual se mantiene fija en una columna o en
una superficie sólida que actúa como soporte.
Las dos fases –móvil y estacionaria- se eligen de tal forma que los
componentes de la muestra se distribuyen en forma distinta entre ambas.
Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria,
se mueven lentamente con el flujo debido a la fase móvil. En cambio, aquellos
componentes de la muestra que tienen una reducida afinidad por la fase
estacionaria, se desplazan con una mayor rapidez al ser arrastrados por la fase
móvil.
Como consecuencia de estas diferencias en la movilidad, las distintas
sustancias que componen la muestra sometida a la cromatografía se separan en
una serie de bandas que, en última instancia, pueden ser analizadas tanto
cualitativa como cuantitativamente.
Las técnicas cromatográficas aplicadas fueron cromatografía plana y
cromatografía en columna.
Cromatografía plana
Los métodos de cromatografía plana incluyen la cromatografía en capa fina
(TLC) y la cromatografía en papel (PC). En todos los casos se emplea una
capa plana y relativamente delgada de un material que a su vez es el soporte, o
bien que recubre una superficie de vidrio, plástico o metálica. La fase móvil se
mueve a través de la estacionaria por capilaridad, a veces ayudada por
gravedad o por aplicación de un potencial eléctrico. En la actualidad, la
cromatografía en plano se centra en la técnica de la capa fina, que es más
rápida, tiene mejor resolución, y es más sensible que su alternativa en papel.
Las separaciones en capa fina se realizan en placas de vidrio o plástico que se
recubren con una capa delgada y adherente de partículas finamente dividas;
esta es la capa estacionaria. Las partículas son semejantes a las descritas en
cromatografía en columna de adsorción, de reparto en fase normal y en fase
inversa, y las fases móviles también son similares las utilizadas en
cromatografía de líquidos de alta eficacia en columna.
Las placas de capa fina se obtienen de forma comercial. Los tamaños son
varios 5X20, 10X20, y 20X20. Estas placas comerciales se presentan en dos
formatos. El convencional, donde las placas tienen un espesor de 200 a 250
μm un tamaño de partícula de 20 μm o más. Presentan por lo común unos
2000 platos teóricos en 12 cm. y con un tiempo de desarrollo de 25 min. El
segundo tipo de placas comerciales es el de alta eficacia, que tienen películas
de unos 100 μm de espesor, y un diámetro de partícula de 5 μm o menos. El
número de platos teóricos es mayor unos 4000 en 3cm y con 10 min. de
desarrollo. Las placas de alta eficacia permiten mejores separaciones y en
menos tiempo, pero tienen la desventaja de tener una menor capacidad de
carga.
La aplicación de la muestra es el aspecto mas critico de la cromatografía en
capa fina. Por lo general, se aplica una disolución de la muestra del 0,001 al
0,1 %, como una mancha, a 1 o 2 cm. del extremo de la placa. Pero para una
separación de mayor eficacia, la mancha debería tener un diámetro mínimo
aproximadamente 5nm para una aplicación cualitativa y menor para el análisis
cuantitativo, y en el caso de las disoluciones diluidas se realiza tres o cuatro
aplicaciones superpuestas secando la zona entre aplicación. La aplicación
puede ser manual o por aplicadores mecánicos. Si es manual es por contacto
entre la placa y un capilar que contiene la muestra, o utilizando una jeringa
hipodérmica. En el caso de que sea mecánico, se mejorara la precisión y
exactitud de la aplicación.
El desarrollo de la placa es un proceso análogo a la elución en la
cromatografía de líquidos, en el que la muestra es transportada por la fase
móvil a través de la fase estacionaria. La forma más común de desarrollar la
placa consiste en depositar una gota de la muestra cerca de unos de los
extremos de la placa, y marcar su posición con un lápiz. Tras la evaporación
del disolvente en el que estaba disuelta la muestra, se coloca la placa en un
recipiente cerrado y saturado con los vapores del disolvente con el que se
efectuara el desarrollo. Uno de los extremos de la placa se introduce en el
eluyente procurando evitar el contacto directo de este con la muestra.
El eluyente asciende por la placa gracias el efecto de capilaridad ejercido entre
las finas partículas. A medida que el eluyente se desplaza pasa por el punto de
aplicación de la muestra, la disuelve y la arrastra por la placa distribuyéndose
entre el disolvente que se desplaza y la fase estacionaria.
Después que el disolvente ha pasado a través de la mitad o las dos terceras
partes de la longitud de la placa, se retira esta del recipiente y se seca. Las
posiciones de la muestra se pueden determinar por distintos procedimientos.
Dos de ellos se usan con la mayoría de las mezclas de sustancias orgánicas.
Consisten en nebulizar sobre la placa una disolución de yodo o de ácido
sulfúrico, ya que ambos reaccionan con los compuestos orgánicos para dar
productos oscuros. También se utilizan reactivos específicos (como
dragendorff específico para alcaloides) para localizar las especies separadas.
Otro método de detección se basa en incorporar un material fluorescente a la
fase estacionaria. Una vez ha finalizado el desarrollo, se examina la placa bajo
luz ultravioleta. Los componentes de la muestra amortiguan la fluorescencia
del material de tal forma que, toda la placa exhibe fluorescencia menos los
lugares donde están los componentes de la muestra, no fluorescentes.
Cromatografía en columna
Es preciso conocer el concepto de elución en columna. La figura muestra
como dos sustancias A y B se separan en una columna por cromatografía de
elusión con una fase móvil. La elución implica el transporte de una especie a
través de una columna por la adición continuada de nueva fase móvil. El
proceso empieza cuando una única porción de la muestra se introduce en la
parte superior de la columna (tiempo t0) después de lo cual los componente de
la muestra se distribuyen entre las dos fases, La introducción de fase móvil
adicional, el eluyente, hace que la fase móvil que contiene una parte de la
muestra avance por la columna, donde tienen lugar una posterior reparto entre
la fase móvil y las porciones frescas de la fase estacionaria a las que accede
(tiempo t1). Al mismo tiempo, tiene lugar una distribución entre el disolvente
nuevo y la fase estacionaria en el lugar en el que inicialmente se ubicaba la
muestra.
