eficacia del cloro en la eliminación de bacterias

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Activadid Bactericida del KMnO 4 en Agua Superficial para el Riego de Campos
Agrícolas
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2. A G U A L A T I N O A M É R I C A
volumen 8, número 1
NIVEL III AIDIS
Resumen
El agua de uso agrícola puede constituir un factor importante de
contaminación de frutas y hortalizas, cuando es utilizada para la
irrigación, lo que hace necesario el control de su calidad microbiológica.
En México, el 42% del agua de uso agrícola es de fuentes superficiales.
Los compuestos elaborados a base de cloro son la alternativa química
más empleada para desinfectar el agua superficial, sin embargo ciertas
desventajas del cloro motivan la búsqueda de nuevas alternativas de
desinfección. La estabilidad en agua turbia y su capacidad oxidante
hacen del permanganato de potasio una alternativa de desinfección.
Actualmente el KMnO4
se emplea en la desinfección del agua superficial
sin sustento científico por lo tanto, el objetivo de la presente
investigación fue evaluar la actividad bactericida del KMnO4
contra
Escherichia coli y Bacillus subtilis, usando dos concentraciones de
desinfectante, tres tiempos de contacto y agua
turbia. Se utilizó la técnica de extensión en placa
y los datos fueron estadísticamente analizados
mediante análisis de varianza. Los resultados
demostraron la efectividad del KMnO4
contra
ambas bacterias. Se obtuvieron porcentajes de
reducción de 99.9999% y 99.99% para E. coli
y B. subtillis, respectivamente. Por lo tanto, el
KMnO4
puede considerarse como una
alternativa para la desinfección del agua
superficial. Palabras clave: Desinfección,
Escherichia coli, Bacillus subtilis, KMnO4
.
Introducción
La calidad microbiológica del agua
utilizada para irrigar cultivos agrícolas es de
vital importancia, ya que esto contribuye a
reducir la presencia de microorganismos
patógenos en frutas y hortalizas (FDA, 2001).
La principal fuente de contaminación son las
aguas residuales tratadas y no tratadas vertidas
en aguas de ríos y canales usadas para riego
de cultivos agrícolas (Thurston-Enriquez et al.,
2002; FAO, 2003, Craun y Castro, 1996) y con
menor frecuencia en el lavado y desinfección
de productos frescos.
El riesgo de infección aumenta cuando
patógenos, como Salmonella, Shigella, virus
de hepatitis A y Norovirus, están presentes en productos frescos
(Cifuentes et al., 2000). E. coli O157:H7 ha sido aislada de productos
frescos como manzana, melón, hojas de lechuga y espinacas (Solomon
et al., 2002; FDA, 2006), su presencia se ha asociado al uso de suelo
y agua de riego contaminada. Se estima que cada año se presenta en
EUA, 76 millones de enfermos y 5,000 muertes, asociados al consumo
de alimentos (DeWaal et al., 2000). Recientemente y debido a la
consistencia de brotes, existe la percepción que los microorganismos
presentes en frutas y hortalizas frescas son la principal causa de
enfermedades (Beuchat, 1996).
En los últimos años, se ha intensificado la búsqueda de
alternativas que permitan reducir o eliminar patógenos sobre la
superficie de productos frescos. Estudios previos han demostrado
que los métodos de desinfección solo reducen de manera parcial las
poblaciones microbianas presentes en las
superficie de los productos (Beuchat, 2001).
No existe un método estándar que
permita evaluar la efectividad de un
desinfectante sobre productos frescos
(Beuchat, 1998). Por el contrario existen
recomendaciones como las descrita por la
Agencia de Protección Ambiental de Estados
Unidos (USEPA, siglas en inglés) la cual
menciona una reducción de al menos 2 Log10
de la población bacteriana presente en la
superficie de los mismos (USEPA, 1997)
Bitton (1994) y Gelderich (1996) establecen
que un agente puede considerarse como un
desinfectante efectivo si logra reducir un
99.9999% (6 log10
). Mientras tanto el
“Método Oficial 960.09 de la AOAC, Acción
de Sanitización Germicida y Detergente de
Desinfectantes” sugiere que la evaluación de
sanitizantes para superficies pre-limpiadas,
no porosas que estén en contacto con
alimentos, debe reducir un 99.999% de
bacterias (5 Log10
) (Sapers, 2003).
