Funcionalidad del TAB envejecimiento y restricción

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
Departamento de Química Orgánica, Inorgánica y Bioquímica.
ESTUDIO DE LA FUNCIONALIDAD METABÓLICA
DEL TEJIDO ADIPOSO BLANCO EN RATA
WISTAR. EFECTOS DEL ENVEJECIMIENTO, LA
RESTRICCIÓN CALÓRICA Y EL TRATAMIENTO
ICV CON LEPTINA.
Alejandro Fernández Briones.
Junio, 2013
Tutores: Dr. Antonio Andrés Hueva.
Dra. Nilda Gallardo Alpizar.

AGRADECIMIENTOS.
Esta tesis va dedicada a todas aquellas personas que la han hecho posible, esta
es la única parte de la tesis donde me puedo tomar la licencia de no ser políticamente
correcto, aunque intenteré serlo en la medida de lo posible.
En primer lugar, quiero agradecer a mis directores de tesis, la Dra. Nilda
Gallardo y el Dr. Antonio Andrés, su empeño y esfuerzo en que este trabajo salga hacia
delante. Siempre los recordaré con cariño, por la confianza que ambos han depositado
en mi persona durante todo éste tiempo y por la cantidad de cosas que he aprendido
de ellos. No solo del trabajo, también de la vida.
Como no, a mis compañeros del laboratorio, a los cuales aprecio, y a los que
siempre recordaré con cariño.
A mis amigos, con los que he compartido tantas y tantas cosas que no podría
quedarme con ninguna en concreto. Sé que siempre estarán ahí para lo bueno y para
lo malo.
A mi familia, ya que durante el transcurso de estos años, han sucedido
demasiados acontecimientos negativos, como la perdida de varios familiares muy
cercanos a los que echo mucho de menos, un accidente de coche en el que casi pierdo
la vida, además de un sinfín de adversidades que no habría podido superar de no
haber tenido el apoyo incondicional por parte de mi familia en especial de mi padre
por ser capaz de templarme los nervios en los momentos difíciles, y de mi madre que
contra todo pronóstico consiguió hacer de mi un hombre de provecho.
Quiero hacer una mención especial a mi hermano, la persona con la que más
tiempo he pasado en mi vida, con el que siempre discuto hasta el punto de mandarnos
a la mierda casi a diario, pero al que siempre echo en falta cuando necesito
desahogarme, y sé que siempre estará ahí para lo que necesite.
Como no quiero extenderme mucho más, simplemente gracias a todos.

INDICE DE CONTENIDOS
1-INTRODUCCIÓN....................................................................................... 1
1.1- Adiposidad, resistencia a la insulina y Diabetes tipo 2...................... 1
1.2- El tejido adiposo.............................................................................. 3
1.2.1- El tejido adiposo blanco. ............................................................ 4
1.3- Fisiología del tejido adiposo............................................................. 5
1.3.1- Esterificación de ácidos grasos en el tejido adiposo................... 5
1.3.2- La Gota Lipídica.......................................................................... 7
1.3.3- Lipólisis....................................................................................... 8
1.4- El tejido adiposo como órgano endocrino...................................... 12
1.4.1- Factor de necrosis tumoral α (TNFα)........................................ 14
1.4.2- IL-6........................................................................................... 15
1.4.3- PPARγ....................................................................................... 16
1.4.4- Resistina................................................................................... 17
1.4.5- Adiponectina............................................................................ 18
1.4.6- Leptina. .................................................................................... 19
1.4.7- Transmisión de la señal de leptina. .......................................... 21
1.4.8- Secreción de leptina por el TAB................................................ 23
1.5- Insulina........................................................................................... 24
1.5.1- Transmisión de la señal de la insulina. ..................................... 24
1.6- Interacción leptina-insulina............................................................ 25
1.7- Control hipotalámico de la homeostasis de la glucosa y de la
sensibilidad a la insulina..................................................................... 26
1.8- El envejecimiento. Deterioro del organismo, y pérdida de
funcionalidad. .................................................................................... 27
1.9- Restricción calórica. Efectos beneficiosos de la dieta..................... 29

1.10- Hipótesis y objetivos. ................................................................... 31
2- MATERIALES Y MÉTODOS..................................................................... 33
2.1- Materiales...................................................................................... 33
2.2- Modelos de experimentación......................................................... 33
2.2.1- Modelo animal de envejecimiento........................................... 33
2.2.2- Modelo animal de restricción calórica...................................... 34
2.3- Test in vivo de sobrecarga oral de lípidos....................................... 35
2.4- Ensayo Ayuno-Alimentación........................................................... 35
2.5- Ensayo de Liposisis......................................................................... 36
2.5.1- Estudio de la lipolisis. Tratamiento con ISO e INS..................... 36
2.6- Modelo animal para el tratamiento intracerebroventricular
(ICV) con Leptina................................................................................... 37
2.6.1- Test de tolerancia a la glucosa intraperitoneal......................... 40
2.6.2- Tratamiento “in vivo” con insulina. .......................................... 40
2.6.3- Denervación del tejido adiposo................................................ 40
2.6.4- Ensayo ex vivo de captura de glucosa (2DOG).......................... 41
2.7- Determinación de Metabolitos y Hormonas en suero.................... 42
2.8- Extracción de ARN.......................................................................... 42
2.9- Transcripción inversa. .................................................................... 43
2.10- Real-time PCR............................................................................... 44
2.11- Fraccionamiento subcelular del tejido adiposo blanco.
Obtención de extracto total, membrana plasmática,
membrana interna, gota lipídica y citosol. ......................................... 45
2.11.1- Extracto total y fracciones subcelulares. ................................ 45
2.11.2- Gota lipídica. .......................................................................... 45
2.12- Determinación de la concentración de proteínas......................... 48
2.12.1- Mediante el método Bradford................................................ 48

2.12.2- Mediante el método Lowri..................................................... 48
2.13- Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGC-SDS),
e Inmuno detección de proteínas mediante Western Blot................. 48
2.14- Caracterización de fracciones subcelulares.................................. 49
2.15- Tratamiento de datos y procesamiento estadístico...................... 52
3- RESULTADOS........................................................................................ 53
3.1- Ensayo de sobrecarga oral de grasas.............................................. 54
3.2.- Ensayo ayuno-realimentación....................................................... 59
3.2.1-Lipolisis ex vivo. Efecto del envejecimiento y la
restricción calórica.......................................................................... 60
3.2.2- Estudio de la lipolisis del tejido adiposo visceral.
Efectos del isoproterenol y la insulina............................................. 67
3.2.3- Estudio del estado de activación de la enzima HSL
en tejido adiposo. Efectos de isoproterenol y la insulina. ............... 70
3.2.4- Efectos del isoproterenol y la insulina sobre los
niveles proteicos de ATGL, AQ7 y perilipina en los explantes
de tejido adiposo. ........................................................................... 71
3.2.5- Estudio del estado de activación de la enzima AMPK
en tejido adiposo. Efectos del envejecimiento y la restricción
nutricional. Efectos de isoproterenol y la insulina........................... 72
3.2.6- Estudio de los cambios en la localización subcelular
de proteínas durante la lipolisis. Efectos del envejecimiento y la
restricción calórica.......................................................................... 75
3.2.7- Estudio de la vía lipogénica. Capacidad de síntesis de
novo de ácidos grasos y de captura de lípidos por el tejido
adiposo para la síntesis de TAG....................................................... 83
3.3- Efectos de la infusión ICV de leptina en el metabolismo

del tejido adiposo blanco en ratas de 3 meses de edad. Papel
del SNA en la transmisión de la señal de la leptina............................. 89
3.3.1- La leptina a través del SNA regula la funcionalidad
del TAB y la sensibilidad a la insulina. Resultados del test
de tolerancia a glucosa.................................................................... 90
3.3.2- Resultados de los ensayos de captura de glucosa
en respuesta a insulina por el TAB. ................................................. 91
3.3.3- Regulación de la expresión génica en el TAB por el SNA. ......... 93
3.3.4- Modificación de la capacidad lipogénica del tejido
adiposo blanco por la leptina a través del SNA............................... 94
3.3.5- Incremento del tono simpático y de la capacidad
lipolítica del tejido adiposo blanco por la leptina............................ 96
4- DISCUSIÓN ........................................................................................... 99
5- CONCLUSIONES.................................................................................. 117
6- BIBLIOGRAFÏA..................................................................................... 121

INDICE DE TABLAS.
Tablas de la Introducción.
Tabla 1. Algunos ejemplos de receptores que se expresan en el TAB. ..... 13
Tabla 2. Algunos ejemplos de proteínas derivadas de adipocitos con
funciones endocrinas / paracrinas / autocrinas .................................... 14
Tablas de Materiales y Metodos.
Tabla 3. Sondas utilizadas de los genes sometidos a estudio. .................. 45
Tabla 4. Anticuerpos utilizados en el estudio........................................... 51
Tablas de Resultados.
Capitulo 1: Estudio de los cambios en la funcionalidad metabólica del
tejido adiposo blanco durante el envejecimiento.
Tabla 5. Características biológicas de los animales................................... 53
Tabla 6. Área bajo la curva....................................................................... 57
Tabla 7. Niveles de mRNA de la enzima LPL y de la proteína
relacionada con el receptor de LDL (LPR-1) en tejido adiposo
de animales de 3, 8 y 24 meses de edad. .............................................. 58
Tabla 8. Niveles de Glicerol, NEFA y TAG en suero................................... 59

Capitulo 2: Demostración del papel del SNA en la funcionalidad del tejido
adiposo blanco. Efectos de la administración ICV de leptina.
Tabla 9. Niveles de leptina en suero tras el tratamiento icv con leptina. . 90
Tabla 10. Estudio de expresión de genes relacionados con
el tono simpático del tejido adiposo. .................................................... 94
Tabla 11. Estudio de expresión de genes relacionados con la
síntesis de glicerol-3p y de TAG en el tejido adiposo............................. 94

INDICE DE FIGURAS.
Figuras de la introducción.
Figura 1. Estructura del Isoproterenol...................................................... 10
Figura 2. Metabolismo lipídico en los adipocitos...................................... 11
Figura 3. Señalización de leptina.............................................................. 22
Figura 4. Esquema del mecanismo de transmisión de la señal
de la insulina . ....................................................................................... 25
Figuras de materiales y métodos.
Figura 5. Ratas albinas Wistar de 3 y 24 meses de edad
alimentadas ad libitum.......................................................................... 34
Figura 6. Modelo experimental utilizado en este trabajo......................... 36
Figura 7. Esquema de la distribución de las muestras en la placa. ........... 37
Figura 8. Representación esquemática de la implantación de las
minibombas osmóticas. ........................................................................ 39
Figura 9. Coordenadas del ventrículo lateral en el estereotáxico.
VL – ventrículo lateral. .......................................................................... 39
Figura 10. Imagen de la denervación quirúrgica....................................... 41
Figura 11. Representación esquemática del protocolo de
centrifugación diferencial utilizada para aislar las distintas
fracciones de membrana, la gota lipídica y el citoplasma
celular a partir del TAB.......................................................................... 47
Figura 12. Western-blot representativo de la presencia de marcadores
en fracciones subcelulares de tejido adiposo blanco epididimal. .......... 50