Las sucesivas adiciones de la fase móvil hacen avanzar las moléculas de
soluto (analitos) por la columna en una serie de continuas transferencias entre
las fases estacionaria y móvil. Sin embargo, debido a que el movimiento de
los solutos solo puede ocurrir en la fase móvil, la velocidad media a la que una
zona de soluto migra en la columna depende de la fracción de tiempo que
reside en esta fase. Esta fracción de tiempo es pequeña para las sustancias que
son retenidas fuertemente por la fase estacionaria (compuesto B) y es grande
cuando es más probable la retención en la fase móvil (componente A). Las
diferencias de velocidad que resultan hacen que se separen los componentes
de la mezcla en bandas o zonas, que se localizan a lo largo de la columna
(tiempo t2). El aislamiento de las especies separadas se realiza haciendo pasar
suficiente cantidad de fase móvil a través de la columna hasta que las bandas
individuales salen de ella, pudiendo así detectarse o reconocerse (tiempos t3 y
t4).
TECNICAS CROMATOGRAFICAS PARA LA SEPARACION DE
COMPUESTOS
A. CROMATOGRAFIADE ADSORCION
Consiste en pasar la muestra sobre un adsorbente sólido (fase
estacionaria) y un eluyente líquido (fase móvil) para el caso de
cromatografía líquida; o un adsorbente sólido y un eluyente gaseoso
para el caso de cromatografía de gases.
ADSORBENTES
Deben tener alta capacidad de adsorción, ser insolubles en el eluyente, e
inertes a las sustancias a ser separadas porcromatografía
La estructura porosay la granulación dependerán si se usa columna
gravitacional o HPLC.
Los adsorbentes más usados son:
 Alúmina (óxido de aluminio) se utiliza para compuestos poco
polares, tiene mayor poder de adsorción, permite a veces separar
isómeros, la proporción que se utiliza es (1:20), es muy utilizada
para la separación de alcaloides.
 Silica gel (óxido de silicio) se utiliza para separar la mayoría de
compuestos; se emplea generalmente en proporción (1:40) .Peso
de la muestra a peso de sílice
 Silicato de magnesio (Florisil) tiene una Adsorbancia intermedia,
se utiliza para separar lípidos, glicósidos, azúcares.
 Poliamida, se utiliza para separar compuestos que pueden formar
puentes de hidrógeno tales como aminoácidos,
polihidroxicompuestos (compuestos con muchos grupos OH)
B. CROMATOGRAFIADE PARTICION
La fase estacionaria y la fase móvil son líquidos inmiscibles.
En general se emplea un sistema de dos fases, una rica en solvente
orgánico con que se eluye el cromatograma y la otra rica en agua que
constituye la fase estacionaria anclada al soporte. El conjunto fase móvil-
fase estacionaria puede estar integrado por más de dos componentes.
Un ejemplo típico: butanol-ácido acético-agua (4:1:5) para separar
alcaloides.
Los prototipos de cromatografía de partición lo constituye la: cromatografía de
papel y la cromatografía gas-líquido que son empleados como métodos
analíticos.
CROMATOGRAFÍA DE PAPEL
En la cromatografía de papel la muestra a separar es adsorbida sobre el punto
de aplicaciones del soporte: papel, el cual retiene el agua (fase estacionaria),
pero se puede saturar con otra fase estacionaria, por ejemplo dejándole
equilibrar con esta en una cámara cerrada, cámara cromatográfica, antes de
permitir el flujo del eluyente (fase móvil).
Cuando la muestra se disuelve mejor en solventes no polares el papel se
impregna con este solvente y el cromatograma se desarrolla en la fase acuosa.
Esta técnica se conoce como cromatografía en fase reverse. En este caso los
primeros a fluir soncompuestos más polares. Esto se puede aplicar a cualquier
técnica cromatografica de papel.
CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA (CCF)
Es una variante de la CC o en papel. La fase fija o estacionaria esta formada
por una capa delgada uniforme de adsorbente (cromatografía de adsorción) y
que sirve como soporte de la fase móvil (cromatografía de partición), tiene la
ventaja y la rapidez del desarrollo, y la versatilidad de las operaciones que se
pueden hacer sobre el sustrato: se abrevia TLC. La CCF se puede preparar en
los laboratorios ó comprarse en las casas comerciales llamados cromatofolios
de 20cmx 20 cm, que se cortan de acuerdo a las necesidades, en este caso el
soporte puede ser de aluminio, plástico y el adsorbente de 1mm de espesor
muy uniforme. Una de las variantes de la cromatografía de capa fina es la
cromatografía preparativa donde el soporte es de vidrio de 1 mm. de espesor.
Para la preparación de las placas, se utiliza el método de inmersión en una
suspensión del adsorbente en agua ó en CHCl3/ MeOH, 4es recomendable
utilizar un esparciador para asegurar una capa uniforme del espesor deseado
que va desde 0,25 hasta 1 mm.
Las placas se colocan sobre una bandeja fija, después de lavadas y secadas, se
esparcen con una suspensión del adsorbente en agua destilada. Las placas
comerciales tienen aditivos (generalmente yeso) para aumentar la fuerza de
adición al vidrio, indicadores de UV fluoresina de sodio que fluorese cuando
se expone a la luz de 254nm y el ácido sulfónico de hidroxipireno que fluirse a
366nm.
