Este estudio buscó purificar una fosfodiesterasa de nucleótidos cíclicos tipo 1A (PDE-1A) sensible a la vinpocetina presente en las membranas plasmáticas del músculo liso traqueal bovino. La PDE-1A fue extraída de las membranas plasmáticas mediante un procedimiento hipotónico y purificada usando cromatografía de intercambio iónico y afinidad por calmodulina. Esto resultó en una enzima purificada 32 veces que mostró mayor

1. Resúmen # B-16
El asma es una enfermedad inflamatoria crónica caracterizada por la contracción reversible
del músculo liso traqueo-bronquial. La contracción del músculo liso traqueal de bovino
(MLTB) activa cascadas de señalización que generan segundos mensajeros como: AMPc/
LA PURIFICACIÓN DE UNA FOSFODIESTERASA DE LOS
NUCLEÓTIDOS CÍCLICOS (PDE-1A) DEL MÚSCULO LISO TRAQUEAL
GMPc. Los niveles de GMPc en el MLTB son regulados por la activación/inhibición de recep-
tores muscarínicos (MAchRs) acoplados a proteínas G (GPCR) asociados a cascadas que pue-
den aumentar los niveles de AMPc/GMPc mediante la inhibición de fosfodiesterasas (PDEs).
El antagonista muscarínico (atropina) incrementó simultáneamente los niveles de AMPc/
DE BOVINO
GMPc en el MLTB, efecto similar al utilizar IBMX (inhibidor no selectivo de PDE) y la vin-
pocetina (inhibidor específico de PDE-1) en fragmentos de MLTB, sugiriendo la participación
de PDEs en esta respuesta de los antagonistas muscarínicos. Los antagonistas muscarínicos
actúan sobre M2AChRs anclados en el sarcolema, vía una proteína PTX-sensible Gi/o, que
inicia una novedosa vía de señalización celular que conduce a la inhibición de una PDE-1 aso-
ciada al sarcolema. El objetivo de este estudio fue purificar una PDE-1 dependiente de calmo-
dulina e inhibida por vinpocetina, presente en las fracciones de membranas plasmáticas del
MLTB. La PDE-1 fue extraída de las fracciones de membranas plasmáticas utilizando un
amortiguador de baja fuerza iónica, el extracto hipotónico fue aplicado a una columna de Q- P. Mastromatteo-Alberga, F. Pláceres-Uray, R. Gonzalez de Alfonzo, MJ. Alfonzo, I. Lippo de Becemberg
Sefarosa y eluída con un gradiente de NaCl (0.4-1.0 M) obteniéndose un pico de actividad
sensible a vinpocetina, el cual fue aplicado a una columna de CaM-Agarosa, y eluída con EG- Sección de Biomembranas. Instituto de Medicina Experimental. Facultad de Medicina.
TA 2 mM obteniéndose un pico de actividad sensible a vinpocetina. La purificación de la pro-
teína de CaM-Agarosa (32 veces) fue analizada mediante PAGE-SDS observándose dos ban- Universidad Central de Venezuela, UCV. Sabana Grande. Aptdo 50587. Caracas-Venezuela
das (56, 58 KDa ) y utilizando anticuerpos mediante inmunoblot, se determinó la presencia de
una PDE-1A (58 kDa). La actividad de PDE fue cuantificada midiendo la cantidad de 3H- patrizia_mast@hotmail.com
Guanosina producida del [3H]GMPc. Subvencionado por CDCH PG -09-7772-2009/1 (MA) y
PG-09-7401-2008/2 (RGA).