Figura 13. Western-blot representativo de la presencia de
marcadores en fracciones subcelulares de cada condición
de tejido adiposo blanco epididimal...................................................... 50
Figuras de Resultados.
Capitulo 1: Estudio de los cambios en la funcionalidad metabólica del
tejido adiposo blanco durante el envejecimiento.
Figura 14. Variaciones en el tiempo de los niveles circulantes de
TAG, NEFA, glucosa e insulina de animales de 8 meses de edad
alimentados ad libitum, respecto a los de 3 meses de edad,
tras una sobrecarga oral de grasa. ........................................................ 54
Figura 15. Variaciones en el tiempo de los niveles circulantes de
TAG, NEFA, glucosa e insulina de animales de 24 meses de edad
alimentados ad libitum, respecto a los de 3 meses de edad,
tras una sobrecarga oral de grasa. ........................................................ 55
Figura 16. Área bajo la curva.................................................................... 56
Figura 17. Medida de la liberación de NEFA y glicerol al medio
de incubación........................................................................................ 61
Figura 18. Medida de la expresión génica de las hormonas HSL
y ATGL y del transportador de glicerol AQ7 en condición basal. ........... 63
Figura 19. Niveles totales de proteína de AQ7, ATGL y Perilipina
en extracto total de tejido adiposo visceral........................................... 65
Figura 20. Niveles totales de proteína y de las especies fosforiladas
de la enzima HSL en extracto total de tejido adiposo visceral............... 66

Figura 21. Medidas de glicerol en los medios de los explantes
en estado basal. .................................................................................... 68
Figura 22. Medidas de lactato en los medios de los explantes
en estado basal. .................................................................................... 69
Figura 23. Representación de los cambios en la activación de
la enzima HSL . ...................................................................................... 70
Figura 24. Niveles de AQ7, ATGL y Perilipina en extracto total
de los explantes. ................................................................................... 72
Figura 25. Niveles basales de expresión proteica de las especies
fosforiladas y de la masa de AMPK........................................................ 73
Figura 26. Representación de los cambios en la activación de la
enzima AMPK........................................................................................ 74
Figura 27A. Traslocación de la ATGL......................................................... 76
Figura 27B. Niveles de expresión proteica de ATGL en condición basal. .. 76
Figura 28A. Traslocación de la HSL........................................................... 77
Figura 28B. Niveles de expresión proteica de HSL en condición basal...... 78
Figura 29A. Traslocación de la P-565-HSL................................................. 79
Figura 29B. Niveles de expresión proteica de la especie fosforilada
inactiva de HSL en condición basal........................................................ 79
Figura 30A. Traslocación de la Perilipina.................................................. 80
Figura 30B. Niveles de expresión proteica de Perilipina en
condición basal. .................................................................................... 81
Figura 31A. Traslocación de la Acuoporina 7............................................ 82
Figura 31B. Niveles de expresión proteica en membrana plasmática
y membrana interna de AQ7 en condición basal................................... 82
Figura 32. Niveles basales de mRNA de CHERBP y PPARγ......................... 83

Figura 33. Niveles basales de mRNA de ACC y FAS en tejido
adiposo visceral..................................................................................... 84
Figura 34. Niveles proteicos de la enzima ACC y de la forma
fosforilada en serina, p-ACC en tejido adiposo visceral. ........................ 85
Figura 35. Niveles basales de mRNA de CD36, Glut4, LPL y LRP-1. ........... 86
Figura 36. Niveles expresión génica y proteica LPL en condición basal. ... 88
Capitulo 2: Demostración del papel del SNA en la funcionalidad del tejido
adiposo blanco. Efectos de la administración ICV de leptina.
Figura 37. Se muestran los resultados de un western-blot
representativo de STAT3....................................................................... 90
Figura 38. Resultados del test de tolerancia a glucosa intraperitoneal..... 91
Figura 39. Efectos de la leptina sobre la capacidad lipogénica
del tejido adiposo.................................................................................. 92
Figura 40. Cambios en el peso de TAP y de los niveles de
norepinefrina con la denervación.......................................................... 93
Figura 41. Niveles proteicos de LPL en extracto total tras
el tratamiento ICV con leptina............................................................... 95
Figura 42. Niveles de expresión génica y proteica de ATGL
tras el tratamiento ICV con leptina........................................................ 96
Figura 43. Niveles proteicos de HSL en extracto total de tejido
adiposo tras el tratamiento ICV con leptina. ......................................... 97

Abreviaturas.
AC Adenilato ciclasa.
ACS Acil-CoA sintasa.
ACC Acetil-CoA carboxilasa.
ACTH Hormona corticotrófica.
AG Ácidos grasos.
AGL Ácidos grasos libres.
AGPR Proteína relacionada con agouti.
AKT RAC-beta serine/threonine-protein kinase.
AL Ad-libitum.
AMPc Adenosinmonofosfato cíclico.
AMPK Proteína quinasa activada por monofosfato de adenina.
Apo CII Apolipoproteína CII.
aP2 Proteína activadora 2.
AQ7 Acuoporina 7.
AR Receptor adrenérgico.
ARC Nucleo arcuato del hipotálamo.
ATGL Triglicérido lipasa.
AUC Área bajo la curva.
BSA Albumina de suero bobina.
CART Transcrito regulado por cocaína.
CD36 Proteína de diferenciación 36.
ChREBP Carbohydrate-reponse-element-binding.
CREB Factor de transcripción de la proteína de respuesta a AMPc .
CYT Citoplasma celular.
DNA Ácido desoxirribonucleico.

DNAc Ácido desoxirribonucleico complementario
DNL Lipogénesis de novo.
DTT Dithiothreitol.
EDTA Ácido etilendiaminotetraacético.
EGTA Ácido etilenglicol (aminoetil éter) tetraacético.
FAS Sintetasa de ácidos grasos.
FIRKO Fat-specific insulin receptor knockout mice.
FR Restricción calórica.
GH Hormona de crecimiento.
Gi Proteína G inhibitoria.
GL Gota lipídica.
GLUT1 Transportador de glucosa 1.
GLUT4 Transportador de glucosa 4.
GPDH Glicerol 3 fosfato deshidrogenasa.
Gs Proteína G estimulatoria.
G3P Glicerol 3 fosfato.
HDL Lipoproteínas de alta densidad.
HOMA Indicador de control de la homeostasis de la glucosa.
HSL Lipasa hormona sensible.
ICV Intra cerebro ventricular.
IGF-1 Factor de crecimiento de insulina-1.
IL-6 Interleuquiina 6.
INS Insulina.
IR Receptor de la insulina.
IRS Substrato del receptor de insulina.
ISO Isoproterenol.

JAK2 Tirosina-quinasas de la familia Janus.
KRH Krebs-Ringer-Hepes.
KRP Krebs-Ringer-fosfato.
LCR Líquido cefaloraquideo.
LDL Lipoproteínas de baja densidad.
LPL Lipasa lipoproteína.
LPR-1 LDL receptor protein related-1.
MAG Mono acil-gliceridos.
MGL Monoglicérido lipasa.
MI Membrana interna.
MP Membrana plasmática.
MSH Hormona melanocito estimulante.
mRNA Ácido ribonucléico mensajero.
mTOR Diana de rapamicina.
NA Noradrenalina.
NaN3 Azida sódica.
NE Norepinefrina.
NEFA Ácidos grasos libres.
NPY Neuropeptido Y.
NTC Membranas de nitrocelulosa.
P Perilipina.
PBS Buffer Fosfato Salino.
PCR Reacción en cadena de la polimerasa.
PDE Fosfodiesterasa.
PDHc Complejo de la piruvato deshidrogenasa.
PD3B Fosfodiesterasa 3B.

PEPCK Fosfoenol-piruvato-carboxi-quinasa.
PGC-1α Coactivador de la transcripción 1α.
PI3K Fosfoinositol-3- kinasa.
PKA Proteína quinasa A.
PMSF Fenil-metil-sulfonil-fluoruro.
POMC Pro-opiomelacortina.
PPARγ Activador de la proliferación peroxisomal γ.
PTP1B Fosfotirosina fosfatasa 1B.
PVN Núcleo paraventricular del hipotálamo.
QM Quilomicrones.
RNA Ácido ribonucléico.
rpm Revoluciones por minuto.
RT Transcriptara reversa.
SDS Dodecilsulfato sódico.
SEM Desviación estándar de la media.
Ser Serina.
SNA Sistema nervioso autónomo.
SNC Sistema nervioso central.
SNS Sistema nervioso simpatico.
SIRT1 Sirtuinas.
SOCS-3 Supresor de la señalización por citoquinas.
SOG Sobrecarga oral de grasas.
SREBP-1c Proteína de unión al elemento de respuesta a los esteroles 1c.
STAT3 El transductor de señal y activador de la transcripción 3.
S6K Proteína ribosomal S6 quinasa.
TAB Tejido adiposo blanco.

TAE Tejido adiposo epididimal.
TAG Triacilgliceridos.
TAM Tejido adiposo marrón.
TAP Tejido adiposo perirrenal.
TG-LP Triglicéridos provenientes de los lípidos.
TG-QM Triglicéridos provenientes de los quilomicrones.
TAG-VLDL Triglicéridos provenientes de los lípidos de muy baja densidad.
Thr Treonina.
TNFα Factor de necrosis tumoral.
TSH Hormona estimulante de la tiroides.
Tyr Tirosina.
Tween 20 Monooleato de Polioxietileno Sorbitan.
TZDs Tiazolidinedionas.
T2DM Diabetes mellitus tipo 2.
UI Unidades internacionales.
VMH Región del hipotálamo ventromedial.
VL Ventrículo lateral.
VLDL Lipoproteínas de muy baja densidad.
2DOG 3
H-2-desoxiglucosa

Introducción
1
1-INTRODUCCIÓN.
Estado de la cuestión.
1.1- Adiposidad, resistencia a la insulina y Diabetes tipo 2.
La masa del tejido adiposo está regulada por un equilibrio dinámico entre la
ingesta diaria y el gasto energético. La ruptura de este balance conlleva obesidad, una
enfermedad multifactorial que involucra un incremento en la masa del tejido adiposo.
Factores como la urbanización y la dieta desequilibrada, asociado con la
susceptibilidad genética han permitido que emerja el fenotipo obeso.
Además de los problemas físicos derivados del exceso de peso, la obesidad se
asocia con frecuencia a otras enfermedades crónicas y trastornos metabólicos como la
diabetes tipo 2, hipertensión arterial, dislipemias, enfermedades cardiovasculares,
resistencia a insulina y otras alteraciones que contribuyen al desarrollo de la
morbilidad. La Organización Mundial de la Salud considera que la prevalencia del
sobrepeso y de la obesidad ha alcanzado en muchas regiones proporciones epidémicas
((Wild y col., 2004).
La diabetes mellitus es la enfermedad endocrina más común y es una de las
causas principales de mortalidad en las sociedades desarrolladas. Esta enfermedad
puede ser de 2 tipos, en función de su origen.
La diabetes tipo I representa menos del 10 % de los casos y, generalmente, se
diagnostíca en la infancia. Se caracteriza por elevados niveles de glucosa en sangre
debido a que el organismo no produce o produce poca insulina. En estos casos se
necesitan inyecciones diarias de insulina para sobrevivir.
La diabetes tipo II corresponde aproximadamente al 90% de todos los casos de
diabetes y, generalmente, se presenta en la edad adulta. Es una condición patológica
en la que existe resistencia a la acción de la insulina, con lo cual el metabolismo de
carbohidratos y lípidos no es regulado de manera adecuada por dicha hormona. Esta
patología se caracteriza por hiperglucemia, hiperlipidemia e hipoinsulinemia. En estas
condiciones, el organismo llega a necesitar del aporte de grandes cantidades de
insulina exógena (Saltiel AR, 2001).