La eficacia de la desinfección depende
del tipo de microorganismo, la temperatura,
nivel de pH del agua y tiempo de contacto,
así como la estructura de la superficie de
productos frescos (FDA, 1998).
Activadid Bactericida del KMnO4
en Agua Superficial para el Riego
de Campos Agrícolas
Por Cristobal Chaidez Quiroz*, Marcela Soto Beltrán, Celida Martínez Rodríguez, Andrés Medrano Félix
Tabla 1.
Características del suelo en estudio
Parámetro Resultado
pH (25ºC) 7.38
Conductividad eléctrica (ds/m) 0.39
Materia orgánica 2
2.07
Nitrógeno N-NO3
1
4.0
Fósforo P-PO4
1
38.5
Sodio 1
117.038
Potasio 1
403.534
Calcio 1
5194
Magnesio 1
1936.29
Fierro 1
49.03
Manganeso 1
177.66
Cinc 1
3.39
Cobre 1
2.27
ClC (meq/100g) 43.65
Textura Arcillosa
Arcilla 2
46.48
Limo 2
27.28
Arena 2
26.24
Tamaño de partícula 425µm
1
ppm; 2
%

3. volumen 8, número 1
A G U A L A T I N O A M É R I C A
El cloro es el desinfectante más utilizado en empaques agrícolas.
Su capacidad oxidante elimina rápidamente a los microorganismos,
sin embargo la materia orgánica limita su actividad oxidante, lo cual ha
motivado la búsqueda de alternativas de desinfección en aguas turbias
(Chaidez et al., 2007).
El KMnO4
, obtenido a partir del dióxido de manganeso (MnO2
) es
utilizado para control de olor y color, mejora el sabor e inactiva a
coliformes, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, poliovirus y bacteriófagos
en el tratamiento de agua para consumo (EPA, 1999). El KMnO4
oxida
y/o destruye enzimas celulares, siendo el ión MnO4
el responsable de
esta acción (EPA, 1999). El KMnO4
también forma dióxido de
manganeso, el cual tiene una capa externa de grupos oxidrilos capaces
de fijar, por absorción, partículas neutras o cargadas, incluyendo
microorganismos que son fijados al precipitado coloidal para ser
inactivados (EPA, 1999).
Actualmente el permanganato de potasio se emplea en actividades
agrícolas para la desinfección del agua superficial, sin embargo, la
información científica que demuestre su eficacia como agente
desinfectante y lo respalde para su uso, resulta insuficiente. Por lo tanto,
el objetivo del presente trabajo fue evaluar la actividad bactericida in
vitro del permanganato de potasio en agua superficial de uso agrícola,
utilizando como microorganismos indicadores Escherichia coli y Bacillus
subtilis.
Materiales y Métodos
Purificación de la bacteria
Se seleccionaron E. coli (ATCC 15597) y B. subtilis, como
microorganismos indicadores debido a la incidencia de las mismas en
agua de uso agrícola (Cazarez Diarte et al., 2004). E. coli y B. subtilis,
fueron obtenidos del laboratorio de Microbiología Ambiental y de
Alimentos y del laboratorio de Fitopatología, ambos del Centro de
Investigación en Alimentación y Desarrollo, Unidad Culiacán
respectivamente.
Cada bacteria fue purificada
empleando la metodología descrita por
Ukuku y Sapers (2001).Una colonia por
separado, de cada bacteria, fue
inoculada en 5mL de caldo de soya y
tripticaseina (TSB, Difco; Detroit, MI),
e incubadas por 24h a 37°C.
Posteriormente se adicionó 1mL del
crecimiento bacteriano en 25mL de
caldo TSB, y se incubó por 24h a 37ºC.
La suspensión bacteriana fue
centrifugada a 13, 080 X g (Beckman,
J2-MI, USA) durante 10min a 4ºC. El
sedimento obtenido se lavó y
resuspendió en 25mL de solución buffer
estéril (PBS, 0.1M, pH de 7.2) y se
centrifugó nuevamente a las mismas
condiciones. El procedimiento de
lavado, se repitió dos veces. La bacteria
purificada se mantuvo a 4ºC antes de
ser utilizada.
