1. UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL
“FRANCISCO DE MIRANDA”
PROGRAMA DE CIENCIAS VETERINARIAS
DEPARTAMENTO DE SANIDAD ANIMAL
HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA VETERINARIA
PROFESORES: - Érika Zavala
- Uslar Guerra
TEMA: MISCROSCOPIA E HISTOTECNIA
MICROSCOPÍA
La invención del microscopio de luz, al final del siglo XVI permitió la observación
de la célula y, en los 300 años siguientes todo lo que se supo sobre ella fue descubierto con
el uso del microscopio. Los primeros microscopios fueron construidos a partir del avance
en la producción de lentes de vidrio. Un microscopio, bien sea simple (una lente) o
compuesto (múltiples lentes), es un instrumento que amplifica una imagen y posibilita la
visualización más detallada de lo que podemos ver a ojo desnudo. El microscopio más
simple es un lupa o un par de lentes de lectura.
Al finalizar esta unidad los estudiantes estarán en capacidad de identificar las
diferentes estructuras del microscopio compuesto y a manejarlo adecuadamente como
herramienta principal de trabajo de histología.
Diversos microscopios ópticos están disponibles para uso general y especializado en
la investigación en la biología moderna. Sus diferencias se fundamentan, en gran parte, en
ciertos factores como longitud de onda de la luz empleada para iluminar la muestra en
estudio, alteración física de la luz que llega o sale de la muestra y procesos analíticos
específicos que pueden ser aplicados en la imagen final.
TIPOS DE MICROSCOPIO ÓPTICOS:
Microscopio de campo claro. Es el microscopio óptico más común y es usado para
análisis biológicos.
Microscopio de contraste de fase, posibilita el examen de células y tejidos no
coloreados y es particularmente útil para la observación de células vivas, como las
células en cultivos de tejidos, y es ampliamente empleado para examinar cortes
semifinos (de aproximadamente 0,5 μm) no colorados de tejidos incluidos en plástico.
Dos modificaciones del microscopio de contraste de fase son el microscopio de
interferencia, que también permite la cuantificación de la masa tecidual, y el
microscopio de interferencia diferencial (que usa la iluminación de Nomarski), que es
particularmente útil para evaluar las propiedades de superficie de las células y otros
objetos biológicos.
Microscopio de campo obscuro. Ninguna luz directa a partir de la fuente de
iluminación es captada por el objetivo. En este tipo de microscopio, sólo la luz que fue
dispersada o difractada por las estructuras en la muestra alcanza el objetivo. El
microscopio de campo obscuro es equipado con un condensador especial que ilumina la
2. muestra con luz oblicua e intensa. De esta manera, el campo de visión aparece como un
fondo obscuro sobre el cual pequeñas partículas en la muestra, las cuales reflejan alguna
luz para el objetivo, aparecen brillantes. El efecto es semejante a aquel de las partículas
de polvo observadas en el eje luminoso que emana a partir de un proyector de slide en
un ambiente obscuro. Este microscopio es útil en el examen de radioautografías, en los
cuales los granos de plata desenvueltos aparecen en un fondo obscuro. Clínicamente, es
útil para examinar la orina en la búsqueda de cristales como los de ácido úrico y
oxalato, y en la observación de espiroquetas, principalmente triponema pallidum, el
microorganismo que produce la sífilis.
Microscopio de fluorecencia, hace uso de la capacidad de ciertas moléculas de
tornarse fluorecentes bajo la luz ultravioleta. Una molécula fluorecente emite luz de
longitud de onda en la faja visible, cuando es expuesta a una fuente de luz ultravioleta.
Este microscopio es usado para observar moléculas fluorecentes por si mismas
(autofluorecentes) como la vitamina A y algunos neurotransmisores. Sin embargo,
como las moléculas autofluorecentes no son numerosas, su aplicación más difundida
consiste en la demostración de fluorecencia introducida, como en la detección de los
antígenos o anticuerpos en procedimientos de coloración inmunocitoquímica. Las
moléculas fluorecentes específicas también pueden ser inyectadas en un animal o
directamente en las células y usadas como marcadores. Estos métodos han sido útiles en
el estudio de los uniones (espacios) intercelulares, en el rastreo de trayectos de fibras
nerviosas en neurobiología y en la detección de marcadores de crecimiento fluorecentes
de los tejidos mineralizados.
Microscopio de barrido confocal, combina los componentes de un microscopio
óptico con un sistema de barrido para disecar ópticamente la muestra. Permite la
visualización de una muestra biológica en tres dimensiones. Las dos lentes en el
microscopio confocal (objetivo y lente del foco) están perfectamente alineadas para
focalizar la luz originada de una lente en el punto focal de otra lente. La principal
diferencia entre un microscopio convencional y uno confocal es la adición de una
abertura detectora (orificio) que es conjugada al punto focal de la lente; por lo tanto, es
confocal.