Introducción Conclusión
El asma bronquial es una enfermedad inflamatoria crónica, carac terizada
Figura 1. Purificación de la PDE-1 mediante cromatografía de Q-Sefarosa y cromatografía de afinidad CaM-Agarosa
por una disminución reversible del calibre de las vías aéreas. El calibre
Nuestros resultados iniciales indicaron
de dichas vías depende en gran medida del balance entre los procesos 1-a) Perfil cromatográfico de la Q-Sefarosa. 1-b) Perfil cromatográfico de la CaM-Agarosa. por primera vez, la purificación de una
de contracción y relajación del músculo liso de las vías aéreas (MLVA) 1,2 Pool I
a) 0,3 PDE-1A sensible a vinpocetina asocia-
(1). Ambos procesos son iniciados por distintos estímulos o mediado-
res, que son transducidos a través de la membrana plasmática
Pool I da a los receptores muscarínicos si-
1 0,25 tuados en las membranas plasmáticas
(sarcolema) generando cada uno cascadas de señalización que condu-
cen a la generación de segundos mensajeros, tales como: el AMPc,
0,8
preparadas del músculo liso traqueal
GMPc, y el DAG (1). El GMPc ha sido implicado tanto en la relajación 0,2
bovino. Esta PDE activa se purificó
como en la contracción del MLVA (4). Los niveles del GMPc se relacio-
nan con la activación/inhibición de los MAChR, lo cual ha sido reporta- 0,6 0,15 más de 32 veces como una PDE sen-
g/L
g/L
do por Guerra de González y col. en el MLTB (1), quienes demostraron sible a vinpocetina que fue estimulada
que la atropina (un antagonista muscarínico no selectivo), incrementa- 0,4 0,1 dos veces por la calmodulina.
ba de manera significativa las concentraciones de GMPc y AMPc sien-
do este efecto similar al producido por el inhibidor inespecífico de 0,2 Además, en la última fracción de CaM
0,05
PDEs como es el isobutilmetilxantina (IBMX). Además, ellos describen agarosa, se pudieron observar 2 ban-
que los antagonistas muscarínicos son capaces de aumentar de mane- 0 das con PM de 56 y 58KDa. La de
0
ra simultánea los niveles de ambos nucleótidos cíclicos, y estos auto-
res proponen que un miembro de la familia de PDEs que hidroliza a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Fracciones 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 58KDa fue identificada como una ban-
Fracciones
ambos nucleótidos cíclicos, pudiese ser la PDE responsable de este da de PDE-1A positiva usando anti-
efecto del antagonista muscarínico. Además, demostraron en el MLTB Figura 2. Efecto de la vinpocetina. Figura 3. Estimulación por Calmodulina. cuerpos específicos en ensayos de
intacto, que la vinpocetina, un inhibidor selectivo de las CaM-PDE-1s,
no asociado con la calmodulina (CaM), provoca una respuesta similar
Western Blot que están presentes en
al antagonista muscarínico (atropina), incrementando las concentracio- las fracciones de membranas plasmá-
nes de ambos nucleótidos cíclicos (AMPc, GMPc). Adicionalmente, es- ticas cruda obtenidas de la columna
hidrolizados/min./mg. de proteina
pmoles de GMPc[3H] hidrolizados/min./mg
ta PDE sensible a antagonista muscarínico se encontró que está aso- 60 250 de CaM-agarosa activada. Además, la
ciada a la fracción particulada del MLVA. Nosotros en este trabajo nos
enzima purificada (fracción CaM-
pmoles de GMPc [3H]
planteamos purificar e identificar a una CaM-PDE-1s sensible a vinpo- 50
200
cetina presente en las fracciones subcelulares de membranas plasmá- agarosa) mostraron un incremento en
40
ticas del MLTB. 150 la inhibición por vinpocetina y en la ac-
de proteínas
Metodología 30
tivación por la calmodulina.
