El documento describe estudios sobre la enzima ribosa 5-fosfato isomerasa (RpiB) en Trypanosoma brucei, el parásito que causa la enfermedad del sueño africano. Se realizaron experimentos para investigar la importancia de RpiB en la viabilidad y la infectividad de la forma sanguínea de T. brucei. Los resultados mostraron que RpiB se localiza en el citoplasma y cataliza preferiblemente la conversión de ribulosa 5-fosfato a ribosa 5-fosfato. Aunque no es

1. María Alejandra Maya Roldan
Johan H. Muñoz Ríos
2015

2. INTRODUCTION

3. Pentose phosphate pathway
PPP

4. Glycolisis

5. ENZIME: RELATION
Ribulose 5
phosphate
Ribose 5
phosphateR5Pi
A
Humans
B
T. brucei
Atracttive drug
tagger

6. ENZIME
Ribose 5 phosphate isomerase (Rpi)
catalyzes the interconversion: ribulose 5
phosphate (Ru5P) ribose 5
phosphate (R5P).
Transformation from group aldose to
ketose.
Transition to the non oxidative branch of
the PPP

7. The reaction mechanism involves an initial
opening of furanose ring of R5P, followed
by the aldolase-ketose isomerization, via a
cis-enediolate high energy intermediate.

8. Trypanosoma
Trypanosomatides protozoa.
 Monophyletic group of unicellular protist
parasites.
Different species infect vertebrates
causing trypanosomiasis.

9. Trypanosoma
Transmitted by invertebrates such as
biting insects, or penetrate the skin.
Complex life cycle.
Has a variety of different ways in the
invertebrate host, and guests vertebrate
cells take a form feature called
trypomastigote

10. Trypanosoma brucei
Kingdom: Protist
Phylum: Euglenozoa
Class: Kinetoplastea
Order: Trypanosomatid
Genus: Trypanosome
Species: T. brucei

11. Trypanosoma brucei
Causes African trypanosomiasis (sleeping
sickness)
 Subspecies:
T. b. gambiense…chronic tripanosomiasis slow
start.
T. b. rhodesiense,… tripanosomiasis quick start.
T. b. brucei,… African (or nagana) animal
trypanosomiasis.

12. unusual features
• Only large mitochondria with mitochondrial DNA condensed
structure, in association with the basal body of the flagellum,
unusually constitutes the mechanism of cell cytoskeleton
organization
• Unique and remarkable cover variant surface glycoprotein (VSG) in
order to avoid the host immune system

13. Due to the large difference
between these two hosts, the
cell undergoes complex
changes to facilitate survival
in the insect gut and blood of
mammals.

14. VECTOR

15. Trypanosoma
brucei

16. OBJECTIVE
Investigate the importance
of RpiB in T. brucei bloodstream
form viability and infectivity.

17. MATERIALES Y MÉTODOS
Declaración ética
Investgación
IBMC.INEB
Parlamento
europeo
Acreditación de la
dirección veterinaria
portuguesa

18. CULTIVO
Cultivo Conjunto de
técnicas
Mantenimiento,
supervivencia,
diferenciación,
crecimiento y
función.
Preservando
sus propiedades
Fisiológicas
Químicas
Genéticas

19. Mediodecultivo
Sustrato
Nutrientes
Condiciones
abiótica
Mantenimiento,
supervivencia,
diferenciación,
crecimiento
y función.

20. T.BruceiLister247
Procíclica
F. Sangre
MEM- Pros
HMI-9
FELOMICINA

21. PCR
PCR
Amplificación directa de
un gen o fragmento de
DNA o indirecta de RNA
Enzimas
De 20-40 ciclos
Pasos: Desnaturalización,
alineamiento y síntesis

22. Se obtuvieron los genes de R5Pi DNA genómico
Producto:
* Aislación
* Purificación
* Clonación
* Secuenciación

23. DNA Recombinante
Molécula de DNA artificial que proviene de
la unión de DNA = origen.
Se emplea para la producción de
proteínas.

