1. PRÁCTICA N° 3
Microscopía
I. INTRODUCCIÓN.
El Microscopio óptico es una herramienta de suma importancia en el laboratorio de
Bioecología, a través del cual se pude obtener imágenes dimensionales del objeto
observado al ser atravesado por la luz mirando a través de los oculares. De un lado el
microscopio provee aumento y permite ver detalles de objetos tan pequeños que no
son visibles a simple vista (menor de 0,1 mm).8
Existe una gran variedad de microscopios que, según la fuente de iluminación
utilizada, se agrupan en:
Microscopios ópticos9
: La fuente de iluminación es la luz.
a. De campo claro. Permiten la observación de preparaciones en sus colores
naturales o contrastados mediante tinciones, resaltadas sobre un fondo más
brillante.
b. De campo oscuro. Permiten la observación de formas celulares que destacan
brillantes sobre un fondo oscuro. Este efecto se consigue utilizando diafragmas
especiales.
c. De contraste de fases. Gracias a la utilización de diafragmas y objetivos especiales,
que consiguen aumentar las diferencias en el índice de refracción de las células y
el medio que las rodea, permiten la observación de células vivas, ya que no es
necesario realizar ninguna tinción de las mismas.
d. De interferencia. Permiten observar células vivas sin teñir, obteniéndose una
imagen en relieve de las mismas.
e. De fluorescencia. La fuente de iluminación proporciona luz ultravioleta que
excita ciertas moléculas presentes en las células (bien de forma natural o añadida
a la preparación) que emiten fluorescencia en el espectro visible.
Microscopios electrónicos10
: La fuente de iluminación es un chorro de electrones y
las lentes son electroimanes.
a. De transmisión. Permiten la observación de muestras teñidas con sustancias que
son resistentes al paso de electrones y cortadas dando lugar a láminas finas,
denominadas cortes finos. Los electrones no son visibles directamente por lo que
éstos se envían a una pantalla que emite fluorescencia más o menos intensa
según el número de electrones que inciden en ella. Las estructuras celulares que
se tiñan más intensamente impedirán el paso de electrones y por lo tanto no
permitirán la emisión de fluorescencia, por lo que estas estructuras aparecerán
oscuras en un fondo más brillante. Se consiguen entre 10 000 y 100 000 aumentos.
b. De barrido. Permiten la observación de células enteras, sin necesidad de cortes
finos, de modo que aparecen los relieves originales y las superficies externas.
Alcanzan entre 1 000 y 10 000 aumentos.
Durante las prácticas se empleará el microscopio óptico de campo claro, cuyos
componentes fundamentales (mecánicos, de iluminación y ópticos). La capacidad de
un microscopio para observar diferentes estructuras se refleja en el número de
aumentos y en el límite de resolución (LR).

2. El número de aumentos de un microscopio resulta de multiplicar los aumentos que
proporciona cada una de las lentes presentes entre la fuente de iluminación y el ojo.
El límite de resolución (LR) se define como la distancia mínima a la que se deben
encontrar dos puntos para que puedan observarse como distintos. El microscopio es
mejor cuanto menor sea el LR del mismo. El LR viene definido por la fórmula:
AN (Apertura numérica) = n. sen α; λ = Longitud de onda de la luz utilizada
Donde: n es el índice de refracción del medio y α es la mitad del ángulo de apertura
El Microscopio consta de las siguientes partes en su estructura:
A. Sistema Mecánico:
Pie o Base
Brazo o columna
Tubo óptico
Revolver
Platina
Tornillos Macro y Micrométrico
B. Sistema Óptico:
Lentes convergentes que incluyen oculares y objetivos
C. Sistema de Iluminación:
Espejo o lámpara de iluminación
Condensador
Diafragma y Portafiltro.
En el desarrollo de las prácticas serán usados 2 tipos de microscopios:
1. El microscopio estereoscópico, el cual es binocular, con aumentos de 4 a 40 veces.
Permite observar muestras opacas y realizar disecciones de estructuras en organismos
pequeños, ya que en él puede manipularse la muestra mientras se observa.
Proporciona una imagen tridimensional.
2. El microscopio compuesto, que puede ser monocular o binocular. Permite obtener
aumentos de 100 a 1500 veces. Los objetos a observar deben ser muy pequeños o
cortados en láminas tan delgadas que la luz pueda atravesarlos. Estos se colocan en
láminas de vidrio especiales denominadas porta-objetos y cubre-objetos. Las imágenes
que se obtienen son bidimensionales e invertidas.
II. OBJETIVOS.
2.1. Identificar las partes de un microscopio óptico
2.2. Explicar cómo se forman imágenes en el microscopio óptico.
2.3. Ejecutar correctamente preparaciones en fresco y en seco definiendo el uso de
los diferentes objetivos según el caso.