La concentración inicial de la
suspensión bacteriana fue determinada
utilizando la técnica de extensión en
placa (APHA, 1998), diluciones
decimales por triplicado (10-2
,10-4
y 10-
6
), y 0.1mL de cada dilución decimal fue colocada en cajas petri
conteniendo agar selectivo mFC (DifcoTM
, Maryland, USA) y agar papa
dextrosa (Bioxon, México) e incubadas a 37°C durante 24h para E. coli
y B. subtilis, respectivamente. Finalmente, la concentración bacteriana
se cuantificó en base a las unidades formadoras de colonia observadas
en el medio y el resultado fue expresado en Log10
UFC/mL.
La concentración inicial de las bacterias fueron 3.4x107
UFC/mL y
3.3x107
UFC/mL para Escherichia coli y Bacillus subtilis,
respectivamente.
Preparación del KMnO4
El desinfectante se adquirió de manera comercial (CAS 7722-64-
7). El KMnO4
tiene como ingrediente activo el ión permanganato (MnO4
).
Las concentraciones utilizadas durante el experimento fueron de 1.5 y
3 mg/L para Escherichia coli y 3 y 4.5 mg/L para Bacillus subtilis. Estas
concentraciones fueron determinadas de acuerdo a las empleadas
empírica-mente en actividades agrícolas para la desinfección del agua
superficial. Dato proporcionado por los técnicos de empaques agrícolas.
Preparación de turbidez en el agua
Se utilizó una concentración de 170UNT, simulando la materia
orgánica presente en agua superficial de uso agrícola, la cual fue ajustada
con tierra estéril obtenida de la localidad de Culiacán, Sinaloa (Tabla
1). Para ajustar dicha turbidez se adicionaron 0.85g de tierra estéril en
un litro de agua purificada estéril. La muestra se homogenizó y se colocó
en una celda para ser leída utilizando un espectro-fotómetro marca
HACH modelo DR 2010, de acuerdo a la APHA (1998). Los valores de
turbidez se expresaron en unidades nefelométricas (UNT).
Evaluación del KMnO4
Se utilizó un recipiente de cuatro litros de capacidad, el cual fue
llenado con un litro de agua purificada estéril; se adicionaron 0.85g de
tierra estéril para ajustar la turbidez a
170UNT. Una vez ajustada la turbidez
se inoculó el agua con concentraciones
de 3.4x107
y 3.3x107
UFC/mL de E. coli
y B. subtilis respectivamente, adiciona-
das en recipientes separados, y se
aplicaron las concentraciones del
desinfectante KMnO4
, 1.5 y 3mg/L para
E. coli y 3 y 4.5mg/L para B. subtilis,
todo esto con agitación constante.
Se procedió a tomar alícuotas
después de transcurrir 1, 3 y 6h de
tiempo de contacto, simulando el tiempo
en el que se lleva acabo la desinfección
en el agua superficial de uso agrícola,
dato proporcionado por técnicos del
laboratorio de Microbiología Ambiental
y de Alimentos del Centro de Investiga-
ción en Alimentación y Desarrollo. La
reducción bacteriana por efecto del
permanganato de potasio se determinó
utilizando la técnica de extensión en
placa (APHA, 1998). Se realizaron
diluciones decimales por triplicado (10-
2
,10-4
y 10-6
), y 0.1mL de cada dilución
decimal fue colocada en cajas petri
conteniendo agar selectivo mFC (Difco™
,
Tabla 2. Porcentaje de reducción de Escherichia coli
con permanganato de potasio
Permanganato Tiempo de Porcentaje de
de potasio 1
contacto 2
Turbidez 3
reducción %
1 98.83 b
1.5 3 99.90 b
6 99.99 c
1 99.9999 a
3 3 99.9999 a
6 99.9999 a
170
Tabla 3. Porcentaje de reducción de Bacillus subtilis
con permanganato de potasio
Permanganato Tiempo de Porcentaje de
de potasio 1
contacto 2
Turbidez 3
reducción %
1 98.98 a
3 3 99.90 a
6 99.99 a
1 99.94 b
4.5 3 99.87 b
6 99.94 b
Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos
1
ppm; partes por millón; 2
horas; 3
Unidades Nefelométricas de turbidez
170

4. A G U A L A T I N O A M É R I C A
volumen 8, número 1
Maryland, USA) y agar papa dextrosa (Bioxon, México) e incubadas a
37°C durante 24h para E. coli y B. subtilis, respectivamente. Finalmente,
la concentración bacteriana se cuantificó en base a las unidades
formadoras de colonia observadas en el medio y el resultado fue expresado
en porcentaje de reducción.