24. Qué se necesita:
1. DNA donador
2. DNA receptor
3. Enzimas de restricción.
4. Ligasas
UNA VEZ OBTENIDO EL DNA RECOMBINANTE
SE INSERTA EN UNA BACTERIA PARA LA
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA RECOMBINANTE

25. Ensayo enzimático
Ensayo enzimático
Actividad, inhibición y
cinética enzimática
Curva
La reacción de
equilibrio
Rapidez de formación
del producto o
desaparición del
sustrato
Hay 2 tipos
Continuos
Discontinuos

26.  Km de R5P
 Km de Ru5P
 Mecanismo de inhibición
del 4_PEH

27. Inmunofluoresencia
Inmunofluoresencia
Técnica inmunoquímica
con marcador de
fluorocromo
Utiliza reacción Ag-Ac
Puede ser de 2 tipos:
Directa
Indirecta

28. Encontrar dónde se encontraba
La R5Pi :
DAPI………DNA
Aldolasa…..Glicosoma
R5Pi………citoplasma

29. Permeabilización con
Digitonina
Digitonina
Digitalis
purpurea
Detergente
Ataca el
colesterol
Permeabiliza
las membranas
cells.

30. F.sangre
Permeabilización
con Dig.
Acceder a
contenidos
citoplasmáticos de
las cells.
Sobrenadante se
midió por W.B:
*Enolasa
*Aldolasa
*R5Pi

31. Transgénicos
También llamados OMG.
Organismo vivo creado a partir de la
manipulación de sus genes.
MEJORAR CONDICIONES

32. Técnica
Aislar
segmentos
de DNA .
Introducir
éste en el
material
hereditario
de otro.
Ejemplo

33. Creación
Cells con RNAi
Cells con
complementación
funcional
T.brucei
T.cruze

34. Northern Blot
 Reconocimiento de secuencias específicas de RNA
 ¿Cómo se realiza?
1.Aislar RNA
2.Electroforesis.
3.Fijación a medio sólido.
4. Hibridación.
5. Separación.
6. Autoradiográfia
RNA presente en la
Forma sanguínea

35. Western Blot
Identificación de proteínas.
¿Cómo se hace?
1. Electroforesis (SDS/PAGE)
2. Transferencia al filtro con Ac.
3. Identificación de proteínas
Cuantificación
proteínas
Parásitos en
sangre
Proteína
recombinante

36. RESULTS
Figura 1

37. Figura 2

38. Figura 2

39. Figura 3

40. Figura 4

41. DISCUSSION
AUTHOR CONCLUSION AGREE DISAGREE
Stern Al
Et al
TbRpiB has the ability of using bothe
R5P or Ru5P as subtrates, but with
remarkable preference for Rub5P
.
Jensen BC
Et al
The levels of TbRPIB mRNA in
logarithic phase procyclic forms
compared to bloodstream forms are
higher.
X.
Colasante C
Et al
Make a proteomic analysis that failed to
find TbRpiB enzime in purified
glycosomes.
 .
Ong HB
Et al
TbRpiB is not the fist protein reported
as dispensable under estandar
laboratory culture condictions but crucial
for parasities growth in tHe animal host.
.
 .

42. CONCLUSIONS
Is very important Identify and know the
metabolics pathways, its enzymes or
obligatory steps to use as pharmacological
targets.
To study the importance of an enzyme, we
have to make a lot of techniques to identify
its action, origin, cinetic profile, location,
concentration and the mechanism of
inhibition

43. In the study is corraborated use of RpiB as
a drug target. Consider non only the
possiblity of using it against African
sleeping sickness, but tuberculosis, a real
affliction of our enviroment.
The odds must be open to new
investigations, searching for that drug
target in multiple pathological agents.

45. para

46. BIBLIOGRAFÍA
Martinez Sanchez, Lina Maria. Biologia
molecular.7.ed.Medellin: UPB. Fac.Medicina.
Castaño, María Eugenia. Cultivos celulares.
Biogénesis, principios de la virología.