1. t0 1 2 3
211299 Análisis Instrumental II –
Quimicos Analistas 2006
CROMATOGRAFIA INSTRUMENTAL
I: PRINCIPIOS Y PARAMETROS
Dr. Dietrich von Baer v. L.
Dra. Claudia Mardones P.
Universidad de Concepción
Facultad de Farmacia
Departamento de Análisis Instrumental
2. CROMATOGRAFIA
CHROMATOS = COLOR
GRAPHEIN = ESCRIBIR
Columna de
Carbonato
de Calcio
Mikhail Tswett: 1906: separó
pigmentos naturales coloreados sobre
tiza haciendo pasar éter de petróleo
sobre ella
D. von Baer/C. Mardones 2008
Pigmentos
naturales
3. CROMATOGRAFIA
CHROMATOS = COLOR
GRAPHEIN = ESCRIBIR
Columna de
Carbonato
de Calcio
Mikhail Tswett: 1906: separó
pigmentos naturales coloreados sobre
tiza haciendo pasar éter de petróleo
sobre ella
Eter de petróleo
Pigmentos
naturales
D. von Baer/C. Mardones 2008
4. CROMATOGRAFIA
CHROMATOS = COLOR
GRAPHEIN = ESCRIBIR
Columna de
Carbonato
de Calcio
Mikhail Tswett: 1906: separó
pigmentos naturales coloreados sobre
tiza haciendo pasar éter de petróleo
sobre ella
Martin y Synge (1952): Obtienen Premio Nóbel de
Química por la invención de la Cromatografía de Partición
en Papel: Clave para la separación de aminoácidos y
diversos otros compuestos de interés biológico en mezcla.
Eter de petróleo
Pigmentos
naturalesMartin y James (1952):
Inventan Cromatografía
de Gas (1er método
instrumental)
D. von Baer/C. Mardones 2008
5. CROMATOGRAFIA
CHROMATOS = COLOR
GRAPHEIN = ESCRIBIR
Columna de
Carbonato
de Calcio
Mikhail Tswett (1906): separó
pigmentos naturales coloreados sobre
tiza haciendo pasar éter de petróleo
sobre ella
HOY:
Conjunto de métodos de análisis químico instrumental que
permiten separar los componentes de una mezcla, los cuales
se distribuyen SELECTIVAMENTE entre:
FASE ESTACIONARIA
(en reposo)
FASE MOVIL
(se hace pasar a través de o en
torno a FASE ESTACIONARIA )
Martin y Synge (1952): Reciben Premio Nóbel de Química
por la invención de la Cromatografía de Partición en Papel:
Clave para la separación de aminoácidos y diversos otros
compuestos de interés biológico en mezcla.
Eter de petróleo
Pigmentos
naturalesMartin y James (1952):
Inventan Cromatografía
de Gas (1er método
instrumental)
D. von Baer/C. Mardones 2008
6. CLASIFICACION METODOS CROMATOGRAFICOS
Según ESTADO FISICO de las FASES:
Crom. LIQ-
LIQUIDO
Crom. GAS-
LIQUIDO
Crom. LIQ -
SOLIDO
Crom. GAS –
SOLIDO
FASE MOVIL:
Líquido Gas
FASE ESTA-
CIONARIA:
Líquido
Sólido
Cromatógrafo
de Líquidos
Cromatógrafo
de Gases
INSTRUMENTO
CROMATOGRAFO
DE LIQUIDOS
CROMATOGRAF
O
DE GASES
D. von Baer/C. Mardones 2008
7. CLASIFICACION METODOS CROMATOGRAFICOS
Según el OBJETIVO:
Identificar y cuantificar
componentes de una
mezcla
Compuesto %
A 12,5
B 25,0
C 50,0
D 12,5
• Analítica
• Preparativa
Aislar componentes
de una mezcla
D. von Baer/C. Mardones 2008
8. • PLANAR
Fase estacionaria
Fase móvil
p1 p2 p3 m1 m2
D. von Baer/C. Mardones 2003
Según la FORMA de hacerla:
En COLUMNA
COLUMNAS DE HPLC COLUMNA DE GC
9. Fase móvil
Fase estacionaria
p1 p2 p3 m1 m2
• PLANAR
COLUMNAS DE HPLC COLUMNA DE GC
Según la FORMA de hacerla:
En COLUMNA
D. von Baer/C. Mardones 2008
10. Según el PRINCIPIO QUE RIGE LA SEPARACION:
• PARTICION O REPARTO:
Solubilidad selectiva entre
dos fases. Lo SIMILAR ES
SOLUBLE EN LO SIMILAR
Fase Estacionaria: LIQUIDO
Fase Móvil: LIQUIDO o GAS
D. von Baer/C. Mardones 2003
• PARTICION O REPARTO
• ADSORCION
• INTERCAMBIO IONICO
• EXCLUSION
• Para retener la fase estacionaria líquida, en la mayoría
de los casos esta se une física- o química-mente a un
soporte sólido
• EN CROMATOGRAFIA LIQUIDO/LIQUIDO:
Para evitar que se mezclen las fases, se usan dos
líquidos no miscibles como fase estacionaria y
móvil, uno polar y uno apolar.
