Trucos y consejos en la resolución de problemas en hplc

1. Consejos para el mantenimiento de su equipo de HPLC
Resolución de Problemas en
HPLC:Troubleshooting
Técnicas, Consejos , y Trucos
Agilent Technologies
Page 1

2. Pasos en la Resolución de Problemas
Una vez que has detectado que hay un problema!
¿Cómo lo solucionas?
•1st ¿Falló el sistema o la calibración de la muestra?
Hacer Blancos
•2nd Revisar el cumplimiento del método
– ¿ Se ha seguido el procedimiento adecuadamente?
– ¿ Son correctos los parámetros en el instrumento?
•3rd Hágase más preguntas!
– ¿Cuándo funcionó correctamente el sistema por última vez?
– ¿ Se ha cambiado alguna cosa?
••4th Revise TODOS los parámetros!
– Lo obvio no es siempre la causa
– ¿
Hubo más de un cambio?
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3. Componentes del Sistema HPLC
Bomba
Inyector /Automuestreador
Columna
Detector
Sistema de datos/Integrador
Los problemas pueden estar relacionados con todos los
componentes del sistema
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4. Encuesta a usuarios en LC-GC sobre Problemas de Columnas
Column Problem Percentage of Respondents
Alta presión, fritas obstruidas 24%
Pobre reproducibilidad (formas de
16%
pico, retención)
Recuperación de muestra 14%
Perdida de resolución 13%
Inestabilidad 11%
Volumenes muertos 8.1%
Fugas, conexiones 4.8%
Rango de pH 2.0%
Bajo numero de platos 2.0%
Saturación de la columna 2.0%
Cost 1.7%
Miscellaneous 15%
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5. Tipos de problemas del Sistema y la Columna
A. Presión
B. Forma del Pico
C. Retención
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6. Problemas de Presión
Sintomas de la columna Posibles causas
Alta - Frita obstruida
- Contaminación de la
columna
- Obstrucción en el
empaquetamiento
Baja presión - Fuga
- Flujo incorrecto
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7. Corrección de la sobrepresión
Determinación de la causa y corrección de una presión alta
Muchos problemas de presión están relacionados con obstrucciones en el sistema.
Comprobar la presión del sistema con y sin columna.
Si la presión con columna es alta:
• Hacer un Back flush a la columna (con cuidado para el rendimiento futuro)
• Limpiar la frita bloquead (flujo reverso con un solvente fuerte)
• Lavar la columna
Eliminar la contaminación en la column y limpiar el empaquetado bloqueado
Retirar compuestos adsorbidos de alto peso molecular
Limpiar precipitados introducidos de la muestra o del tampón
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8. Obstrucción del empaquetado
Tamaño de
partícula
Area
(um2)
Diam intersticial
medio (um)
Porosidad de
la frita(um)
5.0 2.7 0.9 2.0
3.5 1.3 0.6 2.0
3.0 1.0 0.6 2.0
2.7 0.7 0.5 2.0
1.8 0.4 0.4 0.5
1.7 0.3 0.3 0.5
Cuidado con las fases móviles tamponadas
Los tampones contienen material insoluble– filtrar
La solubilidad del tampón decrece con el aumento del %
de orgánico* - evitar 100%B con tampones salinos
*Schellinger,A.P. and Carr,P.W., LC-GC North America, 22, 6, 544-548 (2004)
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9. Solubilidad del tampón
La Tabla I presenta una a ab a p ese ta u a estimación de la concentration
soluble del tampón menos soluble (fosfato potásico a pH 7.0)
en tres solventes orgánicos
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10. Solubilidad de 5 tampones en mezclas con
(a) metanol, (b) acetonitrilo, y (c) tetrahidrofurano
metanol
acetonitrilo THF
El trazo — representa acetato amónico a pH 5.0, •••• representa fosfato amónico
a pH 3.0, --- representa fosfato potásico a pH 3.0, ––••••–– representa fosfato
amónico a pH 7.0, y – – representa fosfato potásico a pH 7.0.
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11. Cambiar la frita puede no ser buena idea
Puede que no sea posible con columnas de nueva generación
Puede dañar columnas de alto rendimiento
Compression
Column
Inlet Frit
Ferrule
Wear gloves
Do not allow bed to dry
Column Body
y
Do not touch the column -
body heat will extrude packing
Do not overtighten
Female End Fitting
Male End Fitting
Consejo: Prevenir es mucho mejor!
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12. El Truco:
Tecnicas de Prevención- La mejor elección!
• Usar protección de la columna
- Filtros en linea
- Salva columnas
• Filtrar las muestras
Fácil
• Filtrar fases móviles tamponadas
• Extracción de la muestra(i.e. SPE)
No tan fácil
• Lavado apropiado de la columna
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13. Limpieza de la columna
Limpiar con solventes más fuertes que la fase
móvil
Opciones de Solventes de Fase Reversa
en orden de fuerza creciente
Use al menos 25mL de cada solvente para columnas analíticas
• Fase Móvil sin sales de tampón
• 100% Metanol
• 100% Acetonitrilo
• 75% Acetonitrilo:25% Isopropanol
Debe
para
Esto lleva tiempo,
amenudo se realiza
• 100% Isopropanol
• 100% Cloruro de Metileno*
• 100% Hexano*
revertirse Re-Equilibrar
Offline
Hexano
*Consejo: Cuando use Hexano o Cloruro de Metileno debe lavar la columna con
Isopropanol antes de volver a la fase móvil de fase reversa
Page 13
reversa.