Determinación del perfil fisicoquímico del agua
La medición del potencial de hidrógeno (pH), se realizó utilizando
un potenciómetro portátil marca Oakton wppH y un electrodo HgTaylor
21433. La temperatura se verificó a 25ºC mediante un termómetro de
vidrio previamente calibrado.
Análisis de datos
El diseño estadístico empleado fue de bloques con dos factores
totalmente al azar. Los factores fueron las concentraciones y el tiempo
de contacto, y los microorganismos fueron bloqueados. Al realizar los
análisis de varianza y encontrar diferencias significativas, se aplicó la
prueba de comparación de medias de Tukey con un a=0.05. Los
resultados se expresaron en porcentajes de reducción. El paquete
estadístico empleado fue Stata versión 8 (2003).
Resultados y disusción
Escherichia coli
El análisis de varianza mostró que la concentración del
desinfectante fue significativo (P=0.036) en la reducción de Escherichia
coli, mientras que el tiempo de contacto no mostró diferencias
significativas. El mejor tratamiento se obtuvo al utilizar la concentración
de 3mg/L donde se logró un porcentaje de reducción de 99.9999 (6
log10
) para cada tiempo de contacto analizado (Tabla 2). Los resultados
concuerdan con los criterios de reducción bacteriana descritos por
Bitton (1994) y Geldreich (1996), quienes establecen que un agente
químico es efectivo si logra una reducción de 99.9999% (6 log10
).
El menor porcentaje de reducción obtenido fue de 98.83%, el cual
se obtuvo al utilizar 1.5mg/L y 1h de tiempo de contacto, con un nivel
de significancia de P=0.05, seguido de 1.5mg/L y 3h de tiempo de
contacto (99.90%) y 1.5mg/L y 6h de tiempo de contacto (99.99%).
Chaidez et al., (2003), observaron que los desinfectantes reducen su
efectividad cuando se utilizan a bajas concentraciones y en presencia
de materia orgánica. Wei et al., (1995) y Karch y Loftis (1998), han
demostrado que la presencia de turbidez en el agua permite que los
microorganismos puedan adherirse a partículas del suelo y protegerse
del desinfectante. La EPA (1999), menciona que la presencia de materia
orgánica reduce la efectividad del permanganato de potasio debido a
que este puede ser consumido al oxidar la materia orgánica e inorgánica
presente en el agua. Un estudio realizado en 1976 en el Distrito Sur de
Las Vegas Nevada del lago Mead mostró que al utilizar bajas dosis de
permanganato (1, 2, 3, 4 y 5mg/L) era necesario tiempos de contacto
prolongados (30min), para reducir la presencia de coliformes, mientras
que solo fue necesario 10min de tiempo de contacto cuando se
emplearon 6mg/L (EPA, 1999).
Al comparar la concentración y tiempo de contacto, el tratamiento
de 3mg/L a 1, 3, 6h logró una reducción de 99.9999% con un nivel de
significancia de P=0.05, demostrando que el porcentaje de reducción
bacteriana es dependiente de la concentración del desinfectante y no
necesariamente del tiempo de contacto. Se requieren altas
concentraciones de permanganato para lograr una reducción total de
la bacteria en estudio, como lo muestra la EPA (1999), donde fue
necesario dosis de 2.5mg/L para obtener una reducción total de
coliformes, así mismo fueron necesarias dosis de 20mg/L con tiempo
de contacto de 24h para reducir Vibrio cholerae, Salmonella typhi y
Shigella flexneri. Por lo tanto, el permanganato de potasio a
concentraciones de 3mg/L y 1, 3 y 6h de tiempo de contacto, puede ser
utilizado como bactericida en agua superficial de uso agrícola, ya que
puede alcanzar una reducción del 99.9999% (6 log10
).