F. est. polar /F. móvil apolar: Fase Normal
F. est. apolar/ F. móvil polar: Fase Inversa
• Casos particulares Crom. Reparto: - Crom. en Papel
y Crom. Liquida en Fase Inversa
11. Según el PRINCIPIO QUE RIGE LA SEPARACION:
• PARTICION O REPARTO
• ADSORCION
• INTERCAMBIO IONICO
• EXCLUSION
• ADSORCION:
Fenómeno de SUPERFICIE
Los solutos se concentran
sobre la superficie de un sólido
Fase Estacionaria: SOLIDO
ADSORBENTE
• Centros activos en la superficie del sólido interac-
cionan con grupos polares de los solutos, los cuales
son desplazados por la fase móvil.
• Retención depende de área superficial, la cual
depende del tamaño de partícula y de la superficie
interna ido interaccionan con grupos polares de los
solutos, los cuales son desplazados por la fase móvil.
D. von Baer/C. Mardones 2008
12. • INTERCAMBIO IONICO:
Intercambio estequiométrico de IONES de Muestra y Fase
Móvil, que compiten unirse a Fase Estacionaria IONICA.
+
+
+
+
+
+ +
+
+
Según el PRINCIPIO QUE RIGE LA SEPARACION:
• PARTICION O REPARTO
• ADSORCION
• INTERCAMBIO IONICO
• EXCLUSION
Fase estacionaria: Matriz rígida en cuya superficie existen
grupos funcionales cargados positiva- o negativamente y
contraiones de carga opuesta, susceptibles de intercam-
biarse con iones de la misma carga contenidos en en la
Fase Móvil, la cual suele ser una solución tamponada,
SEPARACION se produce por competencia entre iones
analito y de la Fase Móvil por los grupos ionizados de la
Fase Estacionaria.
D. von Baer/C. Mardones 2008
13. • EXCLUSION:
Separación en función de tamaño molecular. Solutos
más pequeños penetran más en poros de Fase Estacio-
naria POROSA (tamiz molecular)
Según el PRINCIPIO QUE RIGE LA SEPARACION:
• PARTICION O REPARTO
• ADSORCION
• INTERCAMBIO IONICO
• EXCLUSION
Fase estacionaria: Matriz inerte que contiene pequeños
poros en los cuales pueden penetran más las moléculas
más pequeñas y menos las más grandes.
La retención depende del tamaño de las moléculas
solvatadas y del tamaño de los poros.
D. von Baer/C. Mardones 2008
23. Fase estacionaria
Fase móvil
PARAMETROS CROMATOGRAFICOS
I. Factor de Retención (Factor de Capacidad)
= tR – tM
tM
k
tR = tiempo de retención
tM = tiempo muerto (to )
Como tR’ = tR- tM
= tR’
tM
k
tiempo del soluto en Fase Estacionaria
tiempo del soluto no retardado
en Fase Móvil
Idealmente, k’ debe estar entre 2 y 10. En la práctica
1< k < 20 es satisfactorio.