14. Li i Limpieza d de l la l columna– f fase normal
l
20−Use al menos 50mL o 20 30 volumenes de columna para las columnas analíticas
• Opciones típicas de solventes en Fase Normal en orden de fuerza creciente:
Solvent Composition
Methanol:Chloroform 50:50%
Ethyl Acetate 100%
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15. ¿Cuáles son los problemas más comunes
de la forma de pico?
1. Picos dividos
2. Colas en los picos (simetría <1 )
3. Picos anchos (mala resolución. Rs<2)
• Muchos problemas de formas de pico son combinaciones- i.e.
ensanchamniento y colas o colas al incrementarse la retención.
••Los Síntomas no afectan necesariamente a todos los picos en el
cromátograma.
•C d Cada uno d de t estos bl problemas d pueden t tener últi l
múltiples causas.
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16. Picos dobles por perturbacion en el flujo
•Perturbación en el flujo por un volumen muerto
•La muestra fluye por diferentes vias a través de
la columna
•Pobre empaquetamiento de las partículas
•El pH alto disuelva la Silice
Normal Picos
Picos dobles o partidos
dobles
Consejo: Un efecto similar se produce con una frita
parcialmente Page 16
obstruida

17. Picos divididos por efectos del solvente
de inyección
Columna: StableBond SB-C8, 4.6 x 150 mm, 5 μm Fase móvil: 82% H2O : 18% ACN
Volumen de inyección: 30 μL Muestra: 1. Cafeina 2. Salicilamida
1
A de inyección
B de inyección
A. Solvente 100% Acetonitrilo
B. Solvente Fase Móvil
1
2
2
0 10
Time (min)
0 10
Time (min)
Consejo: Inyectar un solvente más fuerte que la fase móvil puede provocar problemas
en los picos tales como picos divididos o ensanchamiento
Truco: Mantener la concentración de orgánico en el solvente de muestra < Fase móvil
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18. Colas, ensanchamiento
y perdida de eficacia
Pueden ser causadas por:
• “Interacciones secundarias” en
la Columna
• Contaminación en la Columna
• Envejecimiento de la columna
• Saturación de la columna
• Efectos extra columna
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19. Forma del pico: Colas en los picos
Simetría > 1.2 Causas
Algunos picos con cola:
ƒ Interacciones secundarias – Efectos de
Retención
ƒ Interacciones con silanoles residuales
Normal Cola
residuales.
ƒ Pico pequeño eluyendo en la cola de un pico
mayor.
Todos los picos con colas:
ƒ Efectos extra-columna.
ƒ Acumulación de contaminación en la
Normal Colas
entrada de la columna.
ƒ Metales pesados.
ƒ Mala columna.
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20. Colas en los picos- Contaminación en la
Columna
Consejo: Test Rápido para Determinar si la Columna está Sucia o está Dañada
Truco: Revetir la columna y analizar–Si hay mejora, una limpieza puede
ayudar ayudar-No hay mejora mejora-Columna Dañada y necesita ser reemplazada
Test QC dirección Test QC dirección inversa
Test QC despues lavado
100% IPA 35°C
Platos TF 3
3
Platos TF
3
1. 7629 2.08
2 1 64
1. 7906 1.43