Microscopio de luz ultravioleta, utiliza lentes de cuartzo con una fuente de luz
ultravioleta. La imagen en el microscopio ultravioleta depende de la absorción de la luz
ultravioleta por las moléculas en la muestra. La fuente de luz ultravioleta posee una
longitud de onda de aproximadamente 200 nm. En principio, este microscopio se
asemeja al funcionamiento de un espectrofotómetro; los resultados son usualmente
registrados por medios fotográficos. La muestra no puede ser examinada directamente a
través de un ocular por que la luz ultravioleta no es visible y es nociva para el ojo. El
método es útil en la detección de ácidos nucleicos, específicamente las bases de purina
y pirimidina de los nucleótidos. También es útil para detectar proteínas que contienen
determinados aminoácidos. Clínicamente es usado para evaluar el grado de ploidía
(múltiplos de la cantidad de ADN normal) en los cortes de tumores.
Microscopio de polarización, se basa en el hecho de que las moléculas o grupos de
moléculas altamente ordenados pueden rodar el ángulo del plano de luz polarizada. Es
una modificación simple del microscopio óptico, en el cual un filtro de polarización,
llamado polarizador, se localiza entre la fuente luminosa y la muestra, siendo que un
segundo polarizador, llamado analizador, se localiza entre el objetivo y el observador.
3. Tanto el polarizador como el analizador pueden ser rodados; la diferencia entre sus
ángulos de rotación es usada para determinar el grado por el cual una estructura afecta
el eje de la luz polarizada. La capacidad de un cristal o arreglo paracristalino de rodar el
plano de la luz polarizada es llamada birrefringencia (refracción doble). El músculo
estriado y las inclusiones cristaloides en las células intersticiales testiculares (células de
Leydig), entre otras estructuras comunes, exhiben birrefringencia.
DESCRIPCIÓN DEL MICROSCOPIO ÓPTICO
Un microscopio óptico en general es compuesto por tres sistemas principales
denominados sistemas mecánico, óptico y de iluminación:
1) Sistema mecánico, viene a ser la parte física del microscopio que le da sostén a los otros
dos componentes o sistemas. Este comprende:
- La columna. Representa el soporte del microscopio donde se localizan el cabezal, el
revolver, la platina y subplatina, y el botón único de mando. Esta estructura se encuentra
formada por dos partes: el brazo de la columna y la columna propiamente dicha. El
brazo de la columna tiene una inclinación levemente horizontal, y en la parte superior de su
extremidad libre se localiza el cabezal. En la parte inferior de la extremidad libre del brazo
de la columna se encuentra localizado el revolver. Además de eso, el brazo de la columna
sirve de soporte para sujetar el microscopio con la mano y transportarlo con seguridad. En
su extremidad opuesta, la extremidad fija, el brazo de la columna se continúa con la
columna propiamente dicha, que es un soporte vertical en cuya superficie frontal del
segmento medio inferior se localiza la platina, y debajo de ésta, la subplatina. En la
superficie lateral del segmento medio inferior se sitúa el botón único de mando.
- El cabezal, estructura de forma más o menos cuadrada que se localiza en la parte
superior del extremo libre del brazo de la columna. El cabezal posee dos extremidades: una
libre y otra fija. En la extremidad libre (parte superior) están localizados los oculares, la
dioptría y la distancia interpupilar. La dioptría es un dispositivo que permite girar los
oculares para adaptarlos a la necesidad de visión de cada observador. La distancia
interpupilar también es un dispositivo colocado en la parte superior del cabezal usado para
regular la distancia entre el centro de ambos ojos del observador. En el interior del cabezal
se localizan de forma estratégica varios espejos o prismas cuya función es desviar la luz
proveniente de la fuente de iluminación, la cual trae un trayecto recto, hacia los ojos del
observador para de esa manera percibir la imagen del objeto en estudio.
- El revolver. Dispositivo de forma circular cuya porción fija está atornillada a la parte
inferior del extremo libre del brazo de la columna, justo debajo del cabezal. La parte móvil
del revolver realiza un giro de 360 grados sobre su propio eje, y presenta 4 ó 5 orificios
circulares donde se insertan los objetivos de diferentes aumentos. La selección del objetivo
que se desee utilizar para la observación del espécimen, se realiza girando la parte móvil
del revólver, de manera que cuando una pequeña proyección de la misma encaje en una
muesca de la porción fija, el objetivo seleccionado cae en el eje óptico del microscopio.
- La platina. Es una estructura cuadrada, con un orificio en la parte central, y representa el
lugar donde se coloca la lámina portaobjetos que contiene la muestra en estudio. La platina
contiene un dispositivo que sostiene la lámina portaobjetos y cuyo desplazamiento es
realizado a través de una estructura denominada charriot, sistema de correderas o carro
de desplazamiento, el cual consta de dos tornillos. El tornillo de la parte superior permite
el desplazamiento para el frente y para atrás de la lámina portaobjetos. El tornillo de la
4. parte inferior permite el desplazamiento de la lámina para la derecha y para la izquierda.