100
1.-Preparación de las fracciones de membrana plasmática del 20
músculo liso traqueal de bovino. 50
La obtención de las fracciones subcelulares de MLTB fue descrita por 10
González de Alfonzo y col. (5) utilizando un amortiguador I que contie- 0 0
ne: (0,3M de sacarosa, 20mM de K-EGTA, 2mM de benzamidina, Basal Vinp Basal Vinp Basal Vinp Basal Vinp Basal Ca+2.CaM Basal Ca+2.CaM Basal Ca+2.CaM Basal Ca+2.CaM
0,25mM de PMSF, 0,5mM de DTT, 0,5mM de HEPES-KOH (pH 7.0). MPC EH Q-Sefarosa CaM-Agarosa MPC EH Q-Sefarosa CaM-Agarosa
Las fracciones subcelulares obtenidas fueron: E= extracto celular, M=
mitocondria, N= núcleo, P= microsomal, C=citosol, P1, P2= membra-
nas plasmáticas rica en receptores muscarínicos, y se les adicionó eti- La Figura 1a. El extracto hipotónico se colocó en una columna de Q-Sefarosa, equilibrada previamente con amortiguador 1 (20 mM Tris-HCl, 1 mM de imida-
lenglicol 30%, fueron congeladas con nitrógeno líquido y almacenadas zol, 1 mM de acetato de magnesio a pH 7) que contiene 0,1 mM EGTA y 5mM de DTT a 4 ºC y se lavó con 20 ml de amortiguador 1 + 50 mM NaCl, luego se
a –80ºC. eluyó con un gradiente lineal de NaCl (0,4-1M). El contenido de proteínas se determinó por el método de Lowry. Las fracciones con mayor contenido de pro- Referencias
2.- Determinación de la actividad de la fosfodiesterasa de los nu- 3
teínas fueron agrupadas (Fr3-FR11) y se determinó la actividad enzimática de la PDE ( H-GMP) sensible a la vinpocetina (20 M) y la estimulación por CaM
cleótidos cíclicos. (3g/ml). Figuras 2 y 3. Luego el pool de proteínas de la columna de Q-Sefarosa, fue transferido a la columna de afinidad CaM-agarosa (5mL) siguiendo el 1. Guerra de González L., González
La actividad de PDE fue determinada, usando [3H]GMPc como sustrato
protocolo descrito en la metodología Figura 1b y Figuras 2, 3. Muestra: membranas plasmática cruda (MPC) de las fracciones (P1/P2 y M1/M2), extracto hi- de Alfonzo R., Lippo de Bécemberg
(1). Las proteínas (50 a 100mg) fueron incubadas durante 30 min. a
30ºC con [3H]GMPc (0.1 mC) por ensayo en un amortiguador que con- potónico (EH) de las fracciones MPC, fracción de Q-Sepharose activa, fracción de la columna CaM-Agarosa activa. Estos datos son la media + SE de tres I., Alfonzo M.J. Cyclic nucleotide-
tiene: 0.3 mM GMPc, 40 mM de Tris-HCl pH 7.5, 10 mM de MgCl2 y 1 preparaciones diferentes de proteínas ensayadas por duplicado. dependent phosphodiesterase
unidad de 5’nucleotidasa. La reacción se detuvo agregando 10 mM de (PDE1) inhibition by muscarinic an-
EDTA, luego todo el medio de incubación se coloca en una columna de Figura 4. Identificación de una PDE-1A mediante inmunoblot. tagonists in bovine tracheal smooth
3
intercambio iónico AG-1-X8 formato. Los productos hidrolizados ([ H] muscle. Biochemical Pharmacology.
guanosina) fueron eluidos con una mezcla de etanol-agua (1:1). El a)
3
contenido de [ H] fue determinado usando un contador de líquido de
2004; 68:651-658.
centelleo.
3.-Purificación de una CaM-PDE-1 sensible a vinpocetina siguien- 2. Sharma, R. K., Das, S. B., Lakshmi-
do un procedimiento modificado (2). kuttyamma A., Selvakumar P., Shri-
Primera etapa. Extracción de la PDE-1 a partir de las fracciones de las vastav A. Regulation of calmodulin-
membranas plasmáticas (3). Las fracciones de membrana plasmática stimulated cyclic nucleotide phosp-
(P1/P2 y M1/M2), fueron resuspendidas en un amortiguador hipotónico
b) hodiesterase 1(PDE-1): Review. In-
(10mM HEPES., 0,1 mM EDTA, 1mM DTT, 0.25mM PMSF), y se reali-
zaron extracciones mediante centrifugación 150,000 x g por 5 min a ternational Journal of Molecular Me-
4ºC. Este procedimiento se realizó 6 veces y los sobrenadantes dicine. 2006; 18: 95-105.