D. von Baer/C. Mardones 2008
24. D. von Baer/C. Mardones 2003
Para modificar k:
En HPLC modificando la proporción de modificador
orgánico de la fase móvil
EN GC:
Variando T°
25. = tR2’
tR1’
α
para tR2’ > tR1’
= k2
k1
α
para k2 > k1
o bien
II. Factor de Separación (Factor de Selectividad)
El factor de separación α describe la migración de un
pico presente en la mezcla en relación al otro que
sufre menos retardo α > 1
α recomendable que 1.1 < α < 1.5
D. von Baer/C. Mardones 2008
26. = tR2’
tR1’
α
para tR2’ > tR1’
= k2
k1
α
para k2 > k1
Columna C-1
Columna C-8
o bien
α (2,1) = 1.6
α (2,1) = 2.1
II. Factor de Separación (Factor de Selectividad)
D. von Baer/C. Mardones 2008
27. = tR2’
tR1’
α
para tR2’ > tR1’
= k2
k1
α
para k2 > k1
¿ Es igual la calidad de la separación en casos A y B ?
o bien
II. Factor de Separación (Factor de Selectividad)
= tR2’ ( cte)
tR1’ (cte)
α
D. von Baer/C. Mardones 2008
28. Señal
t0 1 2 3 4
tR2
k y α = constantes, pero
calidad separación no es constante
tM
tR1
Si tM, tR1
, tR2
= constantes
III. Eficiencia
N = Número de Platos Teóricos
h
w
< ancho > eficiencia: deseable
h
w
> ancho < eficiencia: NO deseable
D. von Baer/C. Mardones 2008
29. Eficiencia N
N = Número de Platos Teóricos
Señal
t
0
1 2
3
tR2
h
16 tR
wb
N =
wb = ancho de pico
en la base
= 4 σ
[ ]2
D. von Baer/C. Mardones 2008
30. Eficiencia N
N = Número de Platos Teóricos
Señal
t
0
1 2
3
tR2
h
5,545 tR
wh
N = [ ]2 wh = ancho de pico
a mitad de altura
16 tR
wb
N =
wb = ancho de pico
en la base[ ]2
D. von Baer/C. Mardones 2008
31. N = 14
HETP = 2
HETP
N = 28
HETP = 1
HETP
HETP = 4
N = 7
HETP
> N,< HEPT =
Mayor eficiencia
< N, > HEPT
= Menor eficiencia
Altura Equivalente de
Plato Teórico (HETP)
Sección eficaz responsable
de un equilibrio de
intercambio
=
L
N
HETP
L = largo columna
N = número de platos teóricos
HETP
Fase móvilFase móvil
Fase
estacionaria
L
D. von Baer/C. Mardones 2008
32. A: Efecto de camino múltiple o de laberinto
HETP = A + B/ µ + C . µ
Ecuación de van Deemter
µ= velocidad lineal
media de la
fase móvil
M
M
M
M
M
M
• A depende de forma y tamaño de partículas en el lecho de
separación > Eficiencia con partículas pequeñas de tamaño uniforme
• A NO depende del flujo de fase móvil
A = 2 λ.
dp
λ = factor de empaque
dp = diámetro de partícula
D. von Baer/C. Mardones 2008
33. A:Efecto de camino múltiple
M
M
M M
M
M
HETP = A + B/ µ + C . µ
Ecuación de van Deemter
µ= velocidad lineal
media de la
fase móvil
• A depende de forma y tamaño de partículas en el lecho de
separación > Eficiencia con partículas pequeñas de tamaño uniforme
Forma partícula
Partículas irregulares
> A < eficiencia
Partículas esféricas
< A > eficiencia
Incidencia
Tamaño partícula
D. von Baer/C. Mardones 2008
34. B: Difusión longitudinal o axial
HETP = A + B/ µ + C . µ
Ecuación de van Deemter
µ= velocidad lineal
media de la
fase móvil
t1
D. von Baer/C. Mardones 2008
35. B: Difusión longitudinal o axial
B depende de:
• DM= Coeficiente difusión soluto en Fáse Móvil: mucho > en un
GAS que en un líquido + importante en GC que en HPLC
• ψ = Factor de obstrucción o tortuosidad (sólo en columnas
empacadas,
0 en columnas capilares)
HETP = A + B/ µ + C . µ
Ecuación de van Deemter
µ= velocidad lineal
media de la
fase móvil
t1 t2
B/µ depende del flujo a >µ < contribución de B/µ a la HETP
> Eficiencia
Difusión longitudinal aumenta a medida que analitos permanecen más
tiempo en la columna
D. von Baer/C. Mardones 2008
36. C: Resistencia a la transferencia de masaC: Resistencia a la transferencia de masa
HETP = A + B/ µ + C . µ
Ecuación de van Deemter
µ= velocidad lineal
media de la
fase móvil
Equilibrio
No
equilibrio
• Término C Ec. van Deemter se refiere a la transferencia de
masa del analito hacia y desde la Fase Estacionaria.