Platos TF
1. 7448 1.06
2 1 21
correcta
Q IPA, 35 2
2
2
2. 12043 1.64
3. 13727 1.69
4 13355 1.32
2. 12443 1.21
3. 17999 1.19
4 17098 1.25
2. 12237 1.21
3. 15366 1.11
4 19067 1.17
4
1
4
1 1 4
0.0 2.5 5.0
Time (min)
0.0 2.5 5.0
Time (min)
0.0 2.5 5.0
Time (min)
Columna: StableBond SB-C8, 4.6 x 250 mm, 5μm Fase Móvil: 20% H2O : 80% MeOH Flujo: 1.0 mL/min
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Temperatura: R.T. Detección: UV 254 nm Muestra: 1. Uracilo 2. Fenol 3. 4-Cloronitrobenzeno 4. Tolueno

21. Forma de Picos: Picos con Frente (Fronting)
2000
1500
1000
mAU
500
0
0 5 10 15 20 25
Ti ( i ) Normal Fronting
Simetría < 0.9
Tiempo(min)
Causas:
ƒ Saturación de columna
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22. Colas en los picos/Ensanchamiento
Efectos de carga de muestra
Columnas: 4.6 x 150 mm, 5μm Fase Móvil: 40% 25 mM Na2HPO4 pH 7.0 : 60% ACN Flujo: 1.5 mL/min
T t 40°C M t 1 D i i 2 N t i Temperatura: Muestra: 1. Desipramina 2. Nortriptilina 3. Doxepina 4. Imipramina 5. Amitriptilina 6. Trimipramina
A. Ensanchamiento Factor de Alta Carga C
Platos de una C8
g C.
x10
C D
Cola
Eclipse XDB-C8
USP TF (5%) i
A B
B
1. 850 5941
2. 815 7842
3. 2776 6231
4. 2539 8359
1. 1.60 1.70
2. 2.00 1.90
3. 1.56 1.56
4. 2.13 1.70
0 5 10
Time (min)
0 5 10
Time (min)
B. D. Baja Carga
5. 2735 10022
6. 5189 10725
5. 2.15 1.86
6. 1.25 1.25
0 5
0 5 Time (min)
Time (min)
Consejo: Evaluar tanto el Volumen como la Masa cargada
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23. Forma de Picos: Picos Anchos
Todos los picos ensanchan:
• Pérdida de Eficacia de la columna.
• Volumen muerto.
•• Gran Volumen de Inyección.
Algunos picos ensanchan:
• Elución tardía de una muestra previa
(Pico fantasma).
– Alto Peso Molecular.
– Muestra - Proteina o Polímero.
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24. Dispersión Extra-Columna
Aumentando el Volumen Extra-Columna
n Use tubos cortos de pequeño diámetro interno entre el inyector y
la columna y entre la columna y el detector.
n Asegúrese de que todas las conexiones de los tubos están
hechas con los fittings adecuados.
n Use una celda de detector de bajo volumen.
n Inyecte pequeños volumenes de muestra.
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25. Consejo: Malas Conexiones en el HPLC
pueden Causar Ensanchamiento de Picos
El Sistema se ha optimizado y :
– Todas las longitudes de los Tubos son Mínimas
– Se usó el diametro más pequeño de tubo
– Una celda de flujo de volumen adecuado
Los Síntomas parecen mostrar que todavía hay demasiado
Volumen Extra-Columna
¿Qué está mal?
¿ha hecho las conexiones adecuadamente?
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26. Conectores de Columna Usados en HPLC
Troubleshooting Fittings II J W Dolan P Upchurch LC/GC LC Fittings, Part II. J. W. and P. Upchurch. Magazine 6:788 (1988)
Swagelok Waters
0.090
in.
0.130
in.
g
0.090
in.
0.170
in.
Parker Rheodyne
Valco Uptight
0.090
in.
0.080
in.
Page 26