Introducción
2
La diabetes tipo II es una enfermedad multifactorial con raíces poligénicas, así
como de naturaleza ambiental, ya que influye de forma importante, la dieta y una vida
sedentaria (Fujimoto WY, 2000). Sin embargo, desde hace décadas, existe un consenso
general en cuanto a la aparición de la Diabetes tipo II, la cual se debe al desarrollo
previo de resistencia a la insulina, que es un estado fisiológico en el que los tejidos
diana de esta hormona presentan una respuesta disminuida ante un estímulo
insulínico normal (Kahn CR, 1978).
Entre los mecanismos responsables de la resistencia a la insulina se han
descrito alteraciones de la expresión génica, de la distribución subcelular y del estado
de fosforilación de diferentes proteínas de la vía de transducción de señales de la
insulina, como por ejemplo: los sustratos del receptor de insulina, la PI3K (Saltiel AR,
2001), la AKT o el GLUT4 (Shepherd PR y col., 1999). Sin embargo, la obesidad es el
principal factor adquirido responsable de la disminución de la sensibilidad a la insulina
(Lewis G y col., 2002).
En este contexto, el tejido adiposo es reconocido actualmente como un tejido
clave en el desarrollo de la resistencia global a la insulina (Arner, 2003; Bays y col,
2008). Además de su función como depósito de energía y principal proveedor de
ácidos grasos para su utilización por otros tejidos, el tejido adiposo es un importante
órgano endocrino, liberando a la circulación péptidos semejantes a hormonas que
afectan al metabolismo sistémico y a la propia célula adiposa. Desde una perspectiva
“adipocéntrica” se postula que la expansión del tejido adiposo constituye un nexo
importante entre obesidad y resistencia a insulina (Virtue y Puig, 2010). En esta
dirección se ha propuesto que: un exceso del combustible energético almacenado que
sobrepasa la capacidad oxidativa/almacenamiento, sumado a la alteración de la
producción de citoquinas por los adipocitos y macrófagos residentes, más, el aumento
del estrés oxidativo y la inflamación crónica, entre otros, contribuiría a la
desregulación funcional del tejido adiposo (Medina-Gomez y col., 2007). En su
conjunto los aspectos mencionados convierten al tejido adiposo en un tejido clave en
el estudio de las bases moleculares de la resistencia a la insulina y la diabetes mellitus
tipo II.

Introducción
3
Se estima que la prevalencia de la diabetes a nivel mundial será del 4.4% en el
año 2030, de modo que la epidemia de la diabetes continuará y para 2030 habrá en el
mundo 366 millones de diabéticos. Estas cifras continuarán incrementándose siempre
que se mantenga o incremente la prevalencia de obesidad (Wild y col, 2004).
1.2- El tejido adiposo.
Tradicionalmente, el tejido adiposo había sido considerado como un tejido
pasivo, destinado a ser exclusivamente un almacén energético. Sin embargo, en el año
1987 se identificó como uno de los principales tejidos implicados en el metabolismo de
hormonas esteroideas (Siiteri PK, 1987) y en la producción y secreción de adipsina, un
factor cuya expresión está marcadamente disminuida en situación de obesidad de
roedores (Flier JS y col, 1987).
Años más tarde, en 1994 la identificación y caracterización de la leptina, estableció al
tejido adiposo como un autentico órgano endocrino (Zhang Y y col., 1994). En los
últimos años, se ha confirmado que el tejido adiposo secreta numerosos péptidos
bioactivos y proteínas, llamadas colectivamente adipoquinas (Kershaw EE y col., 2004;
Guerre-Millo M.J, 2002), que pueden actuar tanto a nivel local (autocrino/paracrino) y
sistémico (endocrino) (Kershaw EE y col., 2004), como a nivel del sistema nervioso
central (Ahima RS y col., 2006). Estos factores desempeñan un papel muy importante
por su influencia sobre una amplia variedad de procesos fisiológicos, la mayoría de
ellos relacionados con la homeostasis de la glucosa y la regulación del balance
energético. Algunas adipoquinas como la leptina y la resistina, intervienen junto con la
insulina, en el control hipotalámico de la homeostasis de la glucosa y de la sensibilidad
a la insulina del organismo.
El preocupante aumento de la obesidad y las complicaciones derivadas de ésta,
como la diabetes mellitus y la enfermedad cardiovascular, ha incrementado
notablemente la necesidad de profundizar en el estudio del tejido adiposo, su
metabolismo y las consecuencias de la alteración de su actividad metabólica,
endocrina e inmunológica (Bays y col, 2008).

Introducción
4
En mamíferos, existen dos tipos de tejido adiposo: el tejido adiposo blanco
(TAB) y el tejido adiposo marrón (TAM) (Cinti, 2001). Ambos tienen capacidad de
metabolizar y almacenar lípidos, pero presentan claras diferencias en cuanto a su
morfología, distribución, expresión génica, características del proteoma así como de su
función (Pulido y col, 2012). El tejido adiposo blanco es el órgano específico que
almacena la energía sobrante en forma de grasa; mientras que el tejido adiposo
marrón, tiene una función fisiológicamente opuesta: permite la disipación de energía
en forma de calor. Nuestra investigación se ha centrado en el estudio del TAB, por lo
tanto, dirigiremos nuestra atención hacia la descripción del mismo.
1.2.1- El tejido adiposo blanco.
En mamíferos, el TAB se encuentra extensamente distribuido en el organismo,
principalmente a escala dérmica, subcutánea, mediastínica, perigonadal, perirrenal, y
retroperitoneal (Cinti, 2001). Una vez que el tejido adiposo está completamente
formado, los adipocitos representan entre uno y dos tercios del mismo. El resto del
tejido adiposo está constituido por células sanguíneas, células endoteliales, pericitos, y
precursores de adipocitos con distintos grados de diferenciación, aunque también
pueden encontrarse preadipocitos (células intersticiales o vacías de lípidos) y células
mesenquimales, probablemente diferenciadas (las cuales poseen pequeñas gotas de
lípidos) (Hauner y col., 1989). Los adipocitos que son las células principales de este
tejido provienen de células mesenquimales indiferenciadas. En su origen presentan
pequeñas inclusiones lipídicas que al hacerse mayores y más numerosas, confluyen en
una única gota lipídica que ocupa casi todo el citoplasma.
Como se ha mencionado, el TAB es el mayor reservorio de energía, de
componentes de membrana y probablemente de moléculas señalizadoras de
naturaleza lipídica del organismo. Participa en el control de la homeostasis lipídica,
almacenando la energía sobrante en forma de triacilglicéridos y liberando ácidos
grasos libres y glicerol cuando el gasto energético excede la ingesta de energía. Todo
ello está regulado por los sistemas nervioso y endocrino.

Introducción
5
La liberación de ácidos grasos no esterificados a la circulación sanguínea en
momentos de demanda energética, continúa siendo la principal función del tejido
adiposo y la forma en que se regula la movilización de los lípidos almacenados en la
gota lipídica es un tema difícil de estudiar, que requiere de mucha investigación por la
estrecha relación que existe entre los niveles circulantes de ácidos grasos y la diabetes
tipo 2 (Birnbaum MJ, 2003).
1.3- Fisiología del tejido adiposo.
Cuando se incrementa la ingesta alimentaria y/o disminuye el gasto de energía,
el exceso de ésta se deposita de manera eficiente en el tejido adiposo en forma de
triglicéridos neutros. Sin embargo, cuando la alimentación es escasa y/o se
incrementan los requerimientos energéticos, las reservas de lípidos son liberadas para
proporcionar combustible energético en forma de ácidos grasos y de glicerol para la
síntesis de glucosa por otros tejidos.
Los triglicéridos provenientes de la dieta (exógenos) ingresan a la circulación
plasmática desde la linfa en la forma de quilomicrones. Por su parte, el hígado sintetiza
y secreta la lipoproteína de muy baja densidad (VLDL), la cual transporta los
triglicéridos endógenos sintetizados desde el hígado hasta los tejidos extrahepáticos.
1.3.1- Esterificación de ácidos grasos en el tejido adiposo.
La enzima lipoproteína lipasa (LPL) es una enzima multifuncional, que juega un
papel clave en la distribución de los ácidos grasos de los triglicéridos de las
lipoproteínas plasmáticas hacia los tejidos periféricos (Wang y col., 2009).
Presente en el endotelio capilar de los tejidos extrahepáticos, entre ellos el
tejido adiposo blanco, cataliza la hidrólisis de los triglicéridos de las lipoproteínas ricas
en triglicéridos (VLDL y quilomicrones). Estas lipoproteínas se unen a la enzima a través
de la apolipoproteína CII (Apo CII) y como resultado de la actividad de la LPL se libera
progresivamente ácidos grasos libres (AGL) y glicerol. Los AGL pueden difundir a través

Introducción
6
de la membrana plasmática o entrar a la célula adiposa a través de transportadores del
tipo CD36 y moverse al interior de la misma unidos a la proteína aP2. Luego, por acción
de la acetil-CoA sintasa son transformados en el acil derivado, acil-CoA. Los acil-CoA
son principalmente reesterificados con moléculas de glicerol-3P y almacenados
nuevamente como triglicéridos, mientras que el glicerol queda en la sangre y es
captado principalmente por las células hepáticas. En estas condiciones, los ácidos
grasos que no entran a los tejidos, se unen a la albúmina para su circulación por el
organismo.
Ahora bien, la captura de AGL, su activación y su esterificación al glicerol-3P
para formar TAG en el tejido adiposo, es un proceso que requiere en paralelo de la
captura de glucosa estimulada por la insulina y su transformación en glicerol-3P. En el
estado basal, cuando la glucemia es baja, la glucosa entra al adipocito a través del
transportador de membrana GLUT1, sin embargo, en situación de elevada glucemia y
en respuesta a la insulina, la glucosa es transportada preferentemente por el
transportador de membrana GLUT4. Una vez en el citoplasma, puede ser transformada
en dihidroxiacetona-P, la cual originará la molécula de glicerol-3P.
Una fracción de la glucosa capturada es metabolizada hasta piruvato. El
piruvato puede formar lactato en el citosol, o ingresar a la mitocondria y por
descarboxilación oxidativa irreversible (a través del complejo de la piruvato
deshidrogenasa – PDHc) se transforma en acetil-CoA. Los átomos de carbono del
acetil-CoA pueden sufrir una oxidación completa a CO2, con la consecuente liberación
de energía y formación de ATP.
En el tejido adiposo funcional, un exceso de glucosa estimula la síntesis de novo
de ácidos grasos, esto implica la salida de acetil-CoA de la mitocondria. La forma de
extraer acetato de la mitocondria es en forma de citrato, el producto de la
condensación de acetil-CoA y oxalacetato. En el citosol, el citrato es desdoblado a
oxalacetato y acetil-CoA. El acetil-CoA es transformado a malonil-CoA por carboxilación
irreversible catalizada por la acetil-CoA carboxilasa (ACC). Luego, el malonil-CoA sufre
un proceso de elongación catalizado por el complejo de la sintetasa de ácidos grasos
(FAS) para formar acil-CoA. A partir de este y de glicerol-3-P se sintetizan triglicéridos
que pasan a formar parte del reservorio de triglicéridos del tejido. En esta vía

Introducción
7
metabólica intervienen las enzimas glicerol-3-P aciltransferasa, ácido lisofosfatídico acil
transferasa y diacil-glicerol acil transferasa, esta última enzima es clave en el control de
este proceso (Proscura e Ignatieva, 2002).
La enzima LPL juega un papel fundamental en el almacenamiento de AG y de
colesterol en los adipocitos en forma de TAG y ésteres de colesterol que son lípidos
neutros. La esterificación dependerá del suministro de glicerol-3P generado a partir de
la glucolisis y de la captura de los AG. La entrada de AG al tejido adiposo depende del
gradiente de concentración. De modo que cuando aumenta la velocidad de
esterificación, aumenta la entrada de AG a la célula y la hidrólisis de los TG de las
lipoproteínas, catalizada por la LPL. Estos procesos están favorecidos en respuesta a la
insulina.
1.3.2- La Gota Lipídica.
La síntesis de la mayoría de los lípidos neutros como los TAG y los ésteres de
colesterol se realiza en el retículo endoplásmico y rápidamente estos lípidos se
depositan en un tipo especial de organelo llamado gota lipídica, presente en todas las
células (eucariotas) o en las partículas de lipoproteínas en células especializadas como
los hepatocitos y cardiomiocitos. Se piensa que la gota lipídica se forma a partir del
retículo endoplásmico por un mecanismo que aún no está descrito. Debido a la
dificultad que comporta el trabajo con lípidos, los estudios relacionados con los
mecanismos que modulan la actividad de la gota lipídica son escasos, sin embargo
tienen gran repercusión debido a su relación con la obesidad, la diabetes, el cáncer y la
neurodegeneración (Zechner y col, 2012).
Actualmente se acepta que la síntesis de lípidos neutros es suficiente para crear
una película que los cubre y concentra en una gota lipídica, a esta película se van
añadiendo fosfolípidos tomados a partir de la membrana del retículo endoplásmico
hasta formar una verdadera cubierta. También se propone la intervención necesaria de
las aciltransferasas en el proceso de formación, definición y orientación de la gota
lipídica en la membrana del retículo endoplásmico (Sturley y Hussain, 2012).