Estos movimientos permiten la selección del área del corte que se desea analizar.
- La subplatina. Como su nombre lo indica, se encuentra localizada por debajo de la
platina y presenta un pequeño tornillo que permite su desplazamiento para la parte superior
e inferior. La subplatina no es más que un anillo de metal que sostiene al condensador, al
diafragma y el filtro de luz.
- El botón único de mando. Se localiza en la superficie lateral del segmento medio inferior
de la columna propiamente dicha, y está formado por el tornillo macrométrico que
permite el desplazamiento de la platina hacia arriba y hacia abajo con movimientos rápidos;
y, el tornillo micrométrico, que también permite el movimiento de la platina, mas de una
forma más lenta, en micrómetros (el movimiento es imperceptible a simple vista). Con este
último se obtiene un foco más fino, lo que permite ver una imagen con mayor nitidez.
- Base o pie del microscopio. Esta es la estructura más pesada del microscopio y, como su
nombre lo indica, representa el apoyo del microscopio para mantenerse firme sobre la mesa
de trabajo.
2) Sistema óptico. Constituido por los oculares y los objetivos, participa directamente en el
proceso de formación de imágenes y por eso requieren ser tratadas con mucho cuidado.
- Oculares. Son dos cilindros cortos de metal localizados en la parte superior del cabezal.
Cada ocular está constituido por dos lentes y un diafragma. La lente que está más próxima
del ojo del observador recibe el nombre de lente ocular, y la que está en el lado opuesto se
denomina lente de campo. Existen dos tipos de oculares: el ocular de Huygens (el
diafragma se localiza entre las dos lentes) y el ocular de Ramsden (el diafragma se
localiza por debajo de la lente de campo). La imagen dada por el ocular es virtual,
derecha y amplificada
- Objetivos. El objetivo forma la imagen del objeto en estudio, existiendo varios tipos,
dependiendo del material usado en la construcción, de su finalidad y de su especialización.
La imagen formada por el objetivo es real, invertida y amplificada. Algunas
características influencian en la calidad de la imagen, ofreciendo mayor o menor grado de
corrección de aberraciones. Los más sofisticados tienen costo elevado y son, de manera
general, usados para fines de investigación. Las especificaciones de cada objetivo son
ofrecidas por el fabricante y vienen indicadas en el propio objetivo. Entre estas
especificaciones, tenemos: la casa fabricante (por ejemplo, OLYMPUS, ZEISS), número de
aumento (4X, 10X, 40X, 100X), abertura numérica (0,65), distancia de trabajo (0,17) y
código de color.
Tipos de objetivos de acuerdo con la calidad óptica:
- Acromáticos: son los más simples y baratos, presentes en microscopio comunes.
- Semi-apocromáticos: construidos con fluorita, un material que proporciona alguna
corrección para las aberraciones.
- Apocromáticos: ofrecen corrección amplia para las aberraciones.
- Planacromático: Además de proporcionar corrección, son óptimos para fotomicrografias,
pues el campo queda todo en foco.
- Planapocromáticos: son los mejores objetivos, y combinan las correcciones de los
apocromáticos y planacromáticos, lo que resulta en gran resolución.
5. Cuando se observa cualquier objeto al microscopio, el observador no está viendo
directamente la estructura y si la imagen de ésta. La imagen es una representación de la
estructura y obviamente ella debe reproducir de forma aguzada el material analizado. Por lo
tanto un buen microscopio no es aquel que da el mayor aumento, y si aquel que reproduce
los detalles del material observado. No importa cuantas veces una lente amplía, si ella no es
capaz de ofrecer una imagen nítida del objeto observado. De esa forma, un buen
microscopio es siempre considerado en términos de su poder de resolución. Este es un
término usado en microscopía para referirse a la fineza de detalles que puede ser obtenida
en un microscopio. Conforme fue mencionado, la capacidad de aumento de un microscopio
sólo tiene valor cuando es acompañada de un aumento paralelo del poder de resolución. El
poder de resolución de un microscopio es estimado por su límite de de resolución,
definido como la menor distancia que debe existir entre dos puntos para que puedan
observarse individualizados. Cuanto menor el límite de resolución, mayor poder de
resolución. El límite de resolución del ojo humano es de aproximadamente 100 a 200 μm.