27. ¿Qué Ocurre si las conexiones no son correctas?
Incorrecto … demasiado largo
La Férrula no asienta adecuadamente
Incorrecto … demasiado corto
X Cámara de mezcla
Si la distancia X es muy larga, habrá fuga
X
Si la distancia X es demasiado corta, se
generará un volumen muerto o cámara de
mezcla
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28. Los cambio en Retención puedes ser Químicos o
Físicos
Pueden estar causados por:
• Envejecimiento de la columna
• Contaminación de la columna
• Equilibración insuficiente
• Pobre combinación columna/fase móvil
•• Cambio en la fase móvil
• Cambio en el flujo.
• Diferentes volumenes de retraso del gradiente
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29. Envejecimiento de la fase móvil/Equilibración
Causan Cambios en la Retención/Selectividad
Columna 1 – Tras lavado con
Columna 1 - Inicial Columna 1 – Dia siguiente 1% H3PO4 /Equilibración
1
1
2
2
0 3 5 9 12 15
Time (min)
0 3 5 9 12 15
Time (min)
• El analito primario era sensible al envejecimiento de la fase
movil/ acondicionamiento de la columna
• La forma de pico fue un asunto secundario (compuesto
quelante de metal)resuelto por “des-activación” de la
Page 29
contaminación activa del metal

30. Los compuestos sensibles a los metales
pueden Quelarse
Pista: Busca un par solitario de Electrones en
:
:O: o N que pueda formar anillos de 5 or 6
miembros con un Metal
O H
C O
:
H C
OH
M+2
: : :
OH + M+2
Salicilaldehido Complejo Anillo de 6-miembros
OH
: :
M+2 C O
C N OH
N: M+2
: : :
8-hidroxiquinolina
Complejo Anillo de 5-
miembros
a-benzoinoxomina
Complejo Anillo de 5-
miembros
Page 30

31. Un lavado Acido puede mejorar la forma de
pico
Antes del lavado
id
acido – mLs 1% H3PO4
Después del lavado ácido
50 100 L H PO
M+2 - -
HO OH OH
HO OH OH
1. 2. OH
1. 2. OH
Columnas:ZORBAX SB-Phenyl
1 4.6 x 150 mm
2
Fase Móvil: 75% 25 mM tampón
fosfato amónico / 25% CAN
Flujo: 1.0 mL/min.
Temperatura: RT
1
2
Tamaño muestra: 5 mL
Tf: 3.7 Tf: 1.2
• Se usó una solución del 1% H3PO4 en columnas SB; en columnas desactivadas puede usarse
un 0.5 % .
Page 31

32. pH de la Fase Móvil y pH de tampones
¿Porqué son tan importantes en HPLC?
•El pH afecta la Ionización
– Superficie de la Silica de la Columna
– Componentes de Interés de Muestra
• Tampones
– Resisten Cambios de pH y Mantienen la Retención
– Mejoran la Forma de Pico de los Compuestos Ionizables
• Efectos en el tiempo de Vida de la Columna
– pHs bajos liberan las cadenas alquilicas de la Fase estacionaria
– pHs altos Disuelven la Silica
Los cambios de pH tienen un gran Page 32
efecto en la forma de pico, la retención y la reproducibilidad lote a lote