Introducción
8
1.3.3- Lipólisis.
En los mamíferos, la adaptación exitosa al estado de ayuno y de inanición
depende en gran medida de la movilización regulada de los ácidos grasos almacenados
en forma de triglicéridos en la gota lipídica del tejido adiposo blanco, proceso conocido
como lipólisis. Por lo tanto se define la lipolisis como la parte catabólica del ciclo de los
ácidos grasos. La regulación de la lipolisis es compleja y depende de las necesidades de
energía, de los niveles circulantes de hormonas, de la modificación covalente de las
enzimas lipolíticas y de la compartimentación subcelular de estas enzimas. Las
alteraciones de los mecanismos de regulación de la lipolisis tienen gran impacto en la
homeostasis de energía y la señalización celular (Birnbaum MJ, 2003; Zechner y col,
2012).
Los adipocitos contienen tres enzimas responsables de escindir los triglicéridos
en glicerol y ácidos grasos, la triglicérido lipasa (ATGL), la lipasa sensible a hormonas
(HSL) y la monoglicérido lipasa (MGL)). El primer paso en la degradación de los
triglicéridos está catalizado por la ATGL, que convierte los TAG en DAG. La HSL es
responsible de la hidrólisis de los DAG a MAG y la MGL de la hidrólisis de los MAG. En
el tejido adiposo la lipólisis se produce fundamentalmente por la acción de las enzimas
ATGL y HSL (Zechner y col, 2012).
Los ácidos grasos liberados pueden abandonar la célula y ser transportados por
la sangre unidos a la albúmina para ser utilizados por tejidos no adiposos (hígado,
músculo esquelético, cardiaco, etc) oxidándose o reesterificándose según las
condiciones nutricionales (Figura 1). Por otra parte, el glicerol generado tras la
degradación metabólica de los triglicéridos es transportado a través de la membrana
plasmática por medio, fundamentalmente, del canal de glicerol acuoporina 7 (AQP7).
(MacDougald y Burant, 2005).
La ATGL juega un papel fundamental en la regulación de la lipólisis basal. Se
conoce que tanto los agonistas de los receptores nucleares PPAR, el ayuno y los
glucocorticoides aumentan la expresión del gen de ATGL, mientras que la alimentación

Introducción
9
y la insulina la disminuyen. A diferencia de la HSL, los b-adrenérgicos regulan su
actividad de forma indirecta, a través del reclutamiento del coactivador CGI-58
(Zechner y col, 2012).
Sin embargo, la regulación de la actividad de la HSL depende fuertemente, de
los niveles intracelulares de cAMP y la actividad de la enzima PKA. En condiciones de
elevada demanda energética, la activación de los receptores β adrenérgicos en la
superficie de los adipocitos y de la proteína G estimulatoria (Gs) lleva a la generación
de AMPc, por activación de la enzima de membrana adenilil ciclasa. El AMPc activa la
proteína quinasa A (PKA), una serina-treonina quinasa que activa mediante
fosforilaciones de diferentes residuos de serina a la HSL. Al contrario, la estimulación
del receptor α2-adrenérgico promueve la inhibición de la adenilil ciclasa por medio de
la proteína G inhibitoria (Gi), reduciendo el contenido intracelular de AMPc e
inhibiendo la lipólisis (Lafontan y Berlan, 1995).
La HSL fosforilada y activa se mueve desde el citosol hacia la superficie de la
gota lipidica de la célula adiposa. La fosforilación de proteínas de la familia de las
perilipinas localizadas en la superficie de la gota lipidica, es también necesaria antes de
que la HSL pueda catalizar la hidrólisis de los triglicéridos. Las perilipinas no
fosforiladas crean una barrera entre la HSL y los lípidos, que evita la lipólisis, mientras
que la fosforilación de las perilipinas por la PKA permite a la HSL acceder a la superficie
de la gota lipidica. La acción de la HSL sobre los triglicéridos presenta especificidad por
los ésteres unidos en posición 1 y 3 del glicerol (Yeaman, 1990). En la regulación
postraduccional de la HSL intervienen también otras enzimas entre las que se
encuentra la AMPK (Zechner y col, 2012).
La hidrólisis de los monoglicéridos remanentes para dar glicerol y un ácido
graso, ocurre por la acción de la monoglicéridolipasa (MGL), que no se encuentra bajo
control hormonal y cuya abundancia en la célula es suficiente para evitar la
acumulación de productos intermediarios de la lipólisis (Horowitz, 2003).

Entre las hormonas que favorecen la velocidad de lipólisis de los depósitos de
triglicéridos se encuentran: adrenalina, noradrenalina, glucagón,
corticotrófica (ACTH), hormona melanocito estimulante (MSH), hormona estimulante
del tiroides (TSH). La insulina es la única hormona que antagoniza con la acción de las
hormonas lipolíticas. La insulina inhibe la lipólisis a nivel de la adenilil c
inhibiendo la formación de cAMP y a nivel de la fosfodiesterasa (PDE) estimulando la
degradación del cAMP, esto se realiza a través del mediador de efectos metabólicos
dependientes de la insulina, la fosfoinositol
fosforilación a la PDE (Langin y col., 1996).
Tradicionalmente, se ha utilizado el isoproterenol en los estudios
vivo de lipolisis del tejido adiposo. El isoproterenol es un análogo sintético de la
adrenalina (Figura 1) y actúa vía receptores
metabólicos su función viene a ser la misma que la producida por la adrenalina. Como
se ha mencionado anteriormente, la adrenalina, es una catecolamina, y ejerce su
función metabólica modificando los niveles intracelular
PKA, y por consiguiente la de la HSL.
Figura 1. Estructura del Isoproterenol.
Cuando se comparan sujetos obesos y no obesos se observa en los obesos una
disminución de la lipolisis mediada por catecolaminas y de la expr
que se plantea que la HSL es la principal enzima responsable de la lipolisis mediada por
estas hormonas, mientras que la ATGL se relaciona fundamentalmente, con la lipolisis
Introducción
10
triglicéridos se encuentran: adrenalina, noradrenalina, glucagón,
hormonas lipolíticas. La insulina inhibe la lipólisis a nivel de la adenilil c
dependientes de la insulina, la fosfoinositol-3- kinasa (PI3-K), que activa por
osforilación a la PDE (Langin y col., 1996).
Tradicionalmente, se ha utilizado el isoproterenol en los estudios
de lipolisis del tejido adiposo. El isoproterenol es un análogo sintético de la
adrenalina (Figura 1) y actúa vía receptores adrenérgicos, por lo que a efectos
función metabólica modificando los niveles intracelulares de cAMP, la actividad de la
PKA, y por consiguiente la de la HSL.
Estructura del Isoproterenol.
disminución de la lipolisis mediada por catecolaminas y de la expresión de HSL, por lo
triglicéridos se encuentran: adrenalina, noradrenalina, glucagón, hormona
hormonas lipolíticas. La insulina inhibe la lipólisis a nivel de la adenilil ciclasa
K), que activa por
Tradicionalmente, se ha utilizado el isoproterenol en los estudios in vitro o ex
de lipolisis del tejido adiposo. El isoproterenol es un análogo sintético de la
adrenérgicos, por lo que a efectos
es de cAMP, la actividad de la
esión de HSL, por lo

Introducción
11
basal (Langin y col, 2005; Jocken y col, 2007). Por otra parte, la lipolisis estimulada por
catecolaminas es superior en el tejido adiposo visceral en comparación con el tejido
adiposo subcutáneo, así como la liberación de ácidos grasos libres y de glicerol a la
sangre portal, de modo que la lipolisis mediada por catecolaminas afecta directamente
al contenido de glucosa y de grasa del hígado, promoviendo el desarrollo de
dislipemias, hiperglucemia y resistencia a la insulina (Bays y col, 2008).
Dadas sus funciones, no es de sorprender que el tejido adiposo esté
exquisitamente diseñado para responder a los cambios agudos de las señales
nutricionales. En realidad, a nivel molecular y bioquímico, los adipocitos están
equipados con la maquinaria necesaria para responder a la estimulación hormonal, por
ejemplo, el adipocito es sensible a la insulina, la cual estimula la captación de glucosa y
la lipogénesis e inhibe la lipólisis y además está sujeto a la regulación adrenérgica que
estimula la lipólisis (Sethi y Vidal-Puig, 2007).
Figura 2. Metabolismo lipídico en los adipocitos. En la figura se muestran las principales vías
metabólicas de los lípidos y de la glucosa en el tejido adiposo. Además se señalan algunas
enzimas, transportadores y receptores importantes de estas vías metabólicas. AC: adenilil
ciclasa, ACS: acil-CoA sintasa, ACC: acetil-CoA carboxilasa, AGL: ácido graso libre, cAMP:
monofosfato de adenosina cíclico, AR: receptor adrenérgico, FAS: sintasa de ácidos grasos,
G3P: glicerol 3 fosfato, HSL: lipasa hormona sensible, IR: receptor de la insulina, IRS: substrato
del receptor de insulina, LPL: lipoproteína lipasa, MGL: monoglicérido lipasa, PDE:
fosfodiesterasa, PI3K: fosfatidilinositol 3- quinasa, PKA, proteína quinasa A, P: perilipina, AQP7:
acuoporina 7 (Modificado de Sethi y Vidal- Puig, 2007).