(extracto hipotónico) obtenido fue utilizado para la purificación de la
PDE-1. 3. So Insuk, Yang, D. Ki, Kim, I. Five
Segunda etapa. Cromatografía Q-Sefarosa (2). La muestra (extracto subtypes of muscarinic receptors
hipotónico) fue trasferida a una columna de intercambio iónico Q- Las proteínas de membrana (50g) (fueron separadas sobre geles de SDS-PAGE al 10% de acuerdo
con el método descrito por Laemmli (Figura 4a). El patrón de peso molecular utilizado (28,3-132KDa).
are expressed in gastric smooth
Sefarosa, previamente equilibrada con un amortiguador 1 (20mM Tris-
HCl, 1mM imidazole, 1mM acetato de magnesio a pH 7 conteniendo Las muestras analizadas fueron: Carril 1: Membranas plasmáticas cruda (MPC) correspondientes a las muscle of guinea pig. Experimental
0.1mM EGTA y 5mM DTT) a 4ºC. Luego de colocar la muestra, se rea- fracciones (P1/P2 y M1/M2). Carril 2: Extracto hipotónico de las fracciones de MPC. Carril 3: Fracción de and Molecular Medicine. 2003; 35:
lizó un lavado con 20mL de amortiguador 1 conteniendo 50mM NaCl, Q-sefarosa activa. Carril 4: Fracción de la columna CaM-agarosa activada. La fracción de PDE-1 en es- 46-52.
posteriormente la muestra fue eluída con un gradiente lineal de NaCl tudio presenta unos pesos molecular es de 56 y 58 kDa. Lo cual fue corroborado al realizar un inmuno-
(0,4-1M). Las fracciones fueron colectadas y se determinó la concen- blot utilizando anticuerpo específico de PDE-1A con un PM relativo en los 58 KDa (Figura 4b). 4. Katsuki S, Murad F. Regulation of
tración de proteínas mediante el método de Lowry. Además, se deter- adenosine cyclic 3’,5’ monophosp-
minó la actividad de PDE (3H-GMP) sensible a vinpocetina y la activa-
hate and guanosine cyclic 3’,5’ mo-
ción por CAM.
Tabla 1. Purificación de una fosfodiesterasa de nucleótido cíclico dependiente de calmodulina de músculo nophosphate levels and contractility
Tercera etapa. Cromatografía de afinidad “CaM-Agarosa” (2).
Las fracciones con actividad de PDE sensible a vinpocetina fueron liso traqueal de bovino. in bovine tracheal smooth muscle.
transferidas a la columna “CaM-Agarosa” (5mL), la cual fue previamen- Mol Pharmacol 1977; 13: 330-41.
te lavada con 10mL de amortiguador 1 conteniendo Hidrocloruro de Muestras mg/mL Volumen total(mL) Proteínas totales(mg) Actividad específica Actividad total Purificación
Guanidina 2M, luego la columna fue equilibrada con 10mL de amorti- 5. González de Alfonzo, R., Lippo de
guador 1 conteniendo Ca+2 100M y 5mM de DTT. La columna fue eluí- Extracto crudo 10,2 900 9162 4,7 42.707,1 1,0 Becemberg, I., Alfonzo, M. J. A
da con 20mL de Buffer 1 conteniendo 2mM de EGTA y 5mM DTT, obte-
Membrana plasmática 7,0 50 350 7,4 2.604,4 1,5 Ca2+/CaM protein kinase associated
niendo fracciones de 1mL. Se determinó la concentración de proteínas 2+
mediante el método de Lowry, además se determinó la actividad de with Ca transport in sarco (endo)
PDE (3H-GMP) sensible a vinpocetina y la activación por CAM. Extracto hipotónico 0,18 900 161 8,1 1.304,7 1,7 plasmic vesicles from tracheal smo-
4.-Western blotting. Las proteínas fueron separadas sobre geles de oth muscle. Life science. 1996; 58:
Q-Sefarosa 5,2 1,8 9,3 72,1 669,8 15,3
PAGE-SDS al 10% y luego transferidas a una membrana de nitrocelu- 1403-1412.
losa a fin de identificar la proteína utilizando anticuerpos específicos CaM-Agarosa 1,0 0,5 0,5 152,1 76,1 32,4
mediante inmunoblot.