C * µ: aumenta directamente con el flujo
a >µ > C µ y < Eficiencia
Distribución del analito
en situación de:
D. von Baer/C. Mardones 2008
37. Efecto del flujo sobre el ensanchamiento del
peak cromatografico
HETP= A + B/µ + C*µ
HETP
C*µ
A
µ
B/
µ
Global
Flujo óptimo
Crom. de
Gas
Incidencia B mucho menor en Cromatografía Liquida que Gaseosa,
pues DM es < en un líquido que en gas, pero Transf. Masa en Fase
Móvil (Cm) adquiere > importancia.
HETP
µ
Crom.
Líquida
D. von Baer/C. Mardones 2008
38. PARA EVALUAR CALIDAD DE SEPARACION
EN SU CONJUNTO:
RESOLUCION:
Medida cuantitativa de las separación entre dos analitos
contiguos en el cromatograma, considerando los anchos
de los peaks en sus bases.
Señal
tR2
- tR1
D. von Baer/C. Mardones 2008
39. PARA EVALUAR CALIDAD DE SEPARACION
EN SU CONJUNTO:
2 tR2 – tR1
wb1+ wb2
Rs=
Wb1 y Wb2 = ancho en la
base de dos picos vecinos
Rs = Resolución
Señal
tR2
- tR1
RESOLUCION:
Medida cuantitativa de las separación entre dos analitos
contiguos en el cromatograma, considerando los anchos
de los peaks en sus bases.
D. von Baer/C. Mardones 2008
40. PARA EVALUAR CALIDAD DE SEPARACION
EN SU CONJUNTO:
2 tR2 – tR1
wb1+ wb2
Rs= Wb1 y Wb2 = ancho en la
base de dos picos vecinos
Ecuación Maestra de la Cromatografía
Rs = Resolución
Si Wb1 ≈ Wb2
Rs = ( )α - 1
α ( )k
k + 1 ( )√
4
N
Rs = 1,0 —> 97,9 % separación
= 1,25 —> 99,4 % separación
= 1,5 —> 99,7 % separación
> 2,0 —> separación
TOTAL
Si dos picos vecinos tienen tamaño similar
D. von Baer/C. Mardones 2008
41. Influencia de la eficiencia sobre la resolución
cromatográfica
N = 712
Rs=1.0
N= 1.600
Rs=1.5
N = 2.844
Rs=2.0
N = 11.344
Rs=4.0
1:1 1:4 1:16
Rs=1.25
Rs=1.0
Rs=0.8
Rs=0.6
1:1 2:11:1 4:1 8:1 16:1 32:1
Resolución vs. proporciones de área de 2 picos vecinos
98 %
99,7 %
Total
Total
D. von Baer/C. Mardones 2008
42. Influencia de α ( factor de
separación) sobre la resolución
cromatográfica
α = 1.25
Rs (3,4) = 2.0
α = 1.15
Rs (3,4) = 1.2
D. von Baer 2002
C8
C18
43. Factor de Asimetría (Tailing)
T = b0,1 / a0.1
(definición IUPAC)
T idealmente = 1, en la práctica T > 1
D. von Baer/C. Mardones 2008
44. Nunca la primera separación es la mejor
D. von Baer/C. Mardones 2008
45. Nunca la primera separación es la mejor
D. von Baer/C. Mardones 2008
46. Nunca la primera separación es la mejor
D. von Baer/C. Mardones 2008
47. Nunca la primera separación es la mejor
Separaciones DEBEN OPTIMIZARSE
D. von Baer/C. Mardones 2008