Hay una gran variedad de adsorbentes: Silicagel, alumina (neutra, básica,
ácida), celulosa, celita, poliamida. El adsorbente más común es la silicagel con
granulaciones de 20 a 1000 ªA , para compuestos no polares.
CROMATOGRAFIA DE COLUMNA (CC)
Es la más usada en la separación de productos naturales con tal finalidad se
emplean adsorbentes ya mencionados en la cromatografía de capa fina: gel de
sílice, alúmina celulosa, florosil, poliamida, sephadex, celulosa,
intercambiadores de iones, y resinas de intercambio iónico.
Actualmente se utilizan otros adsorbentes que permiten trabajar en fase
inversa para la separación de compuestos polares.
CROMATOGRAFIA PREPARATIVA (CP)
Se utiliza cuando se tienen mezcla de sustancias que son difíciles de separar por (CC).
El soporte o absorbente va adherido a una lámina de vidrio, el espesor del soporte es más ó
menos de 1mm de espesor (30 g) de absorbente para una placa de 20x20 cm.
La muestra se siembra a 1,5 cm de uno de los extremos de la placa y en toda la placa,
previamente se elige el absorbente adecuado, es decir donde se observa mayor separación
de los compuestos se introduce en cámaras o celdas cromatográficas y se procede a su
elusión, en algunos casos dependiendo de la separación de los compuestos se pueden fluir
varias veces, hasta lograr una buena separación.
Se retira los compuestos de la placa y se extrae con solvente apropiado del adsorbente.
CROMATOGRAFIA GASEOSA (CG.)
Posee como fase móvil un gas inerte que generalmente es nitrógeno, la fase
estacionaria puede ser un líquido (cromatografía gas-líquido) ó un sólido
(cromatografía gas- sólido)
Así mismo puede usarse combinando con técnicas espectroscópicas como
espectrometría de masa (CG-EM) en tal caso se necesita para adoptar las
condiciones del cromatógrafo gaseoso a los de vacío del espectrómetro de
masa, y eliminar el gas portador que en (CG-EM) es el Helio.
Esta técnica es analítica y es necesario contar con los patrones para poder
comparar las sustancias que se están analizando.
CROMATOGRAFIA DE ALTA RESOLUCION O PERFOMENCE (HPLC)
CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO
Un intercambiador de iones es un material insoluble en H2O que tiene grupos
funcionales capaces de intercambiar iones de carga similar de la solución
circundante. Hay materiales sintéticos y naturales orgánicos o inorgánicos,
entre estos se encuentran las zeolitas, óxidos, fosfatos de metales del grupo
IV. Entre los orgánicos naturales tenemos algodón, papel, que son sulfonados
o fosfatados.
Las resinas generalmente tienen una matriz de derivados de poli estireno,
celulosa, agarosa, y se les puede clasificar de acuerdo a los grupos iónicos.
Las resinas generalmente tienen una matriz de derivados de poli estireno,
celulosa, agarosa, y se les puede clasificar de acuerdo a los grupos iónicos.
1. Resinas aniónicas ( intercambian cationes)
a) R-SO3
- fuertemente ácida Dowex 50
b) R-OPO3
= fuertemente ácida Doulite C-63
c) R-CH2-CO2
- fuertemente ácida Amberlite CG-50
2. Resinas cationicas ( Intercambian aniones)
a) R-CH2NMe3
+ fuertemente básica Dowex 1-A6
b) R-NHMe2
+ fuertemente básica Doulite A-30
c) R-C2H4NH3 fuertemente básica Amberlite 45
Las resinas se empacan en columnas generalmente, para lo cual es necesario
acondicionarles primero, pues comercialmente se vende secas, se deben dejar
en reposo con agua (el intercambio iónico tiene lugar en el H2O por lo tanto se
realiza en medio acuoso. Esto provoca un aumento de las resinas. El
sobrenadante se decanta y el proceso se repite varias veces.
Las resinas hinchadas se ponen en contacto con la solución del contra ión que
será desplazado de la muestra, se lava hasta la neutralidad para asegurar que
toda la resina ha intercambiado el contraión y se equilibra con la mezcla de
solvente donde se disuelve la muestra. Posteriormente se lava la columna con
la mezcla del solvente hasta asegurar que no salgan iones de la columna y se
eluyan los compuestos de la muestra introducida con una base o un ácido
según sea el caso.
El orden de elusión dependerá de la naturaleza iónica, los más débiles serán
desplazados primero. Los más fuertes son adsorbidos aumentando la
concentración de los iones en el eluyente.
PREPARACION DE COLUMNAS CROMATOGRAFICAS
COLUMNA SECA.- Se elige la columna cromatografica, dependiendo de la
cantidad de muestra a cromatografiar, luego se llena la columna con una lluvia
uniforme del adsorbente previamente seleccionado, tiene el inconveniente que
el inchamiento del absorbente con el eluyente puede causar obstrucciones y
disminuir la velocidad de flujo de solvente, generalmente la altura del relleno
es de 12 cm, pero también depende del diámetro de la columna y la muestra a
cromatografiar. La muestra se coloca pre-adsorbida en una pequeña cantidad
de solvente.
Es necesario tener en cuenta que la muestra no puede permanecer mucho
tiempo en la columna en contacto con el adsorbente y el solvente, ya que se
puede descomponer, o la difusión de las bandas donde concentran los
compuestos inicialmente, con la pérdida consecuente de la resolución.
Este sistema puede modificarse, cuando se empaqueta el adsorbente muy
apretado y el flujo del eluyente es forzado a pasar por la columna con la ayuda
de presión en el eluyente y vacío a la salida de la columna.