33. ¿Porqué preocuparse del pH?
pH, pKa y Ácidos Débiles
[[RCOO-][H+]
[RCOOH]
RCOO H
RCOOH RCOO- + H+ Ka a =
Ka = 6.4 10-5
COOH COO
_
x 10
+ H+ pKa = 4.2
A pH 4.2 – la muestra contiene ácido benzoico e ión benzoato en proporción
de 1:1. La forma de Pico puede ser pobre
A pH 5.2 – el 91% de la muestra es ión benzoato. La retencion RP disminuye.
A pH 3.2 – el 91% de la muestra es ácido benzoico. La retencion RP aumenta.
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34. Efecto del pH en la Forma de Pico
a o cerca del pKa de la Muestra
Columna: ZORBAX SB-C8 4.6 x 150 mm, 5 mm Fase Móvil: 40% 5 mM KH2PO4: 60% ACN
Flujo: 1.0 mL/min. Temperatura: RT
pH 4 4 pH 3 0
CH3CHCOOH
4.4 3.0
CH2CH(CH3)2
Ibuprofeno
pKa = 4.4
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Time (min) Time (min)
• Cuando se trabaja cerca del pka de un analito se obtienen picos con colas y esto
debe evitarse
Page 34
evitarse.

35. ¿Porqué preocuparse del pH?
pH, pKa y Bases Débiles
[R3N][H+] R3NH+ R3N + H+
Ka =
H ]
[R3NH+]
K = 10-9
3 3
+
Ka 1 x 10 pKa = 9
CHOCH CH N 2 2
CH3
CH
∅
∅
H
CH3
CH
∅
∅
CHOCH CH N 2 2 + H+
3
3
A pH 9 – la muestra contiene difenhidraminas protonadas y desprotonadas
en relación 1:1. La forma de pico puede ser pobre
A pH 10 – 91% de la muestra es difenhidramina desprotonada.
A pH 8 – 91% de la muestra es difenhidramina protonada.
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36. pH vs. Selectivdad para Acidos y Bases
5
Columna: Nucleosil-C18
Fase Móvil: 45% ACN/55% tampón fostato
Muestra: Acidos Biliares
Columna: mBondapak-C18
Fase Móvil: 60% 25 mM tampón fostato
40% Metanol
1 SCD
1.5
40
6
1. Ácido Salicílico
2. Fenobarbital
3. Fenacetin
4. Nicotina
5. Metamfetamina
5
1.0
g k«
30
on
UDC
4 SOC
2 + 0.5
log
4
20
Retentio
C
12-OC J.C. 111(1975) 149
+
3
1 7,12 - OC
+ +
J.C. 268(1983) 1 10 3
+
+
1
0.0
2
-0.5
3 4 5 6 7 8 pH
A B C
3 5 7 9
ELUENT pH
10
•La cambiar cambia el pH
Page 36
Retención y la selectividad puede dramáticamente cuando se pH.

37. Importancia del pH y los Tampones
Un Ejemplo Práctico
•Por qué la Muestra impone las condiciones de uso
•Qué pasa cuando el tampón se usa con efectividad
•Qué pasa cuando se ignora el tampón o se usa
inadecuadamente
Page 37

38. Tampones más usados en Fase Reversa HPLC
Buffer pKa Buffer Range UV Cutoff (nm)
Phosphate 2.1 1.1-3.1 200
7.2 6.2-8.2
12.3 11.3-13.3
Formic acid* 3.8 2.8-4.8 210
Acetic acid* 4.8 3.8-5.8 210
Citrate 3.1 2.1-4.1 230
4.7 3.7-5.7
5.4 4.4-6.4
Tris 8.3 7.3-9.3 205
Triethylamine* 11.0 10.0-12.0 200
Pyrrolidine 11.3 10.3-12.3 200
* Volatile buffers for LC/MS applications
La capacidad de tamponamiento óptima se dá a un pH igual al pKa del tampon. La mayoría de
los tampones tienen una capacidad adecuada de tamponamiento para controlar el pH de la fase
movil solo en ±1 unidades de su pKa
Page 38

39. Importancia del pH y Tampones - Un Ejemplo Práctico
Condiciones Isocráticas Optimizadas para Fármacos Cardíacos
1
Columna: StableBond SB-C18, 4.6 x 150 mm, 5 mm
Fase Móvil: 45% 25 mM NaH2PO4, pH 3.0 (1.1-3.1)
55% MeOH
Flujo: 2.0 mL/min.
Temperatura:35°C
Detección: UV 254 nm
Muestra: Fármacos Cardíacos
1. Diltiazem
2. Dipyridamol
3. Nifedipina
4 Lidoflazina
5
4
3
2
4. 5. Flunarizina
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Time (min)
Page 39