El límite de resolución del microscopio óptico es de 0,2 μm. Esta resolución permite la
obtención de buenas imágenes aumentadas de 1000 a 1500 veces. Objetos menores de 0,2
μm (como por ejemplo, la membrana de la célula o un filamento de actina) no pueden ser
distinguidos com este instrumento. Igualmente, dos objetos, como dos mitocondrias o dos
lisosomas, serán visto como un solo objeto si ellos estuviesen separados por menos de 0,2
μm. Cuanto menor la distancia entre dos puntos para que ellos aparezcan nítidos (límite de
resolución), más detalles serán observados (poder de resolución), con lo que podemos
concluir que poder y límite de resolución son inversamente proporcionales. El límite de
resolución no solo depende del sistema óptico, si no también de la longitud de onda, del
espesor de la muestra, de la calidad de fijación y de la intensidad de la coloración.
El ocular o lente ocular amplifica o aumenta la imagen producida por el objetivo, mas
no puede aumentar la resolución.
El aumento total del objeto observado es calculado multiplicando los valores del aumento
del ocular y del objetivo. Por ejemplo, al usar un ocular de 10X con un objetivo de 40X, la
imagen final del objeto estará aumentada 500X.
Aumento final del microscopio= aumento del ocular X aumento del objetivo
PROPIEDADES DE LA LUZ
Los efectos de la interacción de la luz con el medio por ella recorrido, son una
consecuencia de su naturaleza corpuscular o fotónica y ondulatoria (radiación
electromagnética). Dos efectos, absorción y refracción, ocurren como consecuencia de la
interacción de la frente de onda, fotónica o electromagnética, con los componentes del
material a ser analizado.
La teoría de la formación de la imagen en los microscopios es regida por las leyes
de la física relacionadas con las propiedades de la luz, como son:
- Descomposición: La luz que procede del Sol se llama luz blanca. Cuando un rayo
de luz solar atraviesa un prisma de vidrio de base triangular, la luz se descompone y
sale formando siete colores, en este orden: rojo, naranja, amarillo, verde, azul, añil y
6. violeta. Esa banda multicolor recibe el nombre de espectro de la luz blanca o de la
luz visible. Si por el contrario, hiciéramos girar muy deprisa un disco al que hemos
dividido en siete sectores, y cada sector lo hemos pintado de uno de los colores
anteriores, respetando ese orden, lo veríamos blanco. En este caso, en lugar de
descomponer, estaríamos agregando o mezclando los colores del espectro de la luz
visible. Sucede que, en realidad, aunque no lo veamos, la luz blanca está compuesta
por varios colores. Cuando la luz del Sol atraviesa las gotas de agua de lluvia, sus
rayos se descomponen de la misma forma que lo hacen al atravesar un prisma,
originándose el arco iris que vemos en el cielo. Creemos que el color es una
propiedad invariable de los cuerpos, pero, en realidad, el color varía con la
intensidad o el tipo de rayos de luz que recibe el cuerpo.
El color con el que vemos a un cuerpo está formado por los componentes de la luz
que el cuerpo refleja (mientras que los demás componentes los absorbe). Si un
cuerpo refleja todos los colores del espectro, lo veremos de color blanco, mientras
que si los absorbe todos lo veremos de color negro. La hierba de un campo de fútbol
absorbe todos los colores menos el verde, que es el color que refleja y como la
vemos. Un tomate maduro absorbe todos los colores menos el rojo, que es como lo
vemos.
- Propagación: la propagación de la luz es rectilínea y en todas direcciones. Los
cuerpos se comportan de manera diferente cuando la luz los ilumina. Así, hay
cuerpos de tres tipos: opacos, traslucidos y transparentes. Los cuerpos opacos no
dejan pasar la luz produciendo sombra tras ellos. Una piedra, un árbol o nuestro
propio cuerpo son cuerpos opacos a la luz. Los cuerpos traslúcidos sólo dejan pasar
parcialmente la luz a través de ellos. Cuando la luz los ilumina, sobre su superficie
se forman imágenes borrosas, poco nítidas. Los cuerpos transparentes, dejan pasar
a través de ellos toda la luz que les llega, como una lámina fina de cristal.
- Velocidad: la velocidad de la luz en el vacío es de 300.000 km/seg2. Cuando los
rayos de luz atraviesan el aire, el agua o el vidrio, su velocidad es menor que en el
vacío.
- Reflexión de la luz: propiedad de la luz, en la que al hacerse incidir un rayo de luz
sobre un cuerpo, una parte de la misma rebota en la superficie del cuerpo y se
devuelve.
- Refracción de la luz: capacidad que tiene la luz de atravesar un medio tráslucido
o transparente. La refracción es el cambio de dirección que experimentan los rayos
de luz al pasar de un medio material a otro distinto, por ejemplo al pasar del aire al
agua. Esto provoca que veamos imágenes distorsionadas, como cuando metemos
una cuchara en un vaso de agua: la vemos como si tuviera dos partes, la de fuera y
la de dentro del agua.
- La luz también puede ser absorbida por un cuerpo, pudiendo provocar diversos
efectos, como que el cuerpo se caliente, una reacción química o una pequeña
corriente eléctrica.