COLUMNA HUMEDA.- Tiene 02 variantes: a).-se coloca el solvente
previamente seleccionado y luego se deja caer lentamente el adsorbente, se
golpea para ayudar la compactación sea uniforme. B).- La segunda se prepara
una suspensión uniforme del adsorbente de la fase móvil y se deja caer sobre
una capa de la fase móvil contenida en el tubo de vidrio. Esta tiene la ventaja
de una composición más uniforme y el inchamiento del adsorbente ocurre
antes de poner en la columna y evita las obstrucciones. La muestra se
introduce en solución concentrada, preferentemente disuelta en el mismo
solvente sobre la superficie del adsorbente, también la muestra se puede
colocar pre-adsorbida con el mismo solvente que se compactó la columna.
La elusión se comienza con el solvente menos polar y su polaridad se
incrementa dependiendo de los resultados de la separación.
ELUCIDACION (DETERMINACIÓN DE LA ESTUCTURA QUIMICA) DE
COMPUESTOS ORGANICOS
La elucidación ó determinación de la estructura química de compuestos orgánicos, puede
constituir una meta en sí o ser una etapa clave para trabajos posteriores.
Los métodos espectroscópicos especialmente RMN; IR, UV- espectrométricos de masa de
alta y baja resolución, son de uso cotidiano para este tipo de trabajo.
ESPECTROSCOPIA DE IR: Las que se observan en los espectros de IR van de 4000 a
200cm-1 y están relacionados con los cambios y estados vibracionales y rotacionales que
presentan las moléculas. La posición e intensidad de las bandas corresponden a un grupo
funcional que se encuentran distribuidas en varias zonas más ó menos constantes del
espectro. El análisis del espectro ofrece información sobre grupos funcionales presentes en
la molécula tales como la presencia de: Grupos OH, NH, CO, CHO COOOH, así como el
carácter alifático y aromático del compuesto.
La región comprendida entre 1300 y 900 cm-1, representan las huellas dactilares de las
moléculas, pues las bandas de esa región corresponden a las vibraciones y rotaciones del
esqueleto carbonado y por lo tanto son muy sensibles a los diferentes arreglos moleculares,
aún para sustancias muy similares, por eso se debe considerar cuidadosamente esta zona al
establecer la identidad de dos muestras por comparación de sus IR
ULTRA VIOLETA (UV/VIS).-Se correlaciona con las transiciones electrónicas, es decir la
transición de un electrón desde un estado fundamental a un estado excitado. La absorción de la
energía requerida para esta transición se registra en la región UV (190nm-380nm) y en la región
visible (380nm-70nm).- las señales del UV son muy anchos a diferencia de las señales del RMN e
IR debido a los múltiples cambios de estados vibracionales y rotacionales que acompañan a las
transiciones electrónicas. Para que se observe una absorción máxima debe existir en la molécula un
cromóforo generalmente conjugado, por un sistema de instauraciones múltiples, tal como dienos,
enona, aromático etc.
ESPECTROMETRIADE MASAS (EM). Un compuesto orgánico que se expone a una corriente
de electrones de alta energía (frecuencia de 70 ev) se degrada en fragmentos de las cuales las
especies con cargas positivas se registra en el espectro de masa; según la unidad de masa por el
número de cargos positivas (m/e donde e=1). Un aparato de EM de alta resolución registra la unidad
de masa del ión molecular (la masa que pierde un solo ión sin degradarse), con hasta 04 ó mas cifras
decimales el cual permite establecer la formula molecular correspondiente.
La fragmentación es una característica de los diferentes compuestos y esto es aprovechado para la
ubicación de ciertos grupos funcionales en entornos particulares de la molécula.
Fig. . Espectro de masa de 11-metoxytubotiwina
RESONANCIA MAGNETICA NUCLEAR (RMN).- método basado en la absorción de la
energía, por el cambio del espin molecular de átomos sometidos a un campo magnético externo. El
análisis del espectro de RMN ofrece evidencias específicas sobre las características de los núcleos
que forman una dada molécula, y los más frecuentes analizados son 1
H, 13
C, 15
N, 19
F y 31
P. Siendo
los dos primeros utilizados en análisis de rutina.
Los desplazamientos químicos de las señales de RMN de 1
H (0-20ppm) y de 13
C (0-220ppm) dan
información a cerca de la naturaleza de hidrógenos (alifáticos, aromáticos, olefínicos, geminales y
heteroatomos) y de 13
C.
Por la integración de las señales y la magnitud de la contaste de acoplamiento, multiplicidad de la
señal que se observa en el espectro de 1
H se deduce el # de hidrógenos y el modo de distribución en
la molécula.
Mientras que el número de señales presentes en el espectro de carbón, indica el número de carbón
presentes en la estructura, la multiplicidad muestra el # de átomos de Hidrógeno unidos al C
responsable de la señal.
Las técnicas de dos y tres dimensiones ofrecen información mucho más directa y presentan ventajas
enormes cuando se trata de esqueletos nuevos.