Bacillus subtilis
Los resultados obtenidos en la evaluación de KMnO4
contra B.
subtilis no mostraron diferencias significativas con el factor tiempo;
sin embargo, el análisis de varianza mostró diferencias significativas
con el factor concentración P=0.05 (Tabla 3). La concentración de 3mg/
L de KMnO4
resultó ser la más efectiva, alcanzando un porcentaje de
reducción de 99.99% (4 log10
). Mientras que la concentración de 4.5mg/
L de KMnO4
logró reducir un 99.9% de bacteria, equivalente a 3
logaritmos de reducción. De acuerdo a la EPA (1999), la actividad
bactericida del permanganato de potasio se ve favorecida en condiciones
ácidas (pH 5.9) a 20ºC. Los resultados obtenidos muestran que la
efectividad del KMnO4
se vio reducida al utilizar concentraciones de
4.5mg/L, debido a que el agua inoculada con B. subtilis a esta misma
concentración y una temperatura de 25°C, alcanzó un pH que osciló
entre 5.97 y 6.11, condiciones menos ácidas a las observadas al utilizar
3mg/L de KMnO4
, donde el pH osciló entre 5.89 y 6.09 a la misma
temperatura (Tabla 4 y 5).
Cuando se comparó el porcentaje de reducción de E. coli y B.
subtilis, a la concentración de 3mg/L, se observó una reducción del
99.9999% de Escherichia coli y un 99.99% para B. subtilis, demostrando
que Bacillus presenta una mayor resistencia a los procesos de
desinfección.
Conclusiones
La concentración de 3mg/L de KMnO4
resultó ser efectiva para E.
coli y B. subtilis, lográndose un porcentaje de reducción de 99.9999%
y 99.99%, respectivamente. Concentraciones de 1.5mg/L no fueron
suficientes para reducir Escherichia coli, al no alcanzar más de 3
logaritmos de reducción bacteriana, sin embargo, de acuerdo a las
recomendaciones descrita por la Agencia de Protección Ambiental de
Estados Unidos, una reducción de al menos 2 Log10
de la población de
bacteriana, son suficientes para considerarse buen desinfectante. La
efectividad del desinfectante contra B. subtilis se vio limitada al utilizar
concentraciones de 4.5mg/L de KMnO4,
debido al pH final del agua
Tabla 4. Determinación del perfil fisicoquímico del agua
turbia inoculada con Escherichia coli
Potencial
de hidrogeno Concentración
25°C KMnO4
1
Blanco 2
T1
3
T2
4
T3
5
pH
1.5 6.02 6.02 6.24 6.24
3 6.02 6.13 6.05 6.23
Tabla 5. Determinación del perfil fisicoquímico del agua
turbia inoculada con Bacillus subtilis
Potencial
de hidrogeno Concentración
25°C KMnO4
1
Blanco 2
T1
3
T2
4
T3
5
pH
3 6.02 5.83 6.15 6.09
4.5 6.02 5.97 6.30 6.11
1
Concentración de KMnO4
expresado en partes por millón (ppm):
2
Blanco: Muestra de agua con 170 UNT inoculada con bacteria, sin
aplicación de KMnO4
; 3
T1
1 hora de tiempo de contacto; 4
T2
3 horas de
tiempo de contacto; 5
T3
6 horas de tiempo de contacto

5. volumen 8, número 1
A G U A L A T I N O A M É R I C A
empleada durante la inoculación. Por lo tanto, se concluye que el KMnO4
puede considerarse como una alternativa en los procesos de
desinfección del agua superficial de uso agrícola, siempre y cuando se
tomen en cuenta consideraciones como el pH de la solución, el cual
debe oscilar entre 5.9 o menor, para tener mayor concentración del ión
MnO4
, el cual oxida y destruye las enzimas celulares de los
microorganismos, así mismo son necesarias temperaturas de 25ºC para
que la efectividad del permanganato de potasio se vea favorecida.
Finalmente, es importante hacer hincapié en la necesidad de generar
información científica sobre la acción del permanganato de potasio
contra otros grupos microbianos (bacteriófagos, virus entéricos, quistes
de protozoarios y bacterias patógenas) que generalmente se encuentran
presentes en aguas superficiales. Esta información permitirá darle un
uso más amplio al permanganato de potasio como agente desinfectante.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Centro de Investigación en Alimentación
y Desarrollo, Unidad Culiacán, por las facilidades otorgadas en la
realización del presente trabajo de investigación.
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Growth and Survival of Salmonella Montevideo on Tomatoes and Disinfection
with Chlorinated Water. Journal of Food Protection 58, 829-836.
Correspondencia
Dr. Cristobal Chaidez Quiroz: Centro de investigación en Alimentación
y Desarrollo (CIAD), Unidad Culiacán. Carretera a Eldorado Km. 5.5,
C.P. 80129, Culiacán, Sinaloa. Tel/Fax: (667) 760-5536; chaqui@ciad.
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