Introducción
12
1.4- El tejido adiposo como órgano endocrino.
El tejido adiposo actúa como un órgano endocrino liberador de hormonas,
produciendo numerosas sustancias, llamadas adipocitoquinas, que incluyen varias
citoquinas, hormonas y factores de crecimiento. Han sido identificados más de 100 de
estos factores secretados. A través de estas sustancias, el tejido adiposo, no solo
influye sobre la propia biología adipocitaria sino también sobre la regulación de la
homeostasis energética, la sensibilidad insulínica, el metabolismo de lípidos y
carbohidratos, el crecimiento celular, la inflamación y el desarrollo de cáncer (Havel,
2004, Bays y col, 2008).
Hoy en día se considera que el TAB es un órgano muy dinámico con funciones
pleiotrópicas. En la tabla 1 se muestran ejemplos de receptores expresados por el TAB,
mientras que en la tabla 2 se enumeran algunas adipocitoquinas expresadas y
secretadas por este tejido como: la adipsina (Cook y col, 1985), el factor de necrosis
tumoral (TNFα) (Hotamisligil y col., 1995), la leptina (Friedman, 2000), la resistina
(Steppan y col., 2001b) y la adiponectina (Hu y col., 1996; Maeda y col., 1996; Nakano y
col., 1996; Keys y col., 1972).
Algunas pueden regular funciones como la reproducción, la función
cardiovascular y la inmunidad. La secreción de estas citoquinas por el TAB está
regulada entre otros factores por el ayuno, la ingesta y la obesidad (Hamilton y col.,
1995; Hotamilligil y col., 1995; Lefebvre y col., 1998). De esta manera, el adipocito se
ha convertido en el integrador central del programa metabólico del organismo y está
completamente establecido, que la función endocrina del adipocito ejerce una
influencia directa sobre otros órganos clave, como el cerebro, el hígado o los músculos
esqueléticos.

Introducción
13
Tabla 1. Algunos ejemplos de receptores que se expresan en el TAB (Bays y col, 2008.
Revisión)
.
Receptores de membrana para hormonas Insulina (lipogénico / antilipolítico)
Glucagón (lipolítico)
GH
TSH
Receptores de hormonas nucleares y otros
receptores nucleares
Glucocorticoides
Andrógenos
Estrógenos
Hormona tiroidea
PPAR, PPAR /, PPARγ
Receptor de adipoquinas y citoquinas Leptina
Adiponectina
IL-6
TNFα
Receptores de catecolaminas β1,β2,β3 (lipolíticos)
α1,α2 (antilipolíticos)
Receptores de factores de crecimiento y
otros receptores
FGF, EGF, IGF, …
Cannabinoides, melanocortinas, NPY
Lipoproteínas

Introducción
14
Tabla 2. Algunos ejemplos de proteínas derivadas de adipocitos con funciones
endocrinas / paracrinas / autocrinas (Bays y col, 2008. Revisión).
Adipoquinas y Citoquinas Leptina
TNFα
IL-6
Proteínas relacionadas con el sistema
inmunitario
MCP-1
Proteínas implicadas en el sistema
fibrinolitico
PAI-1
Factor tisular
Proteínas del complemento y relacionadas Adipsina
Adiponectina
Lípidos y proteínas del metabolismo y
transporte de lipidos
LPL
Apolipoproteina E
Otras Resistina
A continuación haremos una breve descripción de algunas de las más
importantes adipocitoquinas secretadas por el TAB. Como la segunda parte de esta
tesis está relacionada con los efectos de la leptina, ésta será analizada con más detalle.
1.4.1- Factor de necrosis tumoral α (TNFα).
EL TNFα es una citoquina identificada inicialmente en macrófagos y linfocitos
en respuesta a un estimulo inflamatorio. Dentro del tejido adiposo, TNFα se expresa
en adipocitos y células estromales vasculares (Fain y col., 2004). Se sintetiza como una
proteína transmembrana de 26 kDa que sufre la degradación por una
metaloproteinasa que libera a la circulación la molécula soluble de TNF- α de 17 kDa
(Kriegler y col., 1988).
Los adipocitos aislados y diferenciados son capaces de producir TNF-α y aunque
el tejido adiposo está compuesto de una variedad de tipos celulares incluyendo
adipocitos, células del estroma, células del sistema inmune y células endoteliales

Introducción
15
vasculares, todas capaces de producir citoquinas, los adipocitos son la fuente
predominante de TNF-α (Ruan y col., 2003).
Aunque inicialmente se sospechó que TNF- podría estar jugando un papel
importante en la caquexia, hoy se sabe que está implicado en la patogénesis de la
obesidad y la resistencia a la insulina (Fernández-Real y Ricart, 2003; Ruan y Lodish,
2003). La expresión del TNFα de TAB está aumentada en ratones y humanos obesos y
se correlaciona positivamente con la adiposidad y la resistencia a insulina (Ruan y
Lodish, 2003; Hotamisligil y col., 1993; Hotamisligil, 2003). Sus acciones en tejido
adiposo incluyen la represión de genes involucrados en la captación y el
almacenamiento de AGL y glucosa y de genes implicados en la adipogenesis como
PPARγ y el cambio en la expresión de otras adipocitoquinas como leptina, adiponectina
e IL-6 (Ruan y col., 2002). Por otro lado, TNFα deteriora la señalización de insulina
mediante la alteración del estado de fosforilacion de IRS-1 y 2 (Hotamisligil, 2003).
Estos efectos pueden producirse de forma directa e indirectamente a través del
aumento de AGL (Ruan y Lodish, 2003). El modelo de deficiencia de TNFα en ratón
presenta mejor insulinemia, mejor tolerancia a la glucosa y protección para el
desarrollo de la obesidad y la resistencia a la insulina cuando se administra una dieta
rica en grasas (Uysal y col., 1997; Ventre y col., 1997).
1.4.2- IL-6.
La IL-6 es una citoquina proinflamatoria, de la cual se estima que un tercio de
sus valores circulantes provienen del TAB, correlacionándose con el IMC (Fruhberck y
col., 2001; Fernández-Real y Ricart, 2003). Sin embargo, la mayor parte de la IL-6
derivada del tejido adiposo proviene de las células de la fracción del estroma vascular
(Galic y col., 2010). Los valores circulantes de IL-6 están incrementados en individuos
obesos, aspecto que podría estar mediado por el TNFα, ya que se ha demostrado su
capacidad de estimular la expresión de IL-6 en adipocitos (Fruhbeck y col., 2001). En
humanos, los valores circulantes de IL-6 se han correlacionado positivamente con
resistencia a la insulina, fenómeno al cual podría contribuir, ya que la IL-6 incrementa
la concentración de FFA circulantes e inhibe la actividad de la LPL (Bastard y col.,

Introducción
16
2000). Los niveles plasmáticos de IL-6 se encuentran elevados en obesidad y RI
(Mohamed-Ali y col., 1997; Bastard y col., 2000; Vozarova y col., 2001). Según
Frühbeck y col., (2001) la leptina induce la expresión de IL-6 en los adipocitos. Por otra
parte se ha descrito que la IL-6 inhibe la producción de adiponectina (Yu y Ginsberg,
2005), adipoquina asociada al incremento de sensibilidad a la insulina. Sin embargo, el
papel de IL-6 en la resistencia a la insulin, la obesidad y la inflamación no se conoce del
todo. Otros estudios la implican tanto en procesos que promueven la inflamación
como en procesos resolutorios de la inflamación (Allen T.L. y col., 2010). Los resultados
publicados por (Sadagursky M y col., 2009) (Tabla 3) postulan que la IL-6 incrementa
las acciones de la leptina.
1.4.3- PPARγ.
Es un miembro de la familia de receptores nucleares activados por
proliferadores de peroxisomas que se expresan fundamentalmente en TA y
macrófagos. Su función es clave en la regulación transcripcional de la adipogénesis.
Agonistas de PPAR-γ como las TZDs (tiazolidinedionas), promueven la diferenciación de
los adipocitos y mejoran la sensibilidad a la insulina en modelos animales de diabetes
tipo II, así como en pacientes con diabetes tipo II (Olefsky, 2000).
Las vías de señalización mediadas por TNFα y PPAR γ son mutuamente
antagónicas. Se plantea que la activación de PPAR γ puede atenuar los efectos
metabólicos negativos de TNFα tanto “in vitro” como “in vivo” (Szalkowki y col.,
1995;Milles y col., 1997; Souza y col.,1998).
También cabe destacar que PPARγ estimula la captación de los ácidos grasos, a
través del aumento de la proteína transportadora de ácidos grasos, de la LPL, de la acil-
CoA sintasa, y la esterificación de los triglicéridos en una acción concertada con otro
factor de transcripción SREBP-1c que regula la lipogénesis para el llenado de las gotas
lipídicas (Evans y col., 2004).

Introducción
17
1.4.4- Resistina.
La resistina es una proteína de 94 aminoácidos que se describió inicialmente en
el adipocito maduro de roedores (Steppan y col., 2001b). En humanos la resistina
circulante proviene fundamentalmente de los macrófagos, células del sistema inmune.
En roedores, la resistina produce resistencia a la insulina y aumenta la producción
hepática de glucosa. Sin embargo, la contribución de la hiperresistinemia al desarrollo
de resistencia a la insulina y diabetes tipo 2, continúa siendo objeto de una gran
controversia. Según estudios iniciales, las concentraciones de resistina están
aumentadas en modelos de obesidad inducida o genética (Steppan y col., 2001a)
mientras que la neutralización de la misma empleando anticuerpos específicos contra
resistina, disminuía la hiperglucemia y mejoraba la resistencia a la insulina en estos
modelos.
En humanos las discrepancias son aún mayores, aunque se ha demostrado
correlación entre los niveles circulantes de resistina y el peso corporal, la adiposidad o
la resistencia a la insulina (Janke y col., 2002; Savage y col., 2001).
Diferentes factores afectan la síntesis de resistina en roedores, entre los que se
encuentran la edad y el estado nutricional así como la localización anatómica del tejido
adiposo. En la rata Wistar, la expresión de resistina por el tejido adiposo epididimal
disminuye con el envejecimiento. Por otra parte, la restricción calórica moderada,
disminuye la expresión de resistina por el tejido adiposo visceral así como los niveles
circulantes de esta adipoquina, solo en animales jóvenes y maduros (Fernández y col,
2009).
Con el objetivo de profundizar en las funciones de las resistinas humana y de
roedores se crearon ratones deficientes en resistina derivada del tejido adiposo, pero
que producían resistina humana de forma similar a como la producen en humanos los
macrófagos (ratones transgénicos humanizados). Cuando estos animales son
alimentados con dieta alta en grasa desarrollan rápidamente inflamación en el tejido
adiposo, a la par que aumenta la lipolisis y los niveles séricos de AGL. La inflamación
del tejido adiposo se desencadena a partir del incremento en MCP-1 dependiente de
resistina. Con el tiempo, estos animales acumulan lípidos en el músculo (incluyendo

Introducción
18
DAG) y desarrollan resistencia a la insulina en este tejido relacionada con el aumento
de la fosforilación en serina del IRS-1. Estos resultados demostraron que tanto la
resistina de roedores como la humana exacerba la inflamación del tejido adiposo y
genera resistencia a insulina en músculo esquelético (Qatanani M y col, 2009).
1.4.5- Adiponectina.
La adiponectina es una proteína de 30 kDa producida abundantemente por el
tejido adiposo que sufre numerosas modificaciones postraduccionales (Maeda y col.,
1996; Scherer y col., 1995). A diferencia de la resistina, la adiponectina disminuye la
producción hepática de glucosa. Además, la expresión de adiponectina se encuentra
disminuida en todos los procesos relacionados con estados de inflamación y resistencia
a la insulina, como en la obesidad, la diabetes mellitus y la enfermedad coronaria
(Hotta y col., 2000; Weyer y col., 2001; Adamczak y col., 2003; Kishida y col., 2003). De
modo que es la única adipoquina con efectos saludables sobre diferentes tipos de
células y tejidos, efectos que generalmente se asocian al aumento de actividad de la
enzima AMPK (Yamauchi y col, 2002).
Los niveles de adiponectina aumentan cuando la sensibilidad a la insulina
mejora, ya sea por la disminución del peso corporal o por tratamientos con drogas
sensibilizadoras de la insulina (Chandran y col., 2003; Diez e Iglesias, 2003). Los ratones
deficientes en adiponectina desarrollan de forma prematura intolerancia a la glucosa y
resistencia a la insulina inducida por dieta muestran, elevados valores de FFA séricos y
una incrementada proliferación de células del músculo liso vascular en respuesta al
daño tisular (Kubota y col., 2002; Maeda y col., 2002). Por otra parte, la
sobreexpresión de adiponectina en ratones conduce a una mejora en la sensibilidad a
la insulina, la tolerancia a la glucosa y los niveles séricos de FFA (Combs y col., 2004).
Se plantea que numerosos fármacos con efectos hipolipémicos como los ácidos
grasos omega 3, las estatinas y fibratos así como la niacina, que mejoran el pérfil
lipídico del organismo, no afectan la liberación de TNF, resistina o leptina, sin
embargo, incrementan la producción de adiponectina por el tejido adiposo (Wanders y
col, 2010).