Generalmente, estos fenómenos se producen a la vez, aunque siempre predomina uno de
ellos. Por ejemplo, al incidir los rayos del sol en una ventana, predomina la refracción,
mientras que sobre un espejo predomina la reflexión.
Tipos de lentes usadas en la microscopía óptica
7. Las lentes usadas para la construcción de oculares y objetivos se caracterizan porque
en ellas predomina la convexidad. Los principales tipos de lentes son clasificadas en dos
grandes grupos:
- Lentes convergentes, positivas o de aumento. Comprenden las lentes planoconvexas,
biconvexas y convexocóncavas (las más usadas en microscopía óptica son la planoconvexa
y la biconvexa)
- Lentes divergentes o negativas: en ellas predomina la concavidad. Entre ellas tenemos:
la planocóncava, la bicóncava y la plano cóncava.
3) Sistema de iluminación: conformado por la fuente de iluminación, filtro, el
condensador y el diafragma.
- Fuente de iluminación: generalmente se encuentra localizada en la base del microscopio,
y puede ser de una lámpara de xenón o de halógeno.
- Filtro: los filtros tienden a ser de color verde o azul. El filtro azul transforma la luz
amarilla en luz blanca, que es la más adecuada para obtener una imagen de mejor calidad.
- Condensador: constituido por un conjunto de lentes, se localiza en la parte superior de la
subplatina, y su función es condensar, reunir o agrupar los rayos luz proveniente de la
fuente para formar un solo haz de luz.
- Diafragma: se localiza por debajo del condensador y tiene la función de regular la
intensidad de luz proveniente de la fuente de iluminación.
USO ADECUADO DEL MICROSCOPIO
- Encienda la lámpara y gire el revolver del microscopio de modo que el objetivo de
menor aumento quede en posición de uso.
- Coloque la lámina portaobjeto sobre la platina con la lámina cubreobjeto dirigida
hacia arriba.
- Utilizando el sistema de correderas, centralice el corte en medio del campo.
- Focalice el corte con el objetivo de menor aumento, utilizando inicialmente el
tornillo macrométrico (foco grosero). Para facilitar la focalización, se puede apartar
la platina hasta el punto máximo y después aproximarla girando el macrométrico
hasta obtenerse el foco. Ambos ojos deben estar siempre abiertos al observar a
través de un microscopio sea él mono o biocular.
- Mejore el foco utilizando el tornillo micrométrico (foco fino).
- Gire el revólver y cambie para el objetivo de medio aumento. Obtenga el foco con
el tornillo micrométrico. De modo general, los objetivos secos son parafocales, es
decir, si la muestra estuviese bien focalizada en un aumento, estará muy próximo
del foco en los otros aumentos. En esa situación sólo se hace necesario el uso del
micrométrico para obtener el foco fino.
- Utilizando el sistema de correderas, escoja el área o estructura a ser estudiada y
centralícela en el campo.
- Gire el revólver y cambie para el objetivo de mayor aumento, con cuidado para que
la muestra no alcance la lámina o quiebre la lámina cubreobjetos. En foco, el
8. objetivo deberá quedar muy próximo de la lámina cubreobjetos, mas sin tocar la
misma. Si la imagen se encuentra muy distante del foco, se recomienda recomenzar
la focalización con el objetivo de menor aumento.
- Al cambiar de lámina o al guardar el microscopio, vuelva para el objetivo de menor
aumento. Al terminar su observación, no se olvide de retirar la lámina de la platina,
apagar la lámpara, desconectar el cable, y finalmente, colocar el forro protector.
- Para transportar el microscopio de manera segura, debe hacerlo sujetándolo por el
brazo de la columna con la mano derecha, y colocar la mano izquierda por debajo
de la base del microscopio.
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
La construcción del microscopio electrónico fue de extrema importancia para el
desarrollo de la Biología Celular, permitiendo el conocimiento de la organización interna
de la célula (ultraestructura), así como de las interacciones morfológicas célula – célula y
célula – matriz extracelular. Hasta entonces, la mayoría de las organelas y estructuras
celulares eran desconocidas, en vista de que sus dimensiones se encuentran por debajo del
límite de resolución del microscopio de luz.
TIPOS DE MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS
Dos tipos básicos de equipos son llamados microscopios electrónicos: el
microscopio electrónico de transmisión (MET) y el microscopio electrónico de
barrido. Ambos equipos fueron inventados en la misma época, mas con propósitos
diferentes.
Microscopio electrónico de transmisión. Usa la interacción de un eje de electrones
con una muestra para producir una imagen. La “óptica” del MET es la misma del
microscopio óptico, excepto por el hecho de que el MET utiliza un eje de electrones en
lugar de un eje de luz, que permite la obtención de un límite de resolución de 0,2 nm.
En el MET, el eje de electrones pasa a través de cortes extremadamente finos de una
muestra, produciendo una imagen bidimensional del interior de ésta sobre una pantalla.