3. III. MATERIAL Y PROCEDIMIENTOS:
3.1. Materiales y equipos
3.1.1. Materiales:
1. Biológico:
Cabellos (2 unidades)
Insecto o arácnido (1 unidad)
Orina (50 ml)
2. De vidrio:
2 tubos de ensayo 13x100
10 láminas portaobjetos
10 láminas cubreobjetos
1 placa petri
1 pipeta pasteur con chupón de goma
3. Reactivos y colorantes:
Agua destilada (300 ml)
Azul de metileno (20 ml)
Aceite de inmersión (5 ml) – Nocivo/Peligroso para el ambiente
3.1.2. Equipos, instrumentos y otros:
1 Microscopio
1 Estereoscopio
1 centrífuga
1 Gradilla
1 hoja de papel
1 regla transparente (15cm)
5 hisopos
2 Estiletes
Papel milimetrado (10x10 cm)
3.2. Procedimientos.
3.2.1. Recomendaciones para el uso y mantenimiento del Microscopio.
Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y
bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogió
correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas
condiciones.
Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas
metálicas.
Comenzar la observación con el objetivo de menor aumento: 4x o
5x (ya está en posición) o colocar el de 10x si la preparación es de
bacterias.
Para realizar el enfoque:
Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación,
empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse
mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre
el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose
dañar alguno de ellos o ambos.
Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando
lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico
y, cuando se observe la muestra, algo nítida, girar el
micrométrico hasta obtener un enfoque fino.
Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi
enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico
para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por

4. completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo
anterior y repetir la operación de enfoque inicial. El objetivo de 40x
enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil
que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si
se descuidan las precauciones anteriores o mancharlo con aceite
de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el
objetivo de inmersión.
Empleo del objetivo de inmersión:
Bajar totalmente la platina.
Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo
de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde
habrá que echar el aceite.
Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a
medio camino entre éste y el de 40x.
Colocar una gota de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.
Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del
objetivo de inmersión.
Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente
hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se
nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.
Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de
trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es
mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de
accidente es muy grande.
Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la
preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre
esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea
enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la
operación desde el enfoque inicial.
Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la
platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el
revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación
de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión
en posición de observación.
Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando una
solución limpiadora y un papel especial para óptica.
Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente
limpio.
3.2.2. Mantenimiento del microscopio y precauciones
Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo
cubierto con su funda para evitar que se ensucien y dañen las
lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en
su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo.
Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor
aumento en posición de observación, asegurarse de que la parte
mecánica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo
cubierto con su funda.
Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian,
limpiarlas muy suavemente con un papel para lentes.
No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está
utilizando el microscopio.

5. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el
aceite que queda en el objetivo. Si el aceite ha llegado a secarse y
pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de
alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de
limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden
dañar las lentes y su sujeción.
No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio
(macrométrico, micrométrico, platina, revólver y condensador).
El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo
siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente
con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el
tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del
ocular.
Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama
sobre ella algún líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de
aceite, limpiarla con un paño humedecido en alcohol.
Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al
finalizar la sesión práctica.
3.2.3. Identificación de las partes del microscopio.
Coloca el nombre de cada parte del microscopio en el gráfico:

6. 1. ...................................................................
2. ..................................................................
3. ..................................................................
4. ..................................................................
5. ..................................................................
6. ..................................................................
7. ..................................................................
8. ..................................................................
9. ..................................................................
10...................................................................
11...................................................................
12...................................................................
13...................................................................
14...................................................................