Introducción
19
1.4.6- Leptina.
La leptina es una hormona peptídica de 16 kDa y no presenta modificaciones
post-traduccionales (Halaas y col., 1995). Esta hormona codificada por el gen ob, es
producida y secretada por los adipocitos y en menor medida se ha detectado en la
placenta, donde estimula el crecimiento y la sobrevivencia de los trofoblastos
(Masuzaki y col., 1997; Gambino y col, 2012), en la mucosa gástrica, donde potencia la
respuesta vagal aferente frente a la distensión gástrica (Bado y col., 1998; Kentish y
col, 2013) y en el músculo esquelético (Wang y col., 1998).
La secreción de leptina por los adipocitos tiene lugar en proporción directa a la
masa de tejido adiposo y al estado nutricional (Frederich y col., 1995). La síntesis y
secreción de leptina está regulada por una compleja red de señales neuroendocrinas y
endocrinas que reflejan el estado fisiológico del organismo. Los niveles circulantes de
leptina están asociados con la masa del tejido adiposo y también reflejan cambios
inmediatos en el estado nutricional ya que disminuyen, poco después del comienzo del
ayuno (Becker y col., 1995). En condiciones normales, sus niveles plasmáticos
aumentan en casos de balance energético positivo, es decir, cuando la ingesta y la
absorción de nutrientes exceden el gasto energético global. De esta forma, se
comporta como un marcador del estado de las reservas del organismo. La impresión
inicial después de su descubrimiento en 1994, fue que la leptina (del griego leptos,
delgado) era una señal dirigida al cerebro para inhibir la ingesta de alimentos y
disminuir el peso corporal (Zhang y col., 1994). Este concepto fue impulsado en parte
por la observación de que los seres humanos y roedores que carecen de leptina
funcional manifiestan un apetito exagerado y obesidad.
La leptina limita el depósito graso en el tejido adiposo protegiendo de la
lipotoxicidad (Unger, 2002; Kahn y col., 2005). Estimula la oxidación de los ácidos
grasos (Muoio y col., 1997; Minokoshi y col., 2002) y la captación de glucosa por los
músculos esqueléticos (Haque y col., 1999; Kamohara y col., 1997). Estos efectos
metabólicos de la leptina se encuentran en parte mediados por la activación del eje
hipotálamo-sistema nervioso simpático (Buettner y col., 2008; Minokoshi y col., 2002).
Muchos de estos efectos metabólicos tienen lugar demasiado rápido para ser atribuido

Introducción
20
a los cambios transcripcionales (señalización JAK-STAT) e involucran la activación de la
señalización de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) como fue descrito en el
músculo y el hígado por Kahn y col., (2005).
La leptina puede tener efectos autocrinos y paracrinos en el metabolismo del
adipocito (Fruhbeck y col., 1997): la incubación de adipocitos de ratón con leptina
estimula la lipólisis de los triglicéridos intracelulares, dicho efecto no fue observado en
ratones db/db carentes de receptores de leptina y la sobreexpresión de leptina en
adipocitos reduce la expresión de la acetil-CoA carboxilasa. La leptina también reduce
la expresión de la proteína de unión al elemento de respuesta a los esteroles 1c
(SREBP1c) en tejido adiposo, lo que contribuye a inhibir la lipogénesis en este tejido
(Yu y Ginsberg, 2005).
Aunque la leptina regula, a través del SNC, una multitud de funciones
fisiológicas como la ingesta y el balance energético (Friedman y col., 1998), la función
inmune y reproductiva (Lord y col., 1998; Hileman y col., 2000), la hematopoyesis
(Margetic y col., 2002) la homeostasis de la glucosa (Friedman y Halaas, 1998), cabe
destacar sus efectos antilipogénicos (Gallardo y col, 2007; Warne y col, 2011),
antidiabéticos tanto en diabetes tipo I como tipo II y que éstos efectos son
independientes de la regulación del peso corporal y la ingestión de alimentos (Coppari
y Bjørbæk, 2012).
La observación fundamental que permitió relacionar la leptina con los procesos
de regulación del peso corporal proviene de estudios realizados con ratones ob/ob, en
los cuales la falta de leptina funcional provoca hiperfagia, obesidad y una disminución
de la tasa metabólica. Por otra parte la administración de leptina es capaz de revertir
las alteraciones causadas por la ausencia de esta hormona (Zhang y col., 1994; Rentsch
y col., 1995; Maury y Brichard, 2010). Sin embargo, la noción de la leptina como una
hormona anti-obesidad fue puesta en duda debido a que la obesidad se asocia
típicamente con niveles altos de leptina y resistencia a la leptina (Ahima, 2008). Se
conoce que humanos obesos y diversos modelos animales de obesidad inducida y
genética (excepto el modelo ob/ob) presentan hiperleptinemia, condición indicativa de

Introducción
21
resistencia a esta hormona que se normaliza tras la pérdida de peso (Maffei y col.,
1995).
Se han propuesto varios mecanismos que intentan explicar la resistencia
central a la leptina como son los defectos en el sistema de acceso de la leptina al
sistema nervioso central dado que el transporte a través la barrera hematoencefalica
es saturable. Defectos en la expresión del receptor largo de leptina Ob-Rb en el
hipotálamo y/o de la señalización mediada por el receptor, que incluye el aumento en
niveles de SOCS-3. Defectos en los circuitos neuronales que regulan el balance
energético. Estrés crónico del retículo e inflamación a nivel de los núcleos
hipotalámicos (El Haschimi y col., 2000; Morris y Rui, 2009; Ozcan y col, 2009; Zachary
y col, 2010; Olofsson y col, 2013). No obstante, se ha propuesto utilizar el término
resistencia selectiva a la leptina cuando se analizan ciertos desórdenes metabólicos
como la obesidad y la diabetes, debido a que la resistencia no afecta por igual a todas
las células, a todos los órganos diana o a todas las vías de señalización en las que está
implicada esta hormona ( Könner y Brüning JC, 2012).
1.4.7- Transmisión de la señal de leptina.
La leptina al igual que la insulina regula el peso corporal y el metabolismo a
través de circuitos neuronales. La leptina ejerce sus acciones biológicas uniéndose a
sus receptores. El gen db, que codifica para el receptor de leptina (ObR), se aisló por
primera vez en el plexo coroideo de ratón (Tartaglia y col., 1995). Los receptores de
leptina pertenecen a la superfamilia de receptores de citoquina clase 1. El splicing
alternativo del gen db da origen a las 6 isoformas de los receptores: la forma soluble
Ob-Re, la cual carece de dominio citoplasmático; cuatro formas con dominios
citoplasmáticos cortos (Ob-Ra, Ob-Rc, Ob-Rd y Ob-Rf), y la forma Ob-Rb, la cual se
encuentra en casi todos los tejidos y podría ser la única forma capaz de transducir la
señal de la leptina al menos en el SNC (Friedman y Hass, 1998; Lago y col., 2007).
La leptina controla el balance energético y el peso corporal porque regula la
actividad neuronal en el hipotálamo, estas acciones implican fundamentalmente la vía

Introducción
22
JAK/STAT. La unión de la leptina a su receptor (Ob-Rb), conduce a la autofosforilación
de la quinasa citosólica JAK2 y a la fosforilación de STAT3 mediada por JAK2 (Figura 3).
La activación de STAT3 regula la transcripción de neuropéptidos como POMC, CART,
AgRP y NPY. Esta vía es importante para las funciones anti-obesidad de la leptina, es la
vía de regulación de la homeostasis de energía. La activación de STAT3, a su vez,
incrementa la expresión del inhibidor de la señalización por citoquinas SOCS3
(Frühbeck, 2006; Olofsson, 2013).
La leptina también actúa a través de la vía PI3K-AKT en determinados núcleos
hipotalámicos (Figura 3). Se sugiere que esta vía es la que contribuye a regular la
homeostasis de la glucosa y la sensibilidad a la insulina de todo el organismo. Así, esta
vía media las acciones antiesteatóticas de la leptina sobre el tejido adiposo inhibiendo
la lipogénesis en tejido adiposo blanco en respuesta a leptina (Bates SH y col., 2003;
Bates SH y col nature 2003; Ernst MB y col., 2009; Morris DL y col., 2009).
Figura 3. Señalización de leptina.

Introducción
23
Por otra parte, el sistema nervioso, además de ser un blanco de acción para la
leptina, constituye el medio para la transmisión de la señal de ésta a tejidos periféricos
claves en la regulación del metabolismo energético (German y col, 2011; Morton y
Schwartz MW, 2011). Sin embargo las vías neurales que soportan las acciones
indirectas de la leptina sobre los tejidos periféricos no se han descrito completamente.
1.4.8- Secreción de leptina por el TAB.
Se ha observado que la expresión y secreción de leptina por el TAB, está
modulada por numerosos factores, por ejemplo: se incrementa por la insulina, por
glucocorticoides, por el factor de necrosis tumoral α (TNF-α), estrógenos; y disminuye
con la actividad β-adrenérgica, andrógenos y agonistas del receptor activador de la
proliferación peroxisomal γ (PPAR-γ) (Vettor y col., 2005; Margetic y col., 2002).
La respuesta de la insulina a la ingesta es el principal mediador de los cambios
en la producción de leptina observadas durante el ayuno/restricción de energía y
realimentación y de la variación diurna de los niveles circulantes de leptina (Havel,
2001). Trabajos realizados en adipocitos aislados y estudios clínicos en seres humanos
apoyan la idea de que la insulina aumenta indirectamente la producción de leptina, a
través de sus efectos estimulatorios del metabolismo oxidativo de la glucosa en
adipocitos (Havel, 2004). Por su parte la leptina, a través de los circuitos del sistema
nervioso autónomo y actuando directamente sobre las células beta del páncreas,
disminuye la secreción de insulina (Covey y col, 2006).
Por el contrario, el ayuno disminuye la secreción de leptina por el tejido
adiposo. La disminución de la leptina se produce con rapidez en respuesta al ayuno y
provoca cambios profundos en el balance energético y hormonal a través del
hipotálamo. Niveles bajos de leptina inducen sobrealimentación y suprimen el gasto de
energía, la liberación de las hormonas tiroideas y reproductivas y la inmunidad. Las
adaptaciones metabólicas mediadas por los bajos niveles leptina pueden haber
evolucionado como una protección contra la carencia de alimentos, al limitar el uso de
energía y mejorar su almacenamiento (Ahima, 2008).