Fig. . Espectro de 1
H de 11-metoxytubotiwina
Fig. . Espectro de 1
C de 11-metoxytubotiwina
9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
ppm
0.680
0.696
0.710
0.795
0.810
0.824
0.828
0.843
0.858
1.243
1.792
1.805
1.810
1.818
1.830
1.843
1.850
2.007
2.029
2.507
2.518
2.820
2.846
2.859
2.867
2.881
3.053
3.072
3.099
3.114
3.754
3.763
3.775
3.863
6.387
6.401
7.005
7.022
7.250
8.795
NO
CH3
N
O
O
CH3
CH3
H
9
10
11
12
8
13 2
7 20
19
21
6 5
15
14 16
3
22
23
18
24
168 160 152 144 136 128 120 112 104 96 88 80 72 64 56 48 40 32 24 16 8
ppm
11.503
23.703
28.102
30.532
40.898
43.556
45.170
51.143
53.553
54.183
55.455
65.278
76.674
76.996
77.310
95.952
97.338
105.574
120.044
128.856
144.772
159.778
168.770
170.404
NO
CH3
N
O
O
CH3
CH3
H
9
10
11
12
8
13 2
7 20
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Cromatografia

  • 1. CROMATOGRAFIA La cromatografía agrupa un importante y diverso conjunto de métodos, que permiten separar componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas. En todas las separaciones cromatográficas, la muestra que se desea separar se disuelve en la denominada “fase móvil” que, normalmente, está formada por un gas o un líquido. Durante el proceso cromatográfico, se hace pasar la fase móvil a través de una “fase estacionaria”, inmiscible, la cual se mantiene fija en una columna o en una superficie sólida que actúa como soporte. Las dos fases –móvil y estacionaria- se eligen de tal forma que los componentes de la muestra se distribuyen en forma distinta entre ambas. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria, se mueven lentamente con el flujo debido a la fase móvil. En cambio, aquellos componentes de la muestra que tienen una reducida afinidad por la fase estacionaria, se desplazan con una mayor rapidez al ser arrastrados por la fase móvil. Como consecuencia de estas diferencias en la movilidad, las distintas sustancias que componen la muestra sometida a la cromatografía se separan en una serie de bandas que, en última instancia, pueden ser analizadas tanto cualitativa como cuantitativamente. Las técnicas cromatográficas aplicadas fueron cromatografía plana y cromatografía en columna. Cromatografía plana Los métodos de cromatografía plana incluyen la cromatografía en capa fina (TLC) y la cromatografía en papel (PC). En todos los casos se emplea una capa plana y relativamente delgada de un material que a su vez es el soporte, o bien que recubre una superficie de vidrio, plástico o metálica. La fase móvil se mueve a través de la estacionaria por capilaridad, a veces ayudada por gravedad o por aplicación de un potencial eléctrico. En la actualidad, la cromatografía en plano se centra en la técnica de la capa fina, que es más rápida, tiene mejor resolución, y es más sensible que su alternativa en papel.
  • 2. Las separaciones en capa fina se realizan en placas de vidrio o plástico que se recubren con una capa delgada y adherente de partículas finamente dividas; esta es la capa estacionaria. Las partículas son semejantes a las descritas en cromatografía en columna de adsorción, de reparto en fase normal y en fase inversa, y las fases móviles también son similares las utilizadas en cromatografía de líquidos de alta eficacia en columna. Las placas de capa fina se obtienen de forma comercial. Los tamaños son varios 5X20, 10X20, y 20X20. Estas placas comerciales se presentan en dos formatos. El convencional, donde las placas tienen un espesor de 200 a 250 μm un tamaño de partícula de 20 μm o más. Presentan por lo común unos 2000 platos teóricos en 12 cm. y con un tiempo de desarrollo de 25 min. El segundo tipo de placas comerciales es el de alta eficacia, que tienen películas de unos 100 μm de espesor, y un diámetro de partícula de 5 μm o menos. El número de platos teóricos es mayor unos 4000 en 3cm y con 10 min. de desarrollo. Las placas de alta eficacia permiten mejores separaciones y en menos tiempo, pero tienen la desventaja de tener una menor capacidad de carga. La aplicación de la muestra es el aspecto mas critico de la cromatografía en capa fina. Por lo general, se aplica una disolución de la muestra del 0,001 al 0,1 %, como una mancha, a 1 o 2 cm. del extremo de la placa. Pero para una separación de mayor eficacia, la mancha debería tener un diámetro mínimo aproximadamente 5nm para una aplicación cualitativa y menor para el análisis cuantitativo, y en el caso de las disoluciones diluidas se realiza tres o cuatro aplicaciones superpuestas secando la zona entre aplicación. La aplicación puede ser manual o por aplicadores mecánicos. Si es manual es por contacto entre la placa y un capilar que contiene la muestra, o utilizando una jeringa hipodérmica. En el caso de que sea mecánico, se mejorara la precisión y exactitud de la aplicación. El desarrollo de la placa es un proceso análogo a la elución en la cromatografía de líquidos, en el que la muestra es transportada por la fase móvil a través de la fase estacionaria. La forma más común de desarrollar la placa consiste en depositar una gota de la muestra cerca de unos de los extremos de la placa, y marcar su posición con un lápiz. Tras la evaporación del disolvente en el que estaba disuelta la muestra, se coloca la placa en un recipiente cerrado y saturado con los vapores del disolvente con el que se efectuara el desarrollo. Uno de los extremos de la placa se introduce en el eluyente procurando evitar el contacto directo de este con la muestra.