40. No Tengo Tiempo de Hacer Tampones o Ajustar el
pH …
Columna: StableBond SB-C18
4.6 x 150 mm, 5 mm
Fase Móvil: A: 20% H2O
B: 80% MeOH
Flujo: 1.0 mL/min.
Temperatura:35°C
Fuertes
Detección UV:254 nm Muestra: Fármacos Cardíacos
interacciones
secundarias
d l t y y
Incluso a muy alto % MeOH La mayóría de
componentes fuertemente retenidos muestran
pobre forma de pico debido al IEX en la
superficie
de la muestra
(aminas) con
la superficie de
la columna
0 5 10 15 20 25
Time (min)
• Los Tampones son críticos para una buena retención y forma de pico en muchas separaciones
Page 40
separaciones.

41. ¿Qué pasa si trabajas fuera del rango del tampón?
2
Columna: StableBond SB-C18
4.6 x 150 mm, 5 mm
Fase Móvil: A: 30% 25 mM NaH2PO4, pH 4.8 no tamponado
B: 70% MeOH
Flujo: 1 0mL/min
Se añadió
t ó
1
1.0 mL/min.
Temperatura:35°C
Detección UV:254 nm
Muestra: Fármacos Cardíacos
1 tampón,
pero no
1. Diltiazem
2. Dipyridamol
3. Nifedipina
4. Lidoflazina
5. Flunarizina
Forma de Pico Inadecuada
controla el
pH a 4.8
5
3
4
0 5 10 15 20 25
Time (min)
Page 41

42. No olvidar- Elegir la columna adecuada al pH de la
Fase Móvil para el Máximo Tiempo de Vida
pH Alto y Temperatura Ambiente (pH 11 RT)
Fase Móvil: 50%ACN: 50% Agua : 0.2% TEA
(~ pH 11, disolución de la sílica)
Inicial
Después de 30 inyecciones
Consejo: elegido
Page 42
Usar las columnas diseñadas para el pH

43. Efecto del Tiempo de Respuesta del Detector
El Sistema está operando bien- los ajustes se hicieron mal!
Bajas Velocidades de Adquisición Pueden Dificultar la Detección de Impurezas y
Reducir la Sensibilidad
Tiempo de Respuesta
0.1 seg
Agilent 1100 DAD
Agilent 1100 WPS with ADVR
Columna: Poroshell 300SB-C18
2 1 75mm 1er pico = 1.2 seg 0.2 seg
A 20 pts/seg = 24 pts
2.1 x 75 mm, 5 um
Fase Móvil:
A: 95% H2O, 5% CAN con 0.1% TFA
B: 5% H2O, 5% CAN con 0.1% TFA
Flujo: 2 mL/min
0.5 seg
1er pico = 1.2 seg 1 0 Temperatura:70°C
Detector: UV 215 nm
Embolada de Piston : 20
1.0 seg
2.0 seg
p g
A 5 pts/seg = 6 pts
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
Time (min)
1.0
Muestra:
1. Neurotensina 3. Lisozima
2. RNasaA 4. Mioglobina
• una mejor picos
Consejo: Adjuste la velocidad de respuesta del detector para detección de picos.
Page 43

44. Conclusiones
¾ Los problemas en Columnas HPLC más comunes son:
• Alta Presión (Prevenir mejor que curar)
• Malas Formas de Pico
• Cambio en la Retención/Selectividad
¾A menudo estos problemas no están asociados con la columna y pueden
ser causados por el instrumento o por problemas químicos:
• pH de la Fase Móvil
• Conexiones del Instrumento
• Parámetros del Detector
• Contaminación por Metales
¾Comenzar con las pregunta correctas
• Encontrar las respuesta
• Las respuestas conducirán a soluciones
Page 44