Introducción
24
1.5- Insulina.
La insulina es una hormona polipeptídica sintetizada y secretada por las células
β del páncreas. En los mamíferos la insulina es una de las hormonas que regula la
homeostasis de glucosa en la sangre. Los principales tejidos sobre los que la insulina
ejerce su acción son: el hígado, el musculo esquelético y cardíaco y el tejido adiposo,
además de las células alfa del páncreas y otras.
En cuanto al metabolismo energético del tejido adiposo, la insulina secretada
tras la ingesta estimula la captura de glucosa por el tejido adiposo, así como de los
ácidos grasos de los TAG a partir de los quilomicrones circulantes. El metabolismo de la
glucosa provee el esqueleto carbonado al que se unen los AG para formar los TAG. Por
otro lado, esta hormona suprime la liberación de los AG por el tejido adiposo, ya que
bloquea la activación de la lipasa sensible a hormona en dicho tejido. Del mismo modo,
la insulina bloquea en el hígado la exportación de TAG en forma de VLDL a la sangre
(Frayn KN, 2002).
1.5.1- Transmisión de la señal de la insulina.
La insulina estimula la captación, utilización y almacenamiento de
carbohidratos, lípidos y proteínas de la sangre por los tejidos periféricos, inhibiendo a
la vez el catabolismo de estas biomoléculas. La insulina ejerce sus efectos fisiológicos a
través de la unión a su receptor específico en la membrana plasmática de las células
diana. Esta unión provoca la autofosforilación del receptor de insulina, así como la
fosforilación de moléculas efectoras, interacciones proteína-proteína, proteína-lípidos
y cambios en la localización subcelular de una serie de sustratos y efectores
intracelulares que el receptor utiliza para transmitir la señal al interior celular. Un
esquema de las principales vías mediadas por la insulina se recoge en la Figura 4.
Durante la acción de la insulina la vía IR-AKT2 media los efectos sobre la
captura de glucosa, la conversión de glucosa en ácidos grasos y la síntesis de TAG. La
acción prolongada de la insulina produce resistencia a la hormona a través de la
degradación del sustrato IRS-1, de esta forma muchos inductores de resistencia a la
insulina activan quinasas del IRS-1. Entre las quinasas que fosforilan en serina al IRS-1

Introducción
25
se encuentra mTOR. Muchos estudios indican que mTOR integra las señales de
factores de crecimiento, hormonas, nutrientes y estado energético celular para regular
el crecimiento y la sobrevivencia de la célula. La activación crónica de la vía de mTOR,
ya sea por nutrientes o por tratamiento prolongado con insulina produce resistencia a
la insulina por degradación de IRS-1.
Figura 4. Esquema del mecanismo de transmisión de la señal de la insulina (Saltiel AR y col.,
2001).
1.6- Interacción leptina-insulina.
La leptina, junto con la insulina, forma parte de las señales que regulan, a
través del SNC, la ingesta y la oxidación tanto de los glúcidos como de las grasas en los
diferentes tejidos periféricos, existiendo mecanismos fisiológicos que regulan los
niveles de ambas hormonas. En este sentido, se ha propuesto la existencia de un eje
adipo-insular, por el cual la insulina estimula la expresión de la leptina en el TAB, la
cual, a su vez disminuye los niveles y la secreción de insulina por el páncreas, así como
los niveles de glucosa plasmáticos en el estado post-absortivo en ratas normales, lo
cual se traduce en un aumento de la sensibilidad a insulina (Kieffer TJ y col., 2000).

Introducción
26
El efecto de la leptina sobre la sensibilidad a insulina es específico de tejido, ya
que aunque en sóleo, diafragma, corazón y tejido adiposo marrón se produce un
incremento del transporte de glucosa estimulado por insulina, en el tejido adiposo
blanco el efecto de la leptina es el contrario (Cusin I y col., 1998). En algunos tejidos
ambas hormonas cooperan, en otros actúan de manera independiente y en otros
pueden tener efectos antagónicos. Las vías de señalización de leptina e insulina están
interconectadas a varios niveles como son el IR, los IRS, la PI3-K, la MAPK, el STAT-3, la
fosforilasa a, la PTP1B, la PD3B, SOCS-3. (Kraus D y col., 2002; Szanto I y col., 2000; Kim
JB y col., 1998; Kim YB y col., 2000; Aiston S y col., 1999; Zobolotny J y col., 2002; Zhao
AZ y col., 2002; Krebs DL y col., 2003).
La asociación entre leptina e insulina se ha estudiado también en modelos
animales que presentan obesidad. En estos animales se ha observado que los niveles
de leptina en sangre no son los responsables de la inducción de la resistencia a la
insulina, sino que la causa más probable sería la disminución de la señalización de
leptina a nivel central (Lin J y col., 2003), por lo que la resistencia a leptina también
conduce a un estado de resistencia central a insulina. En la mayoría de los casos de
obesidad humana y en roedores concurren tanto la resistencia a insulina como la
resistencia a leptina.
1.7- Control hipotalámico de la homeostasis de la glucosa y de la sensibilidad a la
insulina.
Numerosas evidencias indican que el SNC es un regulador clave de la
homeostasis de la glucosa y que la señalización de insulina y de leptina en el
hipotálamo juega un papel fundamental en el control a través del SNA, de la
homeostasis de glucosa y en el desarrollo de resistencia a insulina. Por esta razón los
estudios acerca de la contribución de la leptina al metabolismo energético han
adquirido gran importancia en las investigaciones sobre resistencia a insulina y
diabetes mellitus tipo 2. El hipotálamo ajusta el tono del SNA a las condiciones
externas, a las necesidades de energía, modulando el funcionamiento del páncreas, el
hígado, el tejido adiposo, el sistema cardiopulmonar etc. Estudios encaminados a
dilucidar las vías de regulación por el SNA del TAB visceral indican que áreas

Introducción
27
hipotalámicas como el arcuato envían proyecciones simpáticas sobre el TAB y que esta
inervación simpática es la iniciadora de la lipólisis, proceso regulado en parte por el
sistema de melanocortinas (Bates SH y col., 2005; Marino JS y col., 2011).
Además, la leptina tiene acciones en otras áreas cerebrales como la corteza y zonas
límbicas y en los tejidos periféricos (células α y β del páncreas, hígado y células del
sistema inmunológico), sin embargo, la acción de la leptina en el cerebro y, en
particular, el hipotálamo es la mejor caracterizada en lo que respecta a la homeostasis
de la energía (Badman y Flier, 2007; Morris y col., 2009; Olofsson y col., 2013).
1.8- El envejecimiento. Deterioro del organismo, y pérdida de funcionalidad.
El ciclo de la vida, desde el mismo momento de la concepción de cualquier
organismo vivo, se caracteriza por el desarrollo de una serie de capacidades y
funciones hasta alcanzar la madurez (definida esta como la adquisición de la capacidad
reproductiva) para posteriormente, sufrir una degradación progresiva de la capacidad
fisiológica y funcional que conduce al incremento de la susceptibilidad y vulnerabilidad
a la enfermedad y culmina con la muerte del organismo.
En 1991, Fairwather definió “envejecer” como el conjunto de procesos que
contribuyen a incrementar progresivamente la tasa de mortalidad específica para la
edad en una población que vive en condiciones ideales para la supervivencia. No tiene
una causalidad única y no es ni una enfermedad, ni un error evolutivo.
No existe una teoría global que explique el concepto de envejecimiento, puesto
que el desarrollo del mismo varía en función de los diferentes organismos, tejidos y
células, y se manifiesta a todos los niveles de organización de los mismos. En
mamíferos, existen numerosas evidencias que sugieren, al menos, la existencia de
cinco características comunes al envejecimiento, sea cual sea el nivel de organización.
(Bruce y Troen, 2003).
Así con la edad se producen:
1. Incremento de la mortalidad a partir de la madurez.
2. Cambios en la composición bioquímica de los tejidos.

Introducción
28
3. Disminución progresiva de la capacidad fisiológica.
4. Reducción de la habilidad de adaptación a los estimulos medioambientales.
5. Incremento de la susceptibilidad y vulnerabilidad a contraer enfermedades.
Los mecanismos moleculares sobre el desarrollo del envejecimiento aun no han
sido completamente esclarecidos y existe una gran controversia sobre los mismos
debido a la complejidad del problema en cuestión. Para los investigadores del campo,
el desarrollo del envejecimiento continua siendo un enigma, A pesar de esto, parece
clara la implicación de, al menos, cuatro grandes procesos fisiológicos en el desarrollo
del envejecimiento de un individuo: capacidad metabólica, respuesta a situaciones de
estrés, desregulación genética, y estabilidad génica. (Jazwinski, 2000). A partir de la
finalización del proceso de desarrollo del individuo, la inestabilidad génica influenciada
por el efecto de los factores ambientales, tanto intrínsecos como extrínsecos, induciría
una progresiva degradación de las funciones celulares debido a una acumulación de
errores que no pueden ser subsanados por los mecanismos de reparación,
disminuyendo la viabilidad y, en ultimo termino, ocasionando la muerte del individuo
(Jazwinski, 1996).
A lo largo de la historia se han desarrollado múltiples teorías para tratar de
explicar el por qué del envejecimiento, pero ninguna de ellas ha sido, hasta la
actualidad, capaz de dar respuesta a todas las preguntas formuladas. El estrés
oxidativo, la glicosilación de proteínas, y la pérdida de telómeros de los cromosomas,
son fenómenos implicados en la alteración y degeneración de las funciones vitales de
cualquier organismo (Leslie, 2001), pero la teoría más sorprendente es la que sugiere
la existencia de un sistema conservado de regulación del ciclo vital.
Estudios en los organismos comúnmente utilizados como modelos de
envejecimiento (C.elegance, D.melanogaster, S.cerevisae, M.musculus), han
comenzado a descubrir importantes genes y vías de señalización que parecen regular
el ritmo del envejecimiento, y que han sido notablemente conservados durante la
evolución. Estos estudios presentan la ventaja de poder utilizar aproximaciones
genéticas para la búsqueda directa de mutaciones que modifican el ciclo vital,
haciendo posible la identificación de los mecanismos implicados de una manera

Introducción
29
independiente a cualquier otro modelo preconcebido sobre el envejecimiento
(revisión de Guarante y Kenyon, 2000).
Además de la expresión o represión de genes, el sistema de regulación del
envejecimiento incluye el control de los estados denominados “inactivos”, en los
cuales el organismo pospone su reproducción en respuesta a condiciones
medioambientales adversas. Un aspecto muy llamativo en este sentido ha sido
descubrir que las vías de señalización celular medadas por insulina y el IGF-1 están
directamente implicadas en la regulación del envejecimiento en C.elegans,
D.melanogaster y S.cerevisae (Kenyon, 2001), y cabe la posibilidad de que este sistema
también sea operativo en mamíferos (Clancy y col., 2001; Tatar y col., 2001).
Desde el punto de vista de esta ultima teoría, el envejecimiento sería un
proceso metabólico más y, por tanto, puede ser regulado. En esta línea, algunos
científicos están pensando en el envejecimiento como una enfermedad, por lo que
están buscando su cura, y mientras esto sucede, la población sigue envejeciendo día a
día, y en 2050 se estima que al menos 1 de cada 5 personas superará los 60 años de
edad, por lo que las enfermedades asociadas con el envejecimiento cobraran si cabe
una mayor importancia en la investigación.
1.9- Restricción calórica. Efectos beneficiosos de la dieta.
Existen numerosos estudios sobre la restricción calórica (RC) y sus efectos.
Desde hace más de 70 años se sabe que la RC retarda el envejecimiento y por lo tanto,
incrementa el tiempo de vida (McCay et al., 1935). La RC se refiere a un régimen
dietario entre un 30-50% menor en calorías que el consumo de un animal control, sin
llegar a desnutrición. Dietas bajas en calorías han provocado un aumento en la
esperanza de vida media, así como una disminución de las enfermedades propias del
envejecimiento en una amplia variedad de organismos entre los que se incluyen las
levaduras (Saccharomyces cerevisiae) (Cortés-Rojo y col., 2007), el gusano
(Caenorhabditis elegans), la mosca (Drosophila melanogaster), roedores (ratas y
ratones) y primates (Weindruch, 1996; Koubova y Guarente,2003).