  • 3. El eluyente asciende por la placa gracias el efecto de capilaridad ejercido entre las finas partículas. A medida que el eluyente se desplaza pasa por el punto de aplicación de la muestra, la disuelve y la arrastra por la placa distribuyéndose entre el disolvente que se desplaza y la fase estacionaria. Después que el disolvente ha pasado a través de la mitad o las dos terceras partes de la longitud de la placa, se retira esta del recipiente y se seca. Las posiciones de la muestra se pueden determinar por distintos procedimientos. Dos de ellos se usan con la mayoría de las mezclas de sustancias orgánicas. Consisten en nebulizar sobre la placa una disolución de yodo o de ácido sulfúrico, ya que ambos reaccionan con los compuestos orgánicos para dar productos oscuros. También se utilizan reactivos específicos (como dragendorff específico para alcaloides) para localizar las especies separadas. Otro método de detección se basa en incorporar un material fluorescente a la fase estacionaria. Una vez ha finalizado el desarrollo, se examina la placa bajo luz ultravioleta. Los componentes de la muestra amortiguan la fluorescencia del material de tal forma que, toda la placa exhibe fluorescencia menos los lugares donde están los componentes de la muestra, no fluorescentes. Cromatografía en columna Es preciso conocer el concepto de elución en columna. La figura muestra como dos sustancias A y B se separan en una columna por cromatografía de elusión con una fase móvil. La elución implica el transporte de una especie a través de una columna por la adición continuada de nueva fase móvil. El proceso empieza cuando una única porción de la muestra se introduce en la parte superior de la columna (tiempo t0) después de lo cual los componente de la muestra se distribuyen entre las dos fases, La introducción de fase móvil adicional, el eluyente, hace que la fase móvil que contiene una parte de la muestra avance por la columna, donde tienen lugar una posterior reparto entre la fase móvil y las porciones frescas de la fase estacionaria a las que accede (tiempo t1). Al mismo tiempo, tiene lugar una distribución entre el disolvente nuevo y la fase estacionaria en el lugar en el que inicialmente se ubicaba la muestra. Las sucesivas adiciones de la fase móvil hacen avanzar las moléculas de soluto (analitos) por la columna en una serie de continuas transferencias entre las fases estacionaria y móvil. Sin embargo, debido a que el movimiento de los solutos solo puede ocurrir en la fase móvil, la velocidad media a la que una zona de soluto migra en la columna depende de la fracción de tiempo que
  • 4. reside en esta fase. Esta fracción de tiempo es pequeña para las sustancias que son retenidas fuertemente por la fase estacionaria (compuesto B) y es grande cuando es más probable la retención en la fase móvil (componente A). Las diferencias de velocidad que resultan hacen que se separen los componentes de la mezcla en bandas o zonas, que se localizan a lo largo de la columna (tiempo t2). El aislamiento de las especies separadas se realiza haciendo pasar suficiente cantidad de fase móvil a través de la columna hasta que las bandas individuales salen de ella, pudiendo así detectarse o reconocerse (tiempos t3 y t4). TECNICAS CROMATOGRAFICAS PARA LA SEPARACION DE COMPUESTOS A. CROMATOGRAFIADE ADSORCION Consiste en pasar la muestra sobre un adsorbente sólido (fase estacionaria) y un eluyente líquido (fase móvil) para el caso de cromatografía líquida; o un adsorbente sólido y un eluyente gaseoso para el caso de cromatografía de gases. ADSORBENTES Deben tener alta capacidad de adsorción, ser insolubles en el eluyente, e inertes a las sustancias a ser separadas porcromatografía La estructura porosay la granulación dependerán si se usa columna gravitacional o HPLC. Los adsorbentes más usados son:  Alúmina (óxido de aluminio) se utiliza para compuestos poco polares, tiene mayor poder de adsorción, permite a veces separar isómeros, la proporción que se utiliza es (1:20), es muy utilizada para la separación de alcaloides.  Silica gel (óxido de silicio) se utiliza para separar la mayoría de compuestos; se emplea generalmente en proporción (1:40) .Peso de la muestra a peso de sílice  Silicato de magnesio (Florisil) tiene una Adsorbancia intermedia, se utiliza para separar lípidos, glicósidos, azúcares.  Poliamida, se utiliza para separar compuestos que pueden formar puentes de hidrógeno tales como aminoácidos, polihidroxicompuestos (compuestos con muchos grupos OH)
  • 5. B. CROMATOGRAFIADE PARTICION La fase estacionaria y la fase móvil son líquidos inmiscibles. En general se emplea un sistema de dos fases, una rica en solvente orgánico con que se eluye el cromatograma y la otra rica en agua que constituye la fase estacionaria anclada al soporte. El conjunto fase móvil- fase estacionaria puede estar integrado por más de dos componentes. Un ejemplo típico: butanol-ácido acético-agua (4:1:5) para separar alcaloides. Los prototipos de cromatografía de partición lo constituye la: cromatografía de papel y la cromatografía gas-líquido que son empleados como métodos analíticos. CROMATOGRAFÍA DE PAPEL En la cromatografía de papel la muestra a separar es adsorbida sobre el punto de aplicaciones del soporte: papel, el cual retiene el agua (fase estacionaria), pero se puede saturar con otra fase estacionaria, por ejemplo dejándole equilibrar con esta en una cámara cerrada, cámara cromatográfica, antes de permitir el flujo del eluyente (fase móvil). Cuando la muestra se disuelve mejor en solventes no polares el papel se impregna con este solvente y el cromatograma se desarrolla en la fase acuosa. Esta técnica se conoce como cromatografía en fase reverse. En este caso los primeros a fluir soncompuestos más polares. Esto se puede aplicar a cualquier técnica cromatografica de papel. CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA (CCF) Es una variante de la CC o en papel. La fase fija o estacionaria esta formada por una capa delgada uniforme de adsorbente (cromatografía de adsorción) y que sirve como soporte de la fase móvil (cromatografía de partición), tiene la ventaja y la rapidez del desarrollo, y la versatilidad de las operaciones que se pueden hacer sobre el sustrato: se abrevia TLC. La CCF se puede preparar en los laboratorios ó comprarse en las casas comerciales llamados cromatofolios de 20cmx 20 cm, que se cortan de acuerdo a las necesidades, en este caso el
  • 6. soporte puede ser de aluminio, plástico y el adsorbente de 1mm de espesor muy uniforme. Una de las variantes de la cromatografía de capa fina es la cromatografía preparativa donde el soporte es de vidrio de 1 mm. de espesor. Para la preparación de las placas, se utiliza el método de inmersión en una suspensión del adsorbente en agua ó en CHCl3/ MeOH, 4es recomendable utilizar un esparciador para asegurar una capa uniforme del espesor deseado que va desde 0,25 hasta 1 mm. Las placas se colocan sobre una bandeja fija, después de lavadas y secadas, se esparcen con una suspensión del adsorbente en agua destilada. Las placas comerciales tienen aditivos (generalmente yeso) para aumentar la fuerza de adición al vidrio, indicadores de UV fluoresina de sodio que fluorese cuando se expone a la luz de 254nm y el ácido sulfónico de hidroxipireno que fluirse a 366nm. Hay una gran variedad de adsorbentes: Silicagel, alumina (neutra, básica, ácida), celulosa, celita, poliamida. El adsorbente más común es la silicagel con granulaciones de 20 a 1000 ªA , para compuestos no polares. CROMATOGRAFIA DE COLUMNA (CC) Es la más usada en la separación de productos naturales con tal finalidad se emplean adsorbentes ya mencionados en la cromatografía de capa fina: gel de sílice, alúmina celulosa, florosil, poliamida, sephadex, celulosa, intercambiadores de iones, y resinas de intercambio iónico. Actualmente se utilizan otros adsorbentes que permiten trabajar en fase inversa para la separación de compuestos polares. CROMATOGRAFIA PREPARATIVA (CP) Se utiliza cuando se tienen mezcla de sustancias que son difíciles de separar por (CC). El soporte o absorbente va adherido a una lámina de vidrio, el espesor del soporte es más ó menos de 1mm de espesor (30 g) de absorbente para una placa de 20x20 cm. La muestra se siembra a 1,5 cm de uno de los extremos de la placa y en toda la placa, previamente se elige el absorbente adecuado, es decir donde se observa mayor separación de los compuestos se introduce en cámaras o celdas cromatográficas y se procede a su elusión, en algunos casos dependiendo de la separación de los compuestos se pueden fluir varias veces, hasta lograr una buena separación. Se retira los compuestos de la placa y se extrae con solvente apropiado del adsorbente.