El funcionamiento del microscopio electrónico de transmisión se basa en el siguiente
principio: electrones pueden ser desviados por campos electromagnéticos de una
manera semejante a la refracción producida en la luz por lentes de vidrio. Electrones
son liberados por el calentamiento de un delicado filamento metálico (generalmente de
tungsteno) en el vacío.
Los electrones liberados por este filamento (llamado cátodo) son entonces
sometidos a una diferencia de voltaje de 60-120 kV existente entre el cátodo y el ánodo,
que es un plato metálico con un orificio en el centro. Así, los electrones son atraídos por
el ánodo y acelerados, alcanzando altas velocidades. Después de atravesar el orificio del
ánodo ellos forman un eje de electrones que recorre el tubo del microscopio. En el tubo,
el eje de electrones pasa por el interior de bobinas eléctricas y es desviado de manera
análoga a lo que acontece con un eje luminoso en lentes de vidrio, porque electrones
desvían su trayectoria cuando son sometidos a campos magnéticos. Por esta razón, las
bobinas de los microscopios electrónicos son llamadas lentes electromagnéticas. La
mayoría de los electrones alcanza el objetivo que produce una imagen aumentada del
objeto, la cual es proyectada en las otras lentes que a la vez la imagen todavía más. Por
el hecho de nuestra retina no ser sensible a electrones, para observarse una imagen los
9. electrones necesitan ser proyectados sobre un detector. – Una placa fluorecente, un
negativo fotográfico o una cámara CCD.
Como la imagen en el microscopio electrónico de transmisión es producida por el
balance de la cantidad de electrones que alcanzaron el detector y electrones que fueron
retenidos en el tubo del microscopio, la imagen resultante es siempre en blanco y negro.
Las áreas obscuras de una micrografía electrónica son denominadas electrodensas, en
cuanto que las áreas claras son llamadas electrolúcidas o electrotransparentes.
Para haber una interacción adecuada entre el espécimen y los electrones, el
microscopio electrónico utiliza cortes muy delgados (40-90 nm de espesor), y para
conseguir estos cortes los tejidos son incluidos en resinas plásticas, como las de tipo
epoxi. Los bloques así obtenidos son tan duros que navajas de vidrio o de diamante son
necesarias para seccionarlos. Los cortes son colectados en pequeñas gradillas de metal
midiendo cerca de 3 mm de diámetro, las cuales son colocadas en el interior del tubo
del microscopio para ser observadas. Técnicas de congelación permiten el examen de
tejidos por microscopía electrónica sin la necesidad de fijación e inclusión en resina.
Con estas técnicas hay menos artefactos en comparación con las técnicas
convencionales, mas las técnicas de congelación son muy laboriosas. Tejidos
congelados pueden ser seccionados y sometidos a técnicas citoquímicas o
inmunocitoquímicas o pueden ser fracturados (criofractura, freeze fracture) para
ofrecer detalles de la estructura interna de membranas celulares.
MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE BARRIDO
La microscopía electrónica de barrido ofrece imágenes pseudos-tridimensionales da
superficie de las células, tejidos y órganos. En este microscopio electrónico un haz muy
pequeño de electrones es movido secuencialmente de modo que le permita escanear (barrer)
el espécimen. A diferencia del MET, en el microscopio de barrido los electrones no
atraviesan el espécimen. Los electrones interactúan con una camada muy delgada de metal
previamente aplicada al espécimen y son reflejados por los átomos de metal. Estos
electrones son capturados por un detector que los transmite a amplificadores u otros
dispositivos de forma que la señal es finalmente proyectada en un tubo de rayos catódicos
(un monitor), resultando en una imagen en blanco y negro. Estas fotografías resultantes son
de fácil interpretación, pues presentan imágenes que parecen ser iluminadas y poseen
regiones claras y otras sombreadas. El microscopio electrónico de barredura muestra
solamente una visión de superficie. El interior de órganos puede ser analizado congelando
células u otros órganos y en seguida fracturándolos para exponer sus superficies internas.
HISTOTECNIA
Para la observación de cualquier material biológico al microscopio, bien sea óptico o
electrónico, es necesario prepararlo adecuadamente a través de una secuencia de etapas. En
esta unidad serán descritas las etapas principales que permiten la obtención de
preparaciones permanentes de muestras biológicas para ser analizadas al microscopio
óptico o electrónico.
10. Colecta de la muestra. Esta etapa es de importancia fundamental para el estudio de los
componentes celulares y subcelulares, pues en esta fase es que son definidas las formas
de análisis de las preparaciones histológicas. La toma de la muestra debe realizarse en
un tiempo no mayor de 5 minutos para evitar los cambios post-mortem. Se deben
utilizar tijeras y hojillas de bisturí que estén en perfectas condiciones para evitar
lesionar el tejido. El tamaño de la muestra debe ser de 5 a 10 cms. Una vez obtenida la
muestra se deberá colocar en un envase previamente identificado colocando el nombre
del paciente, edad, sexo, procedencia, tipo de muestra y fecha de la toma de la muestra.