Introducción
30
Se han propuesto diversos mecanismos para explicar este fenómeno: el retardo
del crecimiento, la disminución de la apoptosis, la reducción del daño oxidativo, la
alteración en la utilización de la glucosa, cambios en la expresión de genes, la mejora
de la respuesta al estrés. Ciertas evidencias sugieren que la RC ocasiona importantes
respuestas metabólicas en el proceso de envejecimiento por medio de sistemas tanto
intracelulares como extracelulares de transducción de señales que afectan a
numerosos órganos y sistemas fisiológicos. En algunos tejidos la RC produce un
incremento del metabolismo, de la resistencia al daño oxidativo y al estrés térmico
(Sohal, 2002).
La RC ocasiona, a nivel general, una disminución del peso corporal con respecto
a los animales control. En cuanto a nivel genético, la RC eleva los niveles de SIRT1
(sirtuinas) en mamíferos y estos niveles se reducen por la insulina. Las sirtuinas
producen cambios metabólicos que afectan a las células beta del páncreas y de esta
forma se inhibe la síntesis y liberación de insulina al plasma. En el sistema neuro-
endocrino la SIRT1 inhibe la síntesis y liberación de la hormona de crecimiento (GH)
por la hipófisis y del factor de crecimiento de insulina-1 (IGF-1), finalmente a nivel del
tejido adiposo blanco se inhibe la acción de la leptina y se incrementa la acción de la
adiponectina (Bordone y Guarente, 2005).
Utilizando roedores como modelos de RC, modelos genéticos de ratones y
ratones knockout para el receptor IGF-1 en el tejido adiposo (fat-specific insulin
receptor knockout mice, FIRKO) se ha visto que la reducción de los niveles plasmáticos
de insulina y/o IGF-1 o la reducción de la señalización insulina/IGF-1 se correlaciona
con incrementos en la longevidad y el retraso del envejecimiento (Richardson et al.,
2004).

Hipótesis y objetivos
31
1.10- Hipótesis y objetivos.
Conociendo que el envejecimiento en la rata Wistar no produce alteraciones de la
glucemia y la insulinemia en ayunas. Sin embargo, estos animales incrementan la
adiposidad con la edad, presentan esteatosis hepática y dislipemia en ayunas y
exhiben alteraciones de la sensibilidad global a la insulina y central a la leptina y la
insulina, se decidió profundizar en este trabajo, en aspectos relacionados con las
alteraciones de la funcionalidad del tejido adiposo visceral en este modelo de
envejecimiento, teniendo en cuenta que los mecanismos específicos que generan
dislipemias, resistencia a la insulina y diabetes no están del todo esclarecidos.
Para ello nos planteamos la siguiente hipótesis de trabajo.
Con el envejecimiento aumenta de forma moderada la masa de tejido adiposo blanco
visceral y se modifican sus actividades metabólicas para ajustarse a las condiciones
fisiológicas del organismo envejecido. Las alteraciones de la funcionalidad estarán
relacionadas con cambios en la actividad lipogénica y lipolítica del tejido, cambios en la
composición y metabolismo de la gota lipídica y disminución del control
neuroendocrino del metabolismo adipocitario. Que la señalización hipotalámica de la
leptina tiene una fuerte implicación en el sistema neuroendocrino de control del
metabolismo adipocitario, pudiendo ser la resistencia a la leptina y la insulina
adaptaciones metabólicas, que propician un incremento moderado de la masa adiposa
y como consecuencia de ello se depositan lípidos en otros tejidos y el estado de
hiperlipemia es permanente, en ayunas y en estado postprandial. Que a pesar de estas
alteraciones los animales envejecidos mantienen la homeostasis de glucosa y el estado
prediabético. Que la restricción nutricional sigue siendo un buen recurso para frenar
los desórdenes del metabolismo energético.

Hipótesis y objetivos
32
Para responder a nuestra hipótesis de trabajo desarrollamos el estudio del estado de
funcionalidad del tejido adiposo visceral se desarrolló en seis direcciones:
1.- Desarrollar un ensayo de infusión oral de grasa y analizar los cambios en la
respuesta de la rata Wistar a la administración de un bolo de grasa. Efectos de la edad
y la restricción nutricional.
2.- Estudiar la capacidad del tejido adiposo visceral de absorber la grasa circulante y
almacenarla en forma de TAG en estado de ayunas y en estado de alimentación:
Capacidad lipogénica y de síntesis de TAG. Efectos de la edad y la restricción
nutricional.
3.- Estudiar la capacidad del tejido adiposo visceral de hidrolizar los TAG y liberar NEFA
y glicerol: estudio de la lipolisis en estado de alta demanda energética (ayuno
prolongado) y en respuesta a agonistas de beta-adrenérgicos. Efectos de la edad y la
restricción nutricional.
4.- Analizar la capacidad de respuesta del tejido adiposo a la insulina: Estudio de los
efectos anti-lipolíticos de la insulina dependiendo del estado de ayuno o de
alimentación. Efectos de la edad y la restricción nutricional.
5.- Estudiar los niveles de proteínas relacionadas con los procesos que tienen lugar en
la superficie de la gota lipídica, la formación de la gota lipídica y la hidrólisis de los
lípidos almacenados en la gota lipídica en los estados de ayuno y de alimentación.
6.- Demostrar en animales jóvenes, la capacidad de la leptina de regular a través del
Sistema Nervioso Autónomo, el metabolismo de los lípidos del tejido adiposo visceral y
la sensibilidad global a la insulina.

Materiales y métodos
33
2- MATERIALES Y MÉTODOS.
2.1- Materiales.
Todos los reactivos y productos utilizados en este trabajo son de grado analítico
y han sido suministrados por distintas casas comerciales. Se han empleado además
otros productos más específicos cuya procedencia se indica en el texto.
2.2- Modelos de experimentación.
Como modelo de experimentación se utilizaron ratas macho de la raza Wistar
albinas procedentes del Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa” de la
Universidad Autónoma de Madrid (CBMSO-UAM); los animales fueron mantenidos con
ciclos de luz/oscuridad de 12/12 horas, una humedad relativa entorno al 50%, una
temperatura de 20-25ºC, y acceso libre a la comida y al agua.
Los procedimientos experimentales realizados estaban aprobados por el comité
de bioética de la UCLM, y el tratamiento de los animales se llevó a cabo de acuerdo
con las leyes de la Unión Europea y con las pautas dictadas por el Instituto Nacional de
la Salud, con respecto al uso de animales de experimentación reduciendo al mínimo
tanto el número de animales como el sufrimiento de los mismos.
En este estudio se han utilizado diferentes condiciones experimentales, las
cuales se proceden a desarrollar a continuación.
2.2.1- Modelo animal de envejecimiento.
En este trabajo continuamos con el estudio del envejecimiento en la rata
Wistar. Estos estudios se realizan en ratas machos de 3, 8 y 24 meses de edad. Se
considera que el control del experimento es la rata madura de 3 meses de edad (3m), y
para el análisis de los cambios asociados a la edad se emplean animales de 8 (8m) y 24
meses (24m). Esta raza se ha elegido como modelo porque su proceso de
envejecimiento presenta ciertas características similares a las del humano. Con la edad
aumenta la adiposidad y el peso corporal, aunque se mantienen los niveles de
normoglucosa y normoinsulinemia en ayunas (Escriva y col, 1997; Escriva y col, 2007).

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Se sabe que los animales de 8 meses de edad tienen resistencia a insulina en tejido
adiposo pero no en músculo esquelético, mientras que las ratas de 24 meses de edad
muestran resistencia a la insulina del tejido adiposo y ciertos músculos esqueléticos y
un mayor nivel de resistencia global a la hormona (Escriva y col, 2007). Además se ha
demostrado que las ratas de 8 y 24 meses de edad son hiperleptinémicas y presentan
diferente grado de resistencia a las acciones hipotalámicas de la leptina y la insulina.
(Carrascosa y col, 2011).
Figura 5. Ratas albinas Wistar de 3 y 24 meses de edad alimentadas ad libitum.
2.2.2- Modelo animal de restricción calórica.
Durante más de 20 años, se ha empleado la restricción calorica en este modelo
de envejecimiento, para determinar si los cambios observados en la sensibilidad a
insulina o leptina con la edad son consecuencia exclusiva de las variaciones en la
adiposidad, o si están causados por otros mecanismos asociados al envejecimiento. En
este tipo de régimen los animales en restricción calorica (FR), ingieren un 80% de las
calorias que ingieren sus congéneres de la misma edad y alimentados ad-libitum (AL)
dando como resultado una diferencia de peso entorno a un 15% inferior en la rata FR
con respecto al que tendría la rata de la misma edad alimentada ad libitum (AL). Este
tipo de restricción calórica seria equiparable a una dieta hipocalórica saludable en
humanos. Los animales sometidos a restricción calórica (denominados en este trabajo
FR, por las siglas inglesas food-restriction), poseen niveles inferiores de adiposidad
visceral que sus congeneres de la misma edad pero alimentadas ad-libitum (AL) y
similares a los de las ratas controles de 3 meses (Escriva y col, 1997; Escriva y col,
2007). La restricción se lleva a cabo en animales de 5 y 21 meses de edad durante un

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período total de tres meses hasta alcanzar las edades de 8 y 24 meses,
respectivamente. Utilizando este modelo de restricción calórica moderada se ha
comprobado que la resistencia a la insulina en la rata Wistar, puede revertirse en ratas
de 8 meses, pero no en ratas de 24 meses de edad (Escrivá y col, 2007).
2.3- Test in vivo de sobrecarga oral de lípidos.
De experimentos in vivo (sobrecarga oral de glucosa) realizados en el modelo
experimental descrito en el apartado 2.2.1.1 , se conoce que las ratas de 8 y 24 meses
de edad requieren mayor concentración de insulina para normalizar los niveles de
glucosa en sangre. El incremento en la secreción de insulina es fruto de la resistencia
periférica a la hormona que desarrollan estos animales.
En este trabajo se ha decidido realizar un test in vivo de sobrecarga oral de
lípidos. Este ensayo se llevó a cabo con la finalidad de conocer la capacidad de
respuesta de la rata Wistar a una sobrecarga oral de grasas en función de la edad y del
estado nutricional.
El test se realizó 5 grupos de ratas ayunadas 16 horas: 3m AL, 8m AL, 8m FR,
24m AL y 24 m FR. Durante el ensayo se administró oralmente un bolo de aceite de
oliva (0.1 ml/100 gr peso corporal). La sangre fue sustraída de la vena de la cola de la
rata a distintos tiempos: 0, 30, 60, 90, 120, 180, 210 y 240 minutos, y se empleó en la
determinación de los niveles de la hormona insulina y de los siguientes metabolitos:
La concentración de glucosa en sangre se determinó utilizando el analizador
Accutrend Glucose Analyser (Roche), la concentración de triglicéridos en sangre se
determinó utilizando el analizador Accutrend tryglicerides Analyser (Roche), Los TAG,
los NEFA se midieron mediante un kit específico (Wako). Mientras que los niveles de
insulina en suero se midieron mediante un ELISA específico de rata (SPI-Bio).
2.4- Ensayo Ayuno-Alimentación.
Se realizó con el objetivo de estudiar la adaptación del TAB a los estados de
ayuno-realimentación en diferentes edades. Se llevó a cabo en ratas Wistar macho de
3, 8 y 24 meses de edad alimentadas ad libitum o sometidas a restricción calórica,

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