7. 3.2.4. Variación de la superficie del campo visual.
Recortar un pedacito de papel milimetrado de 1 cm2
y colocarlo
sobre un portaobjeto.
Agregar una gota de agua y luego colocar un cubreobjeto.
Enfocar el preparado con el objetivo de menor aumento y
viendo las marcas milimétricas determina el diámetro del
campo visual.
Sabiendo que la superficie del círculo del campo visual (S) es
igual a πr2
, donde π = 3,14 y r = ½ d, calcula el valor de esta
superficie para el objetivo de menor aumento.
Ahora enfocar con el objetivo 10x y siguiendo el procedimiento
anterior, calcular para este objetivo, la superficie del círculo del
campo visual.
Sabiendo que el diámetro del campo visual es inversamente
proporcional al poder de aumento de los objetivos, se puede
determinar el diámetro correspondiente al objetivo de mayor
aumento mediante la siguiente fórmula:






=





1
2
2
1
D
D
A
A
; donde
A1 = Número de aumento del objetivo de menor aumento.
A2 = Número de aumento del objetivo de mayor aumento.
D1 = Diámetro del campo observado con menor aumento.
D2 = Diámetro del campo observado con mayor aumento.
Calcular el diámetro y la superficie del círculo del campo visual
para el objetivo de mayor aumento del microscopio.
Comparar este valor obtenido con los anteriores
Dibujar las observaciones y explica.
3.2.5. Profundidad del Campo Visual.
Preparar un montaje húmedo de dos cabellos, dispuestos uno
sobre otro (en forma de cruz).
Visualizando con el objetivo de menor aumento, ubicar el
portaobjeto de manera que el cruzamiento de los cabellos quede
en el centro el campo.
Ahora visualizar a 400x
¿Ambos cabellos tienen el mismo plano focal (nivel de enfoque)?
Fundamente su respuesta.
Observar a 50x y dibujar.
3.2.6. Preparados microscópicos en fresco.
En un tubo de ensayo 13x100 colocar orina (unos 2/3 de su
capacidad) y centrifugar a 3000 rpm por 5 minutos.
Descartar el sobrenadante y agitar vigorosamente el sedimento
con lo que queda de líquido en el fondo del tubo.
Con una pipeta pasteur tomar el homogeneizado y en una
lámina portaobjetos colocar una gota de la muestra
Poner encima una lámina cubreobjeto.

8. Observar con los objetivos 4x, 10x y 40x. NO USAR EL OBJETIVO
DE INMERSIÓN.
Esquematizar lo observado a 400x en una circunferencia de 10
cm de diámetro, tratando de que exista proporción entre lo visto
y lo esquematizado.
3.2.7. Observación tridimensional en el estereoscopio.
Colocar sobre la base de una placa petri, un insecto y observar
sus estructuras.
Graficar lo observado.
3.3. Manejo de Residuos.
El material de vidrio con las muestras procesadas deberá lavarse con
abundante agua y detergente, enjuagándolos luego con agua destilada.
Los residuos líquidos no tóxicos se eliminarán directamente hacia el
alcantarillado, inclusive la muestra de orina.
Los insectos pueden desecharse directamente en el recipiente de residuos
del laboratorio.
IV. RESULTADOS (FUNDAMENTACIÓN).

9. V. CUESTIONARIO.
1. ¿Cuántos tipos de Microscopía óptica y electrónica se utilizan en trabajos de
investigación de Biología Celular y Molecular?
2. ¿Cuál es el fundamento de las siguientes técnicas de Biología Celular y
Molecular: Citometría de flujo, Hibridación fluorescente in situ, Citoquímica,
Radioautografía, Hibridación de ADN, Reacción en cadena de la Polimerasa?

11. VI. CONCLUSIONES.
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
VIII. EVALUACIÓN.
EQUIPO
DE
TRABAJO
Estudio y
revisión
previa del
protocolo
Puntualidad
y asistencia
Orden en
trabajo de
laboratorio
Manejo de
materiales,
reactivos y
equipos
Presentación
y redacción
de informes
Puntaje
4 3 2 0 2 1 3 2 1 7 5 3 1 4 3 2 1 0