Fijación. La fijación es el proceso de preservación de las células y tejidos. Las muestras
deben ser inmersas en el fijador inmediatamente después de la remoción del organismo,
preservándolas de forma de evitar la degradación celular (autólisis), que se inicia
después de la muerte del tejido, y la digestión de éste por bacterias. La fijación persigue
mantener la misma organización estructural presentada in vivo y minimizar el
aparecimiento de detalles que no sean de la estructura normal (artefactos de
histotecnia). El intervalo entre la colecta del material y el inicio de la fijación debe ser
mínimo para evitarse el inicio de la autólisis. La fijación es realizada para:
- Interrumpir el metabolismo celular;
- Evitar la degradación enzimática de las células y tejidos por autólisis
(autodigestión);
- Matar los microorganismos patológicos como bacterias, hongos o virus;
- Endurecer el tejido en consecuencia de la ligación cruzada o de la desnaturalización
de las proteínas.
La fijación puede ser hecha por sustancias químicos o, menos frecuentemente, por métodos
físicos. Los fijadores físicos son el frío y el calor. En la fijación química los tejidos son
generalmente inmersos en soluciones de agentes desnaturalizantes o de agentes que
estabilizan las moléculas formando puentes con moléculas vecinas. Estas soluciones son
llamadas fijadores. Como tarda un tiempo para que el fijador se difunda por el interior de
los tejidos, estos generalmente deben ser cortados en fragmentos pequeños antes de ser
inmersos en el fijador, para facilitar la penetración del fijador y, por consiguiente,
garantizar una buena preservación de sus estructuras. Alternativamente, puede ser utilizada
la perfusión intravascular del fijador, que de este modo alcanza la intimidad de los tejidos
rápidamente por los vasos sanguíneos, siendo la mejor fijación. Un buen fijador químico
debe reunir las siguientes características:
- Poseer un rápido poder de penetración;
- Garantizar buena coagulación del material celular en sustancias insolubles;
- Proteger las estructuras celulares contra el encogimiento, tumefacción y distorsión
durante las etapas de deshidratación, inclusión y microtomía;
- Favorecer la coloración.
El formol, una solución acuosa de formaldehído al 37%, en diversas diluciones y en
combinación con otras sustancias químicas y tampones, es el fijador más utilizado. Uno de
los mejores fijadores rutinarios para microscopia óptica es una solución tamponada de
formaldehído al 10%. La química del proceso de fijación es compleja y no siempre bien
comprendida. Formaldehído y gluteraldehido, otro fijador extensamente usado, son
conocidos por reaccionar con los grupos aminas (NH2) de las proteínas de los tejidos. Para
microscopía electrónica los fijadores más comunes son soluciones conteniendo
gluteraldehido y tetróxido de osmio. El tiempo de fijación es variable, dependiendo del
material biológico que se está procesando.
11. Inclusión en parafina. La preparación de una muestra para ser examinada exige su
infiltración o penetración por un medio de inclusión que permite que ella sea finamente
cortada, con un espesor aproximado de 5-8μm. Antes de realizar la impregnación en
parafina, la muestra sufre los siguientes procesos:
- Deshidratación. Tiene por objetivo retirar el agua del fragmento, causando el
endurecimiento de éste y tornándolo adecuado para las etapas posteriores de de
inclusión y microtomía. La deshidratación de materiales biológicos para
microscopía óptica es hecha por la inmersión del fragmento de tejido en una serie de
alcoholes (etanol) en forma creciente (70%, 80%, 90%, 100%, 100%). Para
microscopía electrónica se utilizan la acetona o el óxido de propileno. Los
fragmentos son mantenidos en esos medios durante determinados tiempos que
varían de acuerdo con la muestra que está siendo procesada.
- Diafanización o aclaramiento. Después de la deshidratación, el etanol presente en
los fragmentos debe ser substituido por una sustancia intermediaria (generalmente
un solvente orgánico) que es miscible tanto en el etanol como en el medio que fue
escogido para la inclusión (parafina o resina). Para la inclusión en parafina la
sustancia intermediaria más comúnmente usada es el xilol. Esta etapa tiene el
objetivo de retirar el alcohol del fragmento y tornarlo transparente (diáfano),
preparándolo así para la microtomía. Cuando el fragmento de la muestra es retirado
de la última batería de etanol absoluto y es colocada en la primera batería de xilol, si
esta se torna de aspecto lechoso o turbio, es un indicativo de que hubo una mala
deshidratación y se deberá repetir el proceso de deshidratación para finalmente
realizar la diafanización.