  • 7. CROMATOGRAFIA GASEOSA (CG.) Posee como fase móvil un gas inerte que generalmente es nitrógeno, la fase estacionaria puede ser un líquido (cromatografía gas-líquido) ó un sólido (cromatografía gas- sólido) Así mismo puede usarse combinando con técnicas espectroscópicas como espectrometría de masa (CG-EM) en tal caso se necesita para adoptar las condiciones del cromatógrafo gaseoso a los de vacío del espectrómetro de masa, y eliminar el gas portador que en (CG-EM) es el Helio. Esta técnica es analítica y es necesario contar con los patrones para poder comparar las sustancias que se están analizando. CROMATOGRAFIA DE ALTA RESOLUCION O PERFOMENCE (HPLC) CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO Un intercambiador de iones es un material insoluble en H2O que tiene grupos funcionales capaces de intercambiar iones de carga similar de la solución circundante. Hay materiales sintéticos y naturales orgánicos o inorgánicos, entre estos se encuentran las zeolitas, óxidos, fosfatos de metales del grupo IV. Entre los orgánicos naturales tenemos algodón, papel, que son sulfonados o fosfatados. Las resinas generalmente tienen una matriz de derivados de poli estireno, celulosa, agarosa, y se les puede clasificar de acuerdo a los grupos iónicos. Las resinas generalmente tienen una matriz de derivados de poli estireno, celulosa, agarosa, y se les puede clasificar de acuerdo a los grupos iónicos.
  • 8. 1. Resinas aniónicas ( intercambian cationes) a) R-SO3 - fuertemente ácida Dowex 50 b) R-OPO3 = fuertemente ácida Doulite C-63 c) R-CH2-CO2 - fuertemente ácida Amberlite CG-50 2. Resinas cationicas ( Intercambian aniones) a) R-CH2NMe3 + fuertemente básica Dowex 1-A6 b) R-NHMe2 + fuertemente básica Doulite A-30 c) R-C2H4NH3 fuertemente básica Amberlite 45 Las resinas se empacan en columnas generalmente, para lo cual es necesario acondicionarles primero, pues comercialmente se vende secas, se deben dejar en reposo con agua (el intercambio iónico tiene lugar en el H2O por lo tanto se realiza en medio acuoso. Esto provoca un aumento de las resinas. El sobrenadante se decanta y el proceso se repite varias veces. Las resinas hinchadas se ponen en contacto con la solución del contra ión que será desplazado de la muestra, se lava hasta la neutralidad para asegurar que toda la resina ha intercambiado el contraión y se equilibra con la mezcla de solvente donde se disuelve la muestra. Posteriormente se lava la columna con la mezcla del solvente hasta asegurar que no salgan iones de la columna y se eluyan los compuestos de la muestra introducida con una base o un ácido según sea el caso. El orden de elusión dependerá de la naturaleza iónica, los más débiles serán desplazados primero. Los más fuertes son adsorbidos aumentando la concentración de los iones en el eluyente. PREPARACION DE COLUMNAS CROMATOGRAFICAS COLUMNA SECA.- Se elige la columna cromatografica, dependiendo de la cantidad de muestra a cromatografiar, luego se llena la columna con una lluvia uniforme del adsorbente previamente seleccionado, tiene el inconveniente que el inchamiento del absorbente con el eluyente puede causar obstrucciones y disminuir la velocidad de flujo de solvente, generalmente la altura del relleno es de 12 cm, pero también depende del diámetro de la columna y la muestra a cromatografiar. La muestra se coloca pre-adsorbida en una pequeña cantidad de solvente. Es necesario tener en cuenta que la muestra no puede permanecer mucho tiempo en la columna en contacto con el adsorbente y el solvente, ya que se puede descomponer, o la difusión de las bandas donde concentran los compuestos inicialmente, con la pérdida consecuente de la resolución.
