instrumental HPLC

1. ANÁLISIS INSTRUMENTAL - LABORATORIO
SESIÓN 13: CROMATOGRAFÍA LIQUIDA

2. Al término de la sesión, el
estudiante comprende y aplica los
principios básicos de la
cromatografía liquida HPLC

3. Cromatografía de papel

4. Cromatografía de líquidos de alta eficiencia
HPLC
la cromatografía de líquidos convencional se
hacía en columnas grandes, con partículas
grandes y con alimentación por gravedad; las
fracciones de eluyentes se recolectaban
manualmente para su medición en un
espectrofotómetro
https://www.youtube.com/watch?v=qcuJpsWagE8

5. Cerca de los años de la década de 1970, con el
desarrollo de la tecnología para producir pequeñas
partículas de sílice silanizadas, que fue posible usar
las columnas de volumen pequeño y mayor longitud
que permitieron un funcionamiento con alta
resolución. Hoy en día, a este método se le llama
“cromatografía de líquidos de alta eficiencia”.
Cromatografía de líquidos de alta eficiencia
HPLC

6. Componentes básicos
de un cromatógrafo de
líquidos de alta
eficiencia.
Cromatografía de líquidos de alta eficiencia
HPLC

7. FASES ESTACIONARIAS
Las micropartículas en la HPLC original eran de gel
de sílice o de alúmina, irregulares, porosas, de 10 um
o menos.
Las partículas son de sílice de alta pureza, con bajo
contenido de trazas de metales, y su diámetro típico
es de 5 a 10 um; sin embargo, las partículas de 3u m
se están usando cada vez más en la cromatografía
de alta velocidad. Los tamaños de poro están en el
intervalo de 60 a 100 Å, aunque se usan tamaños de
poro de 300 Å o más con biomoléculas más grandes,
que les permiten penetrar los poros

8. Columna.
Los tramos rectos de tubo de acero inoxidable permiten la construcción de columnas excelentes.
Son de varios diámetros y longitudes, los cuales dependen de la aplicación. En general, el diámetro
interno tiene 3.9 o 4.6 mm. Una columna de 4.6 mm de diámetro, bien empacada con partículas de
5 um (dp) debe tener un número de platos del orden de 60 000 a 90 000 placas/metro, a flujos de 1
mL/min.

9. Detector. En la cromatografía de líquidos de alta
eficiencia se requieren detectores con gran
sensibilidad, en general para cantidades de
microgramos a nanogramos. Los detectores que más
se usan son refractómetros y detectores de
ultravioleta (UV)
Debido a sus ventajas, con el detector UV se hacen
cerca de 80% de las mediciones. Es claro que no se
puede usar con disolventes que tengan absorción
apreciable en el UV o con componentes de muestra
que no absorban en el UV.

10. La cromatografía de líquidos de alta
eficiencia se usa en el modo de
cromatografía de adsorción líquido-
sólido, o en el de cromatografía de
partición líquido-líquido.
. Los procesos de partición líquido-líquido son
bastante sensibles a pequeñas diferencias en el peso
molecular, por lo que se prefieren para separar
miembros de series homólogas

12. Como regla general, los materiales
muy polares se separan mejor con
cromatografía de partición, en tanto
que los que son mucho menos
polares se separan con cromatografía
de adsorción.
La polaridad de los compuestos tiene el orden
aproximado siguiente: hidrocarburos y derivados
hidrocarburos oxigenados donadores de protones
compuestos iónicos; esto es, RH < RX < RNO2 < ROR
(éteres) = RCO2R (ésteres) = RCOR (cetonas) < RCHO
(aldehídos) = RCONHR (amidas) < RNH2, R2NH, R3N
(aminas) <ROH (alcoholes) < H2O < ArOH (fenoles) <
RCO2H (ácidos) < nucleótidos NH3RCO2 <
(aminoácidos).

13. Algunos disolventes de uso común,
por polaridad creciente, son:
disolventes ligeros de petróleo
(hexano, heptano, éter de petróleo)
ciclohexano < tricloroetano < tolueno
< diclorometano < cloroformo < éter
etílico < acetato de etilo < acetona <
n-propanol < etanol < agua.

14. Selección del disolvente.
En la mayor parte de las aplicaciones, con un disolvente puro no se obtendrá la separación
eficiente de una serie de compuestos, y deberá usarse una formulación con dos o más
disolventes
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