Cuando los fragmentos de tejido son embebidos y saturados con el solvente orgánico,
ellos se vuelven transparentes o traslucidos. A continuación son colocados en parafina
fundida (56-58ºC). El calor causa evaporación del xilol y los espacios existentes dentro
de los tejidos son ocupados por la parafina. El tejido embebido por la parafina se torna
rígido después que es retirado de la estufa. El bloque de parafina es fabricado a partir
de un molde realizado por las llamadas barras de Leuckart, que consisten en dos
estructuras metálicas en forma de L, las cuales pueden organizarse formando un
cuadrado apoyado sobre una lámina, también de metal. La muestra de tejido se retira
con una pinza del último baño de parafina de dentro de la estufa, y después se coloca en
el fondo del cuadrado limitado por las barras de Leuckart, orientándolo de acuerdo con
el plano del corte que se quiere realizar. Posteriormente se coloca parafina fundida en el
cuadrado delimitado por las barras de Leuckart, de una forma cuidadosa para no perder
el plano de orientación del fragmento y se deja llenar el molde hasta arriba, dejándolo
solidificar a temperatura ambiente por aproximadamente 15 min.
Corte del bloque de parafina. Esta etapa consiste en la obtención de cortes delgados,
con espesor apropiado para la observación del material biológico al microscopio óptico
o al electrónico. Para eso se utiliza el micrótomo, un aparato que secciona el bloque de
parafina conteniendo el fragmento en fragmentos con el espesor del orden de
micrómetros (para microscopía óptica, 5-8μm) o nanómetros (para microscopía
electrónica). En este último caso el micrótomo es llamado ultramicrótomo y los cortes
son llamados ultrafinos. Después de esa etapa, los cortes son dispuestos en láminas de
vidrio para la microcopia óptica o en rejillas de metal para la microscopía electrónica.
Coloración de los cortes. Para ser estudiados en el microscopio, la mayoría de los cortes
histológicos deben ser coloreados. Esto, porque con pocas excepciones, la mayoría de los
12. tejidos es incolora, de modo que observarlos al microscopio óptico será muy poco
provechoso. La mayoría de los colorantes se comporta como compuestos ácidos o básicos
y tiende a formar ligaciones electrostáticas (salinas) con radicales ionizados de los tejidos.
Los componentes de los tejidos que se colorean bien con los colorantes básicos son
llamados basófilos, y los que tienen gran afinidad por colorantes ácidos son llamados
acidófilos. El azul de toluidina y el azul de metileno son ejemplos de colorantes básicos.
La hematoxilina se comporta como un colorante básico, ligándose a las estructuras
basófilas de los tejidos. Los principales componentes de los tejidos que ionizan y
reaccionan con colorantes básicos lo hacen por contener ácidos en su composición – ácidos
nucleicos, glucosaminoglucanos y glucoproteínas ácidas. Colorantes ácidos (por ejemplo,
orange G, eosina, fucsina ácida) colorean principalmente los componentes acidófilos de los
tejidos como las mitocondrias, los gránulos de secreción, proteínas citoplasmáticas y
colágeno. Dentro de todos los colorantes, la combinación de la hematoxilina y eosina (HE)
es la más comúnmente usada. La hematoxilina colorea en azul o violeta el núcleo de las
células y otras estructuras ácidas (como porciones del citoplasma ricas en ARN y la matriz
del cartílago hialino. La eosina, por otra parte, colorea el citoplasma y el colágeno en color
rosa. Muchos otros colorantes son usados, como los tricómeros (por ejemplo, los colorantes
de Mallory y de Masson). Las etapas de la coloración son las siguientes:
- Desparafinización. Consiste en retirar hasta el último vestigio de parafina presente
en el corte histológico, pues la mayoría de los colorantes son disueltos en agua, y
como se dijo anteriormente, la parafina y el agua no son miscibles. La
desparafinización se debe realizar con xilol.
- Hidratación. Se realiza al final de la desparafinización, y consiste en pasar el corte
histológico en varias baterías de etanol en orden decreciente (100º, 100º, 90º, 80º,
70º, 70º).
- Coloración con hematoxilina. Después de la hidratación se procede a colorear el
núcleo con la hematoxilina. Lavar el exceso de hematoxilina con agua destilada.
- Coloración con eosina. Sumergir los cortes por breves segundos en las baterías de
eosina para así poder colorear el citoplasma.
Montaje. Consiste en colocar una gota de un medio de montaje (Martes o Bálsamo de
Canadá) sobre el corte colocado encima de la lamina portaobjetos y posteriormente
colocar sobre éste la lámina cubreobjetos. Antes del montaje, se debe realizar lo
siguiente:
- Deshidratación del corte, a fin de evitar la contaminación por bacterias, hongos y
otros microorganismos que puedan causar deterioro del material, preservándolos así
por mucho tiempo. Uso de las baterías de etanol en orden creciente.
- Diafanización o aclaramiento, con xilol para retirar el etanol.