  • 9. Este sistema puede modificarse, cuando se empaqueta el adsorbente muy apretado y el flujo del eluyente es forzado a pasar por la columna con la ayuda de presión en el eluyente y vacío a la salida de la columna. COLUMNA HUMEDA.- Tiene 02 variantes: a).-se coloca el solvente previamente seleccionado y luego se deja caer lentamente el adsorbente, se golpea para ayudar la compactación sea uniforme. B).- La segunda se prepara una suspensión uniforme del adsorbente de la fase móvil y se deja caer sobre una capa de la fase móvil contenida en el tubo de vidrio. Esta tiene la ventaja de una composición más uniforme y el inchamiento del adsorbente ocurre antes de poner en la columna y evita las obstrucciones. La muestra se introduce en solución concentrada, preferentemente disuelta en el mismo solvente sobre la superficie del adsorbente, también la muestra se puede colocar pre-adsorbida con el mismo solvente que se compactó la columna. La elusión se comienza con el solvente menos polar y su polaridad se incrementa dependiendo de los resultados de la separación. ELUCIDACION (DETERMINACIÓN DE LA ESTUCTURA QUIMICA) DE COMPUESTOS ORGANICOS La elucidación ó determinación de la estructura química de compuestos orgánicos, puede constituir una meta en sí o ser una etapa clave para trabajos posteriores. Los métodos espectroscópicos especialmente RMN; IR, UV- espectrométricos de masa de alta y baja resolución, son de uso cotidiano para este tipo de trabajo. ESPECTROSCOPIA DE IR: Las que se observan en los espectros de IR van de 4000 a 200cm-1 y están relacionados con los cambios y estados vibracionales y rotacionales que presentan las moléculas. La posición e intensidad de las bandas corresponden a un grupo funcional que se encuentran distribuidas en varias zonas más ó menos constantes del espectro. El análisis del espectro ofrece información sobre grupos funcionales presentes en la molécula tales como la presencia de: Grupos OH, NH, CO, CHO COOOH, así como el carácter alifático y aromático del compuesto. La región comprendida entre 1300 y 900 cm-1, representan las huellas dactilares de las moléculas, pues las bandas de esa región corresponden a las vibraciones y rotaciones del esqueleto carbonado y por lo tanto son muy sensibles a los diferentes arreglos moleculares, aún para sustancias muy similares, por eso se debe considerar cuidadosamente esta zona al establecer la identidad de dos muestras por comparación de sus IR
  • 10. ULTRA VIOLETA (UV/VIS).-Se correlaciona con las transiciones electrónicas, es decir la transición de un electrón desde un estado fundamental a un estado excitado. La absorción de la energía requerida para esta transición se registra en la región UV (190nm-380nm) y en la región visible (380nm-70nm).- las señales del UV son muy anchos a diferencia de las señales del RMN e IR debido a los múltiples cambios de estados vibracionales y rotacionales que acompañan a las transiciones electrónicas. Para que se observe una absorción máxima debe existir en la molécula un cromóforo generalmente conjugado, por un sistema de instauraciones múltiples, tal como dienos, enona, aromático etc. ESPECTROMETRIADE MASAS (EM). Un compuesto orgánico que se expone a una corriente de electrones de alta energía (frecuencia de 70 ev) se degrada en fragmentos de las cuales las especies con cargas positivas se registra en el espectro de masa; según la unidad de masa por el número de cargos positivas (m/e donde e=1). Un aparato de EM de alta resolución registra la unidad de masa del ión molecular (la masa que pierde un solo ión sin degradarse), con hasta 04 ó mas cifras decimales el cual permite establecer la formula molecular correspondiente. La fragmentación es una característica de los diferentes compuestos y esto es aprovechado para la ubicación de ciertos grupos funcionales en entornos particulares de la molécula. Fig. . Espectro de masa de 11-metoxytubotiwina RESONANCIA MAGNETICA NUCLEAR (RMN).- método basado en la absorción de la energía, por el cambio del espin molecular de átomos sometidos a un campo magnético externo. El análisis del espectro de RMN ofrece evidencias específicas sobre las características de los núcleos que forman una dada molécula, y los más frecuentes analizados son 1 H, 13 C, 15 N, 19 F y 31 P. Siendo los dos primeros utilizados en análisis de rutina. Los desplazamientos químicos de las señales de RMN de 1 H (0-20ppm) y de 13 C (0-220ppm) dan información a cerca de la naturaleza de hidrógenos (alifáticos, aromáticos, olefínicos, geminales y heteroatomos) y de 13 C. Por la integración de las señales y la magnitud de la contaste de acoplamiento, multiplicidad de la señal que se observa en el espectro de 1 H se deduce el # de hidrógenos y el modo de distribución en la molécula.
  • 11. Mientras que el número de señales presentes en el espectro de carbón, indica el número de carbón presentes en la estructura, la multiplicidad muestra el # de átomos de Hidrógeno unidos al C responsable de la señal. Las técnicas de dos y tres dimensiones ofrecen información mucho más directa y presentan ventajas enormes cuando se trata de esqueletos nuevos. Fig. . Espectro de 1 H de 11-metoxytubotiwina Fig. . Espectro de 1 C de 11-metoxytubotiwina 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm 0.680 0.696 0.710 0.795 0.810 0.824 0.828 0.843 0.858 1.243 1.792 1.805 1.810 1.818 1.830 1.843 1.850 2.007 2.029 2.507 2.518 2.820 2.846 2.859 2.867 2.881 3.053 3.072 3.099 3.114 3.754 3.763 3.775 3.863 6.387 6.401 7.005 7.022 7.250 8.795 NO CH3 N O O CH3 CH3 H 9 10 11 12 8 13 2 7 20 19 21 6 5 15 14 16 3 22 23 18 24 168 160 152 144 136 128 120 112 104 96 88 80 72 64 56 48 40 32 24 16 8 ppm 11.503 23.703 28.102 30.532 40.898 43.556 45.170 51.143 53.553 54.183 55.455 65.278 76.674 76.996 77.310 95.952 97.338 105.574 120.044 128.856 144.772 159.778 168.770 170.404 NO CH3 N O O CH3 CH3 H 9 10 11 12 8 13 2 7 20 19 21 6 5 15 14 16 3 22